English

• 生物硫醇, 如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH), 在生命体中的许多生理学过程中发挥至关重要的作用, 并且与多种疾病的病理形成过程密切相关^[1~4].例如: Cys能够参与蛋白质结构的构建^[5], 正常细胞内Cys浓度通常为30~200 μmol/L^[6], Cys的缺乏可导致多种疾病的发生, 如生长迟缓、水肿、皮肤损伤、毛发脱色、水肿、嗜睡、肝脏损伤等^{[7, 8]}. Hcy在保持细胞稳态方面发挥重要作用^[9], 血清中正常的Hcy水平约为5~12 μmol/L, 异常的Hcy动态平衡水平与阿尔茨海默病^[10]、心血管疾病^[11]、炎症性肠病和骨质疏松症密切相关.而GSH是最丰富和最重要的生物硫醇, 正常细胞内浓度通常为1~10 mmol/L^[12~14], 已经证实GSH是一种细胞内源性凋亡调节因子和抗氧化剂, 与细胞内氧化还原活性、异生物质代谢、细胞内信号转导和基因调控相关^[15]. GSH水平异常能够增加肝损伤、牛皮癣、白细胞丢失和癌症的等疾病的患病风险^[16~22].因此, 追踪和监测生物体内的生物硫醇具有重要的生物学意义.

  荧光探针基于与待分析物即时反应的独特能力, 能够实现对待测物的高灵敏度、高选择性、高时空分辨率的原位无破坏性分析, 在监控活细胞或组织中的痕量样品方面发挥着重要作用^[20~22].目前, 已报道的生物硫醇荧光探针的反应机制主要包括迈克尔加成反应^[23~29], S—S键或Se—N键的裂解反应^[30~32], 亲核取代反应^[33], 金属络合反应^[34].

  本文设计合成了一种新的荧光探针CO-NBS (Scheme 1), 它可以在二甲基亚砜-磷酸缓冲盐溶液(DMSO-PBS, V:V＝1:1, 10 mmol/L, pH 7.4)中, 高灵敏性和高选择性地实现对Cys, Hcy或GSH的响应, 反应时间分别为70, 70, 140 s, 检出限分别为92、30、62 nmol/L.该探针以香豆素衍生物作为荧光团(CO-OH), 2, 4-二硝基苯磺酰基部分(NBS)作为荧光猝灭剂和生物硫醇的选择性识别位点, 由于荧光团部分与2, 4-二硝基苯磺酸酯部分之间的光诱导电子转移过程(PET), 探针本身几乎没有荧光.一旦硫醇与探针发生亲核取代反应, 探针的磺酸酯键断裂, 导致荧光团的释放, 伴随的橙色荧光的恢复(图 1).此外, 该探针能够对Cys、Hcy、GSH实现超快速、高选择性和高灵敏性的反应, 而不受其它生物分子(包括其他氨基酸和各种阴离子)的干扰.

  图式 1

  

  图式 1.  探针CO-NBS的合成路线图

  Scheme 1.  Synthetic route of probe CO-NBS

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  图 1

  

  图 1.  探针与生物硫醇的反应机理

  Figure 1.  Reaction mechanism between CO-NBS and biothiols

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  其次, 该探针具有低细胞毒性和良好的生物相容性, 可用于的细胞和斑马鱼中硫醇的荧光成像.

  1.   结果与讨论

  1.1   探针CO-NBS的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱研究

  首先通过紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱在DMSO-PBS (V:V＝1:1, 10 mmol/L, pH 7.4)缓冲溶液中对探针CO-NBS的光学性能进行研究.如图 2a所示, 在DMSO-PBS (V:V＝1:1, 10 mmol/L, pH 7.4)缓冲溶液中, 探针CO-NBS (10 μmol/L)在455和315 nm处有最大吸收峰, 随着Cys (10 μmol/L, 1 equiv.)的加入, 455和315 nm处的吸收峰逐渐降低, 355 nm处新的吸收峰逐渐升高.相对应地, 我们通过荧光光谱研究了探针CO-NBS对Cys、Hcy、GSH响应.在DMSO-PBS (V:V＝1:1, 10 mmol/L, pH 7.4)缓冲溶液中, 探针CO-NBS (10 μmol/L)几乎没有荧光, 向缓冲溶液中加入Cys后, 575 nm处产生新的荧光发射峰, 并且随着Cys浓度的增加荧光强度逐渐增强, 直至加入Cys (10 μmol/L, 1 equiv.)后, 体系达到饱和, 荧光强度不再增加, 较空白探针相比, 体系在575 nm处的荧光强度增加了15倍, 表明探针CO-NBS能够实现对Cys的“关-开”型检测(图 2b).同时, 利用紫外-可见滴定光谱和荧光光谱对探针CO-NBS对Hcy和GSH响应性质进行了研究, 荧光动力学研究表明探针CO-NBS能够实现对三种生物硫醇快速响应(图 2c).接下来, 我们研究了pH对探针CO-NBS识别性能的影响, 在pH 3~13的DMSO-PBS缓冲液(10 mmol/L, V/V＝1:1)中, 探针CO-NBS的荧光信号无明显变化, 表明该探针具有较高的耐酸碱性, 当加入三种生物硫醇后, 在pH 4~9范围内观察到明显的荧光信号增强, 表明该探针能够在较宽的pH范围(pH 4~9)内, 实现对生物硫醇的检测(图 2d).

  图 2

  

  图 2.  探针CO-NBS (10 μmol/L)在DMSO-PBS缓冲溶液(V:V＝1:1, 10 mmol/L, pH 7.4)体系中与Cys (0~10 μmol/L)作用的(a)紫外滴定光谱和(b)荧光滴定光谱, (c)探针CO-NBS与Cys, Hcy, GSH和S^2－的反应时间图, (d) pH对探针CO-NBS识别生物硫醇的影响

  Figure 2.  UV-vis absorption spectrum (a) and fluorescence spectra (b) of CO-NBS (10 μmol/L) in presence of Cys (0~10 μmol/L) in DMSO-PBS (V:V＝1:1, 10 mmol/L, pH 7.4)(each spectrum is recorded 50 s after Cys addition), (c) reaction time profile of fluorescence spectra of CO-NBS (10 μmol/L) upon addition of Cys, Hcy, GSH and Na₂S (100 μmol/L) 575 nm, and (d) effect of pH on the fluorescence intensity of probe CO-NBS (10 µmol/L) upon addition of Cys, Hcy and GSH

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  1.2   探针CO-NBS对生物硫醇检出限研究

  我们通过对探针CO-NBS溶液(10 μmol/L)扫描10次, 测定其在575 nm处的荧光强度, 计算得到标准偏差σ, 根据探针在不同浓度生物硫醇的575 nm处的荧光强度得到的荧光强度与Cys、Hcy、GSH浓度的工作曲线.对于Cys线性方程为: Y_cys＝1.53433[Cys]+0.61998, R²＝0.99059(图 2d), 根据检出限计算公式C_DL＝3σ/k, 得到其检出限为92 nmol/L.同样, 探针CO-NBS对于Hcy和GSH的检出限分别为30、62 nmol/L.

  1.3   探针CO-NBS的选择性研究

  接下来, 进一步研究了探针CO-NBS对三种生物硫醇的选择性(图 3a).在含有探针CO-NBS (10 μmol/L)的DMSO-PBS缓冲溶液(V:V＝1:1, 10 mmol/L PBS, pH 7.4)中, 分别加入100 μmol/L的其它生物小分子(Asp, Arg, Gln, Val, Thr, Ala, Glu, Leu, His, Gly, Ile, Lys, Met, Trp, Pro, Tyr, Ser, Phe, Asn, S^2－, NO₃^－, Cl^－, F^－, I^－, Br^－, SCN^－, HSO₃^－, CH₃COO^－)或者三种生物硫醇. 结果表明, 其他生物小分子, 几乎不会引起荧光信号的改变, 而加入Cys、Hcy或者GSH后, 575 nm处荧光信号强度的显著增强, 表明探针CO-NBS对生物硫醇的检测有高选择性.

  图 3

  

  图 3.  (a) 575 nm处探针CO-NBS的荧光强度与Cys浓度的工作曲线, 以及(b)探针CO-NBS对生物硫醇的荧光光谱的选择性实验

  Figure 3.  (a) Working curve of CO-NBS towards Cys at 575 nm, and (b) selective experiment of CO-NBS to biothiols by fluorescence spectra

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  1.4   反应机理研究

  为了研究探针CO-NBS与Cys、Hcy、GSH的传感机制, 以Cys为代表, 通过有机合成的方法制备出了探针CO-NBS与Cys的反应产物, 并对产物结构进行了¹H NMR和HRMS表征.对产物、化合物CO-OH、探针CO-NBS的¹H NMR谱图进行了对照(图 4), 加入Cys后, 探针CO-NBS的质子氢由δ 7.81和7.28 (Hg和Hh)分别转移到δ 7.51和6.79 (Hg'和Hh'), 质子δ 9.12、8.61、8.26 (Hf、Hk、Hj)消失, 伴随活泼质子δ 10.03 (Hi)的出现, 并且其产物与化合物CO-OH的¹H NMR基本一致.同时将CO-NBS与Cys反应溶液用高分辨质谱进行了表征, 特征离子峰[M+H]⁺ m/z 364.1539 (calcd 364.1549)的出现也验证了提出的反应机理.

  图 4

  

  图 4.  产物、化合物CO-OH、化合物CO-NBS的¹H NMR对照谱图

  Figure 4.  ¹H NMR spectra of the product, CO-OH, and CO-NBS

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  1.5   细胞成像研究

  采用噻唑蓝(MTT)法对探针CO-NBS对BT-474乳腺癌细胞的毒性进行了测试.研究结果显示, 探针浓度为20 µmol/L, 细胞存活率仍保持在80%以上, 说明探针CO-NBS对BT-474乳腺癌细胞具有较低的毒性.鉴于此, 为进一步评估探针CO-NBS追踪活细胞中生物硫醇的能力, 对CO-NBS进行了细胞成像研究.如图 5所示, 首先, 只用探针CO-NBS (10 μmol/L)孵育BT-474人乳腺癌细胞30 min后, 显现出橙色荧光信号(图 5b), 而先用N-乙基马来酰亚胺(NEM, 一种生物硫醇捕获剂)孵育30 min后, 再用探针CO-NBS (10 μmol/L)孵育BT-474人乳腺癌细胞30 min后, 基本无荧光信号的产生, 说明该探针能够检测到细胞内内源性的生物硫醇(图 5c).接下来, 先用NEM培养30 min, 再分别用外源的Cys、Hcy、GSH (1 mmol/L)孵育BT-474人乳腺癌细胞30 min, 最后分别用探针CO-NBS (10 μmol/L)孵育细胞30 min, BT-474人乳腺癌细胞显示出较强的荧光信号(图 5d~5f).以上结果表明该探针具有检测活细胞中内外源性生物硫醇的潜力.

  图 5

  

  图 5.  探针CO-NBS在BT-474人乳腺癌细胞中的激光共聚焦成像图

  Figure 5.  Laser confocal imaging of CO-NBS in BT-474 human breast cancer cells

  (a1-3) Image of cells in the absence of probe CO-NBS, (b1-3) image of cells which were incubated with probe CO-NBS (10 μmol/L) for 30 min, (c1-3) the cells were pretreated with NEM (1 mmol/L), (d1-3, e1-3, f1-3) the cells were pretreated with NEM (1 mmol/L) for 30 min and then incubated with Cys, Hcy and GSH (1 mmol/L) for 30 min and probe CO-NBS (10 μmol/L) for 30 min subsequently. Emission was collected at 493~591 nm, excited at 458 nm, scale bar: 40 μm

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  1.6   斑马鱼成像

  基于活细胞成像的初步研究, 以3日龄的脊椎动物斑马鱼作为测试模型, 进一步评估探针CO-NBS在检测活体内生物硫醇的能力(图 6).仅用探针CO-NBS (10 μmol/L)处理30 min后, 斑马鱼显示出较弱的荧光; 预先用生物硫醇捕获剂NEM (100 mmol/L)预处理30 min, 再用探针CO-NBS (10 μmol/L)处理30 min后, 斑马鱼几乎没有荧光信号; 预先用生物硫醇清除剂NEM (100 mmol/L)预处理30 min, 再用探针CO-NBS (10 μmol/L)与Cys (100 μmol/L)处理30 min后, 斑马鱼显示出强烈的荧光信号(图 6).表明探针CO-NBS可以很好地检测到斑马鱼体内的生物硫醇.

  图 6

  

  图 6.  探针CO-NBS在3日龄的斑马鱼中的荧光成像图

  Figure 6.  Fluorescence images of probe CO-NBS sensing Cys in 3-day-old zebrafish Emission was observed at 493~591 nm, excited at 458 nm, scale bar: 40 mm

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  2.   结论

  合成了一种新型的基于香豆素衍生物的荧光探针CO-NBS, 该探针以2, 4-二硝基苯磺酰基部分作为生物硫醇的选择性识别位点, 具有低检测选择性检测生物硫醇的能力.在DMSO-PBS (V:V＝1:1, 10 mmol/L, pH 7.4)的缓冲溶液中, 能够实现对Cys、Hcy、GSH的快速(70, 70, 140 s)、高灵敏性(检出限分别为92、30、62 nmol/L)响应, 并且该探针CO-NBS能够成功应用于BT-474细胞和脊椎动物斑马鱼中生物硫醇的荧光成像, 在研究硫醇在病理学分析方面具有潜在应用价值.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  ¹H NMR和¹³C NMR数据由核磁共振波谱仪(瑞士Bruker AVANCEIII 600 MHz)测定, 高分辨率电喷雾质谱(ESI-HRMS)数据由Ultra-Apex Fourier-transform离子回旋共振质谱仪(Bruker Daltonics Inc)进行测定, 紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱分别由Agilent Technologies Cary 60分光光度计和Agilent Cary Eclipse荧光光度计记录.细胞成像和斑马鱼成像图片由激光共焦荧光显微镜Carl of Zeiss (Zeiss LSM 880)拍摄.

  4-(二乙基氨基)水杨醛、乙酰乙酸乙酯、哌啶、对羟基苯甲醛、2, 4-二硝基苯磺酰氯、九水合硫化钠(Na₂S•9H₂O)、亚硫酸氢钠(NaHSO₃)、硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃)、溴化钠(NaBr)、氯化钠(NaCl)、氟化钠(NaF)、碘化钠(NaI)、半光氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)精氨酸(Arg)、天冬酰氨(Asn)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、苏氨酸(Thr)、谷氨酰氨(Gln)、天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、丝氨酸(Ser)、苯甲氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)、色氨酸(Trp)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)均为分析纯, 购自于安耐吉、麦克林、阿拉丁、科密欧试剂公司.

  3.2   探针CO-NBS的合成方法

  将4-(二乙基氨基)水杨醛(2.90 g, 15 mmol)、乙酰乙酸乙酯(2.15 g, 16.5 mmol)用30 mL乙醇溶解, 然后向烧瓶中滴加哌啶(0.15 mL).室温搅拌30 min后, 将反应液在78 ℃下再回流2 h.过滤沉淀, 用乙醇重结晶得到亮黄色晶体3-乙酰基-7-二乙氨基香豆素(1), 3.42 g, 产率88%. ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.55 (s, 1H), 7.51 (d, J＝15.8 Hz, 1H), 6.78 (dd, J＝9.0, 2.0 Hz, 1H), 6.61 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 3.51~3.39 (m, 4H), 2.47 (s, 3H), 1.22 (t, J＝7.0 Hz, 6H); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ: 198.1, 158.9, 156.2, 118.7, 136.8, 130.7, 129.1, 107.9, 107.1, 96.5, 46.8, 29.3, 12.2.

  将化合物1 (6.50 g, 15 mmol)、对羟基苯甲醛(2.01 g, 16.5 mmol)用50 mL CH₃CN溶解, 然后向烧瓶中滴加哌啶(0.66 mL), 将反应液于80 ℃回流反应8 h.停止反应, 过滤沉淀, 沉淀用CH₃CN洗涤、干燥得到黄色粉末(E)-7-(二乙氨基)-3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)-2H-吡喃-2-酮(2), 3.06 g, 产率56%. ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.02 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 7.74 (d, J＝15.6 Hz, 1H), 7.63~7.56 (m, 2H), 7.52 (d, J＝8.4 Hz, 2H), 6.79 (d, J＝8.4 Hz, 2H), 6.74 (dd, J＝9.0, 2.0 Hz, 1H), 6.54 (d, J＝1.6 Hz, 1H), 3.46~3.42 (m, 4H), 1.09 (t, J＝7.0 Hz, 6H); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ: 183.9, 159.4, 157.7, 156.7, 149.1, 146.8, 143.9, 134.1, 130.2, 129.6, 127.1, 125.1, 115.3, 107.9, 106.4, 96.4, 48.9, 37.7, 11.4.

  将化合物2 (0.54 g, 1.5 mmol)、三乙胺(0.18 g, 1.65 mmol)用15 mL DMF溶解, 室温下搅拌10 min, 然后滴加2, 4-二硝基苯磺酰氯(0.48 g, 1.65 mmol)于烧瓶中.在室温下搅拌反应10 h后, 加入水(15 mL)淬灭反应, 然后用CH₂Cl₂ (20 mL×3)萃取.合并有机相, 用无水硫酸钠干燥, 减压旋蒸除去溶剂.将粗产物用柱色谱进一步纯化, 用洗脱液石油醚/乙酸乙酯(V:V＝10:1)洗脱得到橙色固体, 即为探针CO-NBS, 0.47 g, 产率53%. m.p. 236.8~237.7 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.13 (d, J＝2.2 Hz, 1H), 8.62(d, J＝2.2 Hz, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.26 (d, J＝8.7 Hz, 1H), 7.94 (d, J＝15.8 Hz, 1H), 7.80 (d, J＝8.7 Hz, 2H), 7.70~7.64 (m, 2H), 7.28 (d, J＝8.6 Hz, 2H), 6.82 (dd, J＝9.0, 2.0 Hz 1H), 6.62 (d, J＝2.0 Hz, 1H), 3.51~3.49 (m, 4H), 1.25 (t, J＝7.0 Hz, 6H); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ: 185.4, 153.1, 149.3, 148.5, 148.1, 132.4, 130.3, 126.7, 121.1, 115.3, 110.3, 107.9, 95.9, 44.46, 12.33; HRMS (ESI) calcd for C₂₈H₂₄N₃O₁₀S [M+H]⁺ 594.1138, found 594.1177.

  3.3   探针CO-NBS的光谱测试方法

  准确称取CO-NBS固体(1.18 mg, 2 mmol), 用1 mL DMSO溶解得到浓度为2×10^－3 mol/L (2 mmol/L)的探针储备溶液; 同时准确称取各种分析物, 并将其用去离子水溶解, 得到2×10^－2 mol/L的储备溶液.荧光光谱仪设置为:激发波长450 nm, 狭缝5 nm/10 nm, 电压700 V.

  3.4   探针CO-NBS细胞毒性测定方法

  首先将BT-474细胞接种于96孔板中, 密度为每孔1×10⁴个细胞, 然后在培养箱(5% CO₂, 20% O₂, 37 ℃)中培养24 h.向培养板中加入梯度浓度(0, 10, 20 μmol/L)探针CO-NBS后, 将细胞再培养12或24 h.然后每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/L, 溶于DMSO中), 温育4 h后, 除去MTT溶液, 再向每个孔中加入100 μL DMSO, 在多孔板读数器上记录490 nm处的吸光度值.最终根据公式计算细胞存活率:细胞存活率(%)＝(实验组的平均吸光度－空白的平均吸光度)/(对照组的平均吸光度－空白的平均吸光度)×100%.

  辅助材料(Supporting Information)  探针CO-NBS的¹H NMR、¹³C NMR、HR-MS、紫外和荧光光谱以及MTT数据.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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  图式 1  探针CO-NBS的合成路线图

  Scheme 1  Synthetic route of probe CO-NBS

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  图 1  探针与生物硫醇的反应机理

  Figure 1  Reaction mechanism between CO-NBS and biothiols

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  图 2  探针CO-NBS (10 μmol/L)在DMSO-PBS缓冲溶液(V:V＝1:1, 10 mmol/L, pH 7.4)体系中与Cys (0~10 μmol/L)作用的(a)紫外滴定光谱和(b)荧光滴定光谱, (c)探针CO-NBS与Cys, Hcy, GSH和S^2－的反应时间图, (d) pH对探针CO-NBS识别生物硫醇的影响

  Figure 2  UV-vis absorption spectrum (a) and fluorescence spectra (b) of CO-NBS (10 μmol/L) in presence of Cys (0~10 μmol/L) in DMSO-PBS (V:V＝1:1, 10 mmol/L, pH 7.4)(each spectrum is recorded 50 s after Cys addition), (c) reaction time profile of fluorescence spectra of CO-NBS (10 μmol/L) upon addition of Cys, Hcy, GSH and Na₂S (100 μmol/L) 575 nm, and (d) effect of pH on the fluorescence intensity of probe CO-NBS (10 µmol/L) upon addition of Cys, Hcy and GSH

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  图 3  (a) 575 nm处探针CO-NBS的荧光强度与Cys浓度的工作曲线, 以及(b)探针CO-NBS对生物硫醇的荧光光谱的选择性实验

  Figure 3  (a) Working curve of CO-NBS towards Cys at 575 nm, and (b) selective experiment of CO-NBS to biothiols by fluorescence spectra

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  图 4  产物、化合物CO-OH、化合物CO-NBS的¹H NMR对照谱图

  Figure 4  ¹H NMR spectra of the product, CO-OH, and CO-NBS

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  图 5  探针CO-NBS在BT-474人乳腺癌细胞中的激光共聚焦成像图

  Figure 5  Laser confocal imaging of CO-NBS in BT-474 human breast cancer cells

  (a1-3) Image of cells in the absence of probe CO-NBS, (b1-3) image of cells which were incubated with probe CO-NBS (10 μmol/L) for 30 min, (c1-3) the cells were pretreated with NEM (1 mmol/L), (d1-3, e1-3, f1-3) the cells were pretreated with NEM (1 mmol/L) for 30 min and then incubated with Cys, Hcy and GSH (1 mmol/L) for 30 min and probe CO-NBS (10 μmol/L) for 30 min subsequently. Emission was collected at 493~591 nm, excited at 458 nm, scale bar: 40 μm

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  图 6  探针CO-NBS在3日龄的斑马鱼中的荧光成像图

  Figure 6  Fluorescence images of probe CO-NBS sensing Cys in 3-day-old zebrafish Emission was observed at 493~591 nm, excited at 458 nm, scale bar: 40 mm

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