English

• 硫化氢(H₂S)具有独特的臭鸡蛋气味, 是一种有毒环境污染物.近年来研究发现, H₂S是继一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之后的第三种内源性气体信号递质分子^[1].在哺乳动物不同组织和器官中, 内源性H₂S可由胱硫醚β合成酶(CBS)、胱硫醚γ裂解酶、3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MPST)/半胱氨酸氨基转移酶(CAT)以及氨基酸氧化酶(DAO)催化手性半胱氨酸生成^[2].研究表明, 体内H₂S浓度异常与许多疾病有关, 包括阿尔茨海默氏症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化等^[3]. H₂S被认为与多种生理和病理过程有关^[4], 其在体内的潜在分子机制尚不明确^[5].因此, 开发能够有效检测生物体内H₂S的分析方法具有重要的研究意义^[6].

  与传统的H₂S检测方法相比, 荧光探针技术具有选择性好、灵敏度高等特点, 尤其是对生物系统无侵入性损伤、适于细胞及活体成像, 因此被广泛用于检测内源性生物活性分子^[7].基于硫化氢的还原性和亲核性, 多种反应类型的H₂S荧光探针被发展出来, 主要有芳香叠氮/硝基还原型^[8]、亲核取代型^[9]、亲核加成/双亲核加成型^[10]和形成CuS沉淀型^[11]等. 2013年, 我们^[9d]发现7-硝基苯并氟咱(NBD)-哌嗪结构可以选择性与H₂S发生亲核取代(硫解)反应, 并构建了基于荧光共振能量转移(FRET)原理的H₂S荧光探针1.同时, 发现在叠氮基香豆素结构中引入吸电子基团氟原子, 可以在保持探针选择性的同时, 提高叠氮被H₂S还原的速率(2和3)^[8g].进一步, 利用双淬灭效应(NBD参与的FRET淬灭和叠氮参与的ICT淬灭)增加荧光淬灭程度, 当探针和H₂S反应后, 双淬灭效应同时消失, 荧光增强明显, 可显著提高探针的灵敏性.充分利用H₂S分子的强还原性和强亲核取代性, 降低单反应性分子的竞争性干扰, 显著提高探针的选择性.基于此设计理念, 发展了FRET-ICT双反应H₂S荧光探针4^[12].

  图 1

  

  图 1.  已报道的H₂S荧光探针1~4和本工作设计的荧光探针5

  Figure 1.  Reported H₂S fluorescent probe 1~4 and probe 5 in this work

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  双反应探针与H₂S的反应速率取决于反应活性较低的基团, 而探针2的反应速率(k₂＝6.95 L·mol^－1·s^－1)明显低于探针1的反应速率(k₂＝15.5 L·mol^－1·s^－1), 为了提高双反应探针的反应速率, 将邻位氟代叠氮基香豆素3(反应速率k₂＝13.2 L·mol^－1·s^－1)与NBD-Cl反应, 经一步反应制备了双反应荧光探针5 (Eq. 1), 测试了探针的选择性、灵敏性、与H₂S反应速率及光/热稳定性等光谱性能, 初步探索了探针的实际应用能力(CBS酶活性测试和细胞内H₂S荧光成像).

  (1)

  1.   结果与讨论

  1.1   识别性能

  在37 ℃向1.0×10^－6 mol/L探针1~5的磷酸缓冲盐(PBS)溶液(1.0×10^－2 mol/L, pH 7.4, 含10%乙腈)中加入2.5×10^－4 mol/L H₂S, 测试了探针溶液随时间变化的荧光发射光谱.随着反应进行, 探针5荧光强度明显增强.反应结束后, 荧光增强倍数高达3600倍(图 2a).以最大发射波长处荧光强度对反应时间作图, 计算并比较相应的反应速率常数, 结果如图 2b和表 1所示, 邻位氟代叠氮基香豆素3与H₂S的二级反应速率常数k₂是非氟代叠氮基香豆素2的1.9倍, 与探针1相近, 表明探针1和3与H₂S的反应速率更匹配.同时, 氟代双反应探针5的二级反应速率常数k₂是非氟代双反应探针4的1.5倍, 表明, 引入两个响应速率匹配的反应基团, 可以提高双反应探针与H₂S的反应速率.

  图 2

  

  图 2.  探针1~5 (1.0×10^－6 mol/L)与H₂S (2.5×10^－4 mol/L)的荧光反应动力学

  Figure 2.  Fluorescence kinetics of probe 1~5 (1.0×10^－6 mol/L) in reaction with H₂S (2.5×10^－4 mol/L)

  (a) Time-dependent emission intensity at 440 nm of probe 5 after adding H₂S. (b) The relationship between fluorescence intensity at 440 nm and reaction time of probe 1~5 on treatment with H₂S

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  表 1

  

  表 1  探针1~5与H₂S的反应动力学参数

  Table 1.  Kinetic parameters of probe 1~5 in reaction with H₂S

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  Probe	kobs/s－1	K2/(L·mol－1·s－1)	T1/2/min
  1	3.88×10－3	15.5	2.97
  2	1.74×10－3	6.95	6.65
  3	3.31×10－3	13.2	3.49
  4	1.30×10－3	5.20	8.88
  5	1.94×10－3	7.79	5.93

  测试了探针5分别与多种具有潜在干扰能力的分子如金属离子(Fe³⁺、Zn²⁺)、阴离子(SO₄^2－、S₂O₃^2－、NO₂^－)、具有氧化还原能力的活性分子(H₂O₂、HClO、Vc、Cys、Hcy、GSH)等的荧光响应能力, 其中除Cys、Hcy浓度为1.0×10^－3 mol/L, GSH浓度为5.0×10^－3 mol/L以外, 其它分子浓度均为1.0×10^－4 mol/L.如图 3a所示, 与其它分子相比, 只有H₂S能够使探针产生显著的荧光强度变化, 表明双反应探针5对H₂S具有较高的选择性.探针的检测灵敏性如图 3b所示, 随着加入H₂S浓度增大, 探针溶液荧光显著增强.以最大荧光强度对H₂S浓度作图并拟合, 发现在H₂S浓度0~1.0×10^－4 mol/L范围内线性关系良好, 按照3σ/k方法^[12]计算探针的检测极限为4.0×10^－8 mol/L.上述实验结果表明, 探针5能够对H₂S高选择性、高灵敏性检测.

  图 3

  

  图 3.  探针5的选择性和线性关系

  Figure 3.  Selectivity and linear relationship of probe 5

  (a) Fluorescence responses of probe 5 incubated with various analytes. 1, probe 5; 2, SO₃^2－; 3, SO₄^2－; 4, S₂O₃^2－; 5, H₂O₂; 6, HClO; 7, NO₂^－; 8, Zn²⁺; 9, Fe³⁺; 10, Vc; 11, Cys; 12, Hcy; 13, GSH; 14, H₂S. (b) Fluorescence response of probe 5 with different concentrations of H₂S (Insert: The emission intensity at 440 nm of probe 5 with different concentrations of H₂S). Probe 1.0×10^－6 mol/L, Cys and Hcy 1.0×10^－3 mol/L, GSH 5×10^－3 mol/L, other interferents 1.0×10^－4 mol/L; H₂S 0~1.50×10^－4 mol/L

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  1.2   稳定性

  叠氮还原型探针结构容易被破坏, 在手提式紫外灯照射下, 对探针1~5的稳定性进行了测试.如图 4a所示, 随着紫外照射时间的延长, 邻位氟代叠氮基香豆素探针3很快产生较大强度的荧光, 双反应探针和其它对照探针分子并未产生明显的荧光变化.在生理温度甚至更高的温度(50 ℃), 叠氮还原型探针同样产生一定程度的荧光增强, 其它探针荧光基本不变.表明双反应探针5具有良好的高热稳定性.

  图 4

  

  图 4.  探针的光稳定(a)和热稳定性(b)

  Figure 4.  Optical stability (a) and thermal stability (b) of the probes

  UV lamp power 18 W for the optical stability test, 37 and 50 ℃ for the thermal stability test

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  1.3   识别机制

  为了研究探针的识别机制, 测试了双反应探针5及其对照分子与H₂S反应溶液的紫外可见吸收光谱和高分辨质谱.如图 5所示, 探针5结构中叠氮基香豆素和NBD-哌嗪结构的最大吸收峰分别在330和500 nm处, 随着反应进行, 它们的最大吸收峰分别红移至360和550 nm, 其变化趋势分别与对照分子1和3的紫外吸收光谱一致.探针5与H₂S反应产物的高分辨质谱[M+H]⁺为306.1248, 与理论值(306.1248)一致.结合已报道工作^{[9d, 8g, 12]}, 推测了探针与H₂S的作用机制, 可能是探针5结构中叠氮基团被H₂S还原为胺基, NBD-哌嗪与H₂S发生亲核取代反应(Eq. 2).

  图 5

  

  图 5.  探针5 (1.0×10^－6 mol/L)与H₂S (1.0×10^－4 mol/L)反应的紫外吸收光谱

  Figure 5.  UV-Vis spectrum of probe 5 (1.0×10^－6 mol/L) in reaction with H₂S (1.0×10^－4 mol/L)

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  (2)

  1.4   CBS酶活性检测

  荧光探针技术已经被用于多种酶的抑制剂高通量筛选.文献报道, 真核细胞内CBS能够以L-Cys为底物合成内源H₂S, 并且羟胺、炔丙基甘氨酸(PPG)和氨基氧乙酸(AOAA)可以作为CBS的抑制剂调控细胞内源H₂S的生物合成.用双反应探针5验证了体外表达的人源CBS (Δ414-551)的活性和PPG、AOAA的抑制能力.如图 6所示, 在加入底物L-Cys后, 随着孵育时间延长和CBS加入量增多, 探针荧光强度逐渐增强(图 6a); 加入抑制剂PPG和AOAA后, 探针荧光强度明显降低.表明, 探针5可以用于内源H₂S合成酶CBS的活性检测和抑制剂筛选.

  图 6

  

  图 6.  探针5用于CBS酶活性检测

  Figure 6.  Detection of CBS activity using probe 5

  (a) The time-dependent emission intensity at 440 nm of probe 5, 10 mmol/L L-Cys and 0~10 µg CBS enzyme. (b) The fluorescence intensity at 440 nm of probe 5 before and after treatment with inhibitors. Probe 1.0×10^－5 mol/L, CBS 0.01 μg/μL, inhibitors 1.0×10^－3 mol/L

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  1.5   细胞成像研究

  探针5用于HeLa细胞中H₂S荧光成像研究.向细胞中单独加入探针5 (2.0×10^－6 mol/L), 孵育30 min, 细胞产生较弱的荧光(图 7a, 7b); 探针和Cys (5.0×10^－4 mol/L)共孵育, 细胞荧光增强(图 7c, 7d); 先孵育探针30 min, 再加入H₂S (2.5×10^－4 mol/L)孵育30 min, 细胞荧光明显增强.表明, 探针5能够用于细胞内H₂S生物成像研究.

  图 7

  

  图 7.  探针5用于HeLa细胞H₂S荧光成像

  Figure 7.  Confocal imaging of H₂S in HeLa cells using probe 5

  (a, b) Cells incubated with probe 5 only; (c, d) Cells co-incubated with probe 5 and D-cysteine; (e, f) Cells incubated with probe 5 firstly, and then incubated with H₂S

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  2.   结论

  设计合成了一种响应速率匹配的FRET-ICT双反应H₂S荧光探针5.探针可以与H₂S发生还原和亲核取代反应, 具有良好的选择性, 并且探针中两个反应基团的反应速率相当.探针可以实现低浓度H₂S检测, 检测极限为40 nmol/L.此外, 探针能够用于CBS活性检测和抑制剂筛选, 并且可以检测活细胞中H₂S生物合成, 具有潜在的应用价值.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  Brucker核磁共振仪(400 MHz和600 MHz); Varian 7.0 T FTICR-MS质谱仪(美国Agilent公司); Hitachi F-7000型荧光光谱仪(日本Hitachi公司); UV-3600型分光光度计(美国Agilent公司).柱层析用硅胶(100~200目)及GF254薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂产品; 所用试剂和溶剂均为国产分析纯或者化学纯试剂, 无水试剂均按常规方法处理.

  3.2   实验方法

  3.2.1   探针5的合成及表征

  化合物4的合成参考文献[8g]进行.将化合物4 (165 mg, 0.05 mmol)溶解于25 mL二氯甲烷中, 加入NBD-Cl (100 mg, 0.05 mmol)和三乙胺(210 μL, 0.15 mmol), 室温搅拌过夜.蒸除溶剂, 柱层析分离[V(DCM)/V(MeOH)＝40/1], 得160 mg淡橘色固体化合物5, 产率65%. m.p. 193~195 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.55 (d, J＝8.8 Hz, 1H), 7.74 (d, J＝12.0 Hz, 1H), 7.45 (d, J＝8.0 Hz, 1H), 6.64 (d, J＝8.0 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 4.34 (s, 2H), 4.20 (s, 2H), 4.08 (s, 2H), 3.92 (s, 2H), 3.78 (s, 2H); ¹³C NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 163.3, 159.3, 154.8, 148.3, 145.3, 144.8, 144.7, 144.1, 136.3, 127.5, 121.6, 223.1, 112.2, 107.4, 103.6, 54.9, 49.3, 48.1, 44.9, 40.9. HRMS calcd for C₂₁H₁₅FN₈NaO₆ 517.0996, found 517.0995.

  3.2.2   光谱测试

  探针1~5用二甲基亚砜(DMSO)配制成2.0×10^－3 mol/L的母液, 测试浓度为1.0×10^－6 mol/L.选择性测试所用各种干扰离子均为钠盐或钾盐, 除Cys和Hcy浓度为1.0×10^－3 mol/L, GSH浓度为5×10^－3 mol/L外, 其它干扰离子测试浓度为1.0×10^－4 mol/L, 测试溶液为PBS缓冲溶液(1.0×10^－2 mol/L, pH 7.4, 10% CH₃CN).荧光光谱均在37 ℃条件下测试, 孵育时间为20 min, 样品池为1 cm×1 cm×4 cm石英比色皿, 激发波长为380 nm, 激发和发射狭缝宽度均为5 nm.

  3.2.3   CBS酶活测试

  人源CBS (Δ414-551)活性测试缓冲体系为Tris-HCl (pH 8.0, 0.2 mol/L), 含有5.0×10^－6 mol/L磷酸吡哆醛(PLP)、1.0×10^－2 mol/L GSH、0.5 mg/mL牛血清蛋白(BSA).测试体系总体积200 μL, 其中含有CBS (0.01 μg/μL, 2 μL), 探针5 (1.0×10^－5 mol/L, 2 μL), L-Cys (1.0×10^－2 mol/L, 10 mmol/L)和抑制剂(1.0×10^－3 mol/L, 20 μL). 37 ℃避光孵育1 h.

  3.2.4   细胞实验

  HeLa细胞在高糖培养基中培养, 培养基含有体积分数为10%的胎牛血清、100 U/mL盘尼西林、100 mg/mL链霉素和4 mmol/L L-谷氨酰胺.体积分数为5% CO₂, 待生长至融合度为75%左右时, 加入质量分数为0.25%的胰酶蛋白消化细胞, 进行后续实验.

  细胞成像实验: HeLa细胞接种于成像专用玻底培养皿, 密度为2×10⁴ cm².探针组仅加入探针5 (2.0× 10^－6 mol/L)孵育30 min; 内源H₂S成像组加入探针5 (2.0×10^－6 mol/L)和底物D-Cys (5.0×10^－4 mol/L)共孵育30 min; 外源H₂S成像组先加入探针5 (2.0×10^－6 mol/L)孵育30 min, PBS洗涤三次去除过量探针后, 再加入H₂S (2.0×10^－4 mol/L)继续孵育30 min.共聚焦荧光成像激发波长为405 nm, 收集范围450~500 nm.

  辅助材料(Supporting Information)  探针5的¹H NMR, ¹³C NMR和HRMS图谱, 对照分子1~4与H₂S反应的紫外吸收光谱.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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      (a) Zhang, C. Y.; Wei, L.; Wei, C.; Zhang, J.; Wang, R. Y.; Xi, Z.; Yi, L. Chem. Commun. 2015, 51, 7505.
      (b) Wei, C.; Wang, R. Y.; Zhang, C. Y.; Xu, G. C.; Li, Y. Y.; Zhang, Q. Z.; Li, L. Y.; Yi, L.; Xi, Z. Chem.-Asian J. 2016, 11, 1376.
      (c) Ma, C.; Wei, C.; Li, X. Y.; Zheng, X. Y.; Chen, B.; Wang, M.; Zhang, P. Z.; Li, X. L. Dyes Pigm. 2019, 162, 624.
      (d) Montoya, L. A.; Pearce, T. F.; Hansen, R. J.; Zakharov, L. N.; Pluth, M. D. J. Org. Chem., 2013, 78, 6550.

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  图 1  已报道的H₂S荧光探针1~4和本工作设计的荧光探针5

  Figure 1  Reported H₂S fluorescent probe 1~4 and probe 5 in this work

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  图 2  探针1~5 (1.0×10^－6 mol/L)与H₂S (2.5×10^－4 mol/L)的荧光反应动力学

  Figure 2  Fluorescence kinetics of probe 1~5 (1.0×10^－6 mol/L) in reaction with H₂S (2.5×10^－4 mol/L)

  (a) Time-dependent emission intensity at 440 nm of probe 5 after adding H₂S. (b) The relationship between fluorescence intensity at 440 nm and reaction time of probe 1~5 on treatment with H₂S

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  图 3  探针5的选择性和线性关系

  Figure 3  Selectivity and linear relationship of probe 5

  (a) Fluorescence responses of probe 5 incubated with various analytes. 1, probe 5; 2, SO₃^2－; 3, SO₄^2－; 4, S₂O₃^2－; 5, H₂O₂; 6, HClO; 7, NO₂^－; 8, Zn²⁺; 9, Fe³⁺; 10, Vc; 11, Cys; 12, Hcy; 13, GSH; 14, H₂S. (b) Fluorescence response of probe 5 with different concentrations of H₂S (Insert: The emission intensity at 440 nm of probe 5 with different concentrations of H₂S). Probe 1.0×10^－6 mol/L, Cys and Hcy 1.0×10^－3 mol/L, GSH 5×10^－3 mol/L, other interferents 1.0×10^－4 mol/L; H₂S 0~1.50×10^－4 mol/L

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  图 4  探针的光稳定(a)和热稳定性(b)

  Figure 4  Optical stability (a) and thermal stability (b) of the probes

  UV lamp power 18 W for the optical stability test, 37 and 50 ℃ for the thermal stability test

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  图 5  探针5 (1.0×10^－6 mol/L)与H₂S (1.0×10^－4 mol/L)反应的紫外吸收光谱

  Figure 5  UV-Vis spectrum of probe 5 (1.0×10^－6 mol/L) in reaction with H₂S (1.0×10^－4 mol/L)

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  图 6  探针5用于CBS酶活性检测

  Figure 6  Detection of CBS activity using probe 5

  (a) The time-dependent emission intensity at 440 nm of probe 5, 10 mmol/L L-Cys and 0~10 µg CBS enzyme. (b) The fluorescence intensity at 440 nm of probe 5 before and after treatment with inhibitors. Probe 1.0×10^－5 mol/L, CBS 0.01 μg/μL, inhibitors 1.0×10^－3 mol/L

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  图 7  探针5用于HeLa细胞H₂S荧光成像

  Figure 7  Confocal imaging of H₂S in HeLa cells using probe 5

  (a, b) Cells incubated with probe 5 only; (c, d) Cells co-incubated with probe 5 and D-cysteine; (e, f) Cells incubated with probe 5 firstly, and then incubated with H₂S

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  表 1  探针1~5与H₂S的反应动力学参数

  Table 1.  Kinetic parameters of probe 1~5 in reaction with H₂S

  Probe	kobs/s－1	K2/(L·mol－1·s－1)	T1/2/min
  1	3.88×10－3	15.5	2.97
  2	1.74×10－3	6.95	6.65
  3	3.31×10－3	13.2	3.49
  4	1.30×10－3	5.20	8.88
  5	1.94×10－3	7.79	5.93

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