一种响应速率匹配的双反应探针用于荧光识别硫化氢

解畅 马趁 贾旭 张学琪 魏超 张平竹 李小六

引用本文: 解畅, 马趁, 贾旭, 张学琪, 魏超, 张平竹, 李小六. 一种响应速率匹配的双反应探针用于荧光识别硫化氢[J]. 有机化学, 2019, 39(11): 3277-3282. doi: 10.6023/cjoc201905038 shu
Citation:  Xie Chang, Ma Chen, Jia Xu, Zhang Xueqi, Wei Chao, Zhang Pingzhu, Li Xiaoliu. A Response Rate Matching Dual-Reactable Probe for Fluorescent Recognition of Hydrogen Sulfide[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2019, 39(11): 3277-3282. doi: 10.6023/cjoc201905038 shu

一种响应速率匹配的双反应探针用于荧光识别硫化氢

    通讯作者: 魏超, weichao@hbu.edu.cn; 李小六, lixl@hbu.cn
  • 基金项目:

    国家自然科学基金(No.21778013)、河北省自然科学基金(No.B2018201234)、河北省高等学校科学技术研究(No.QN2017015)、保定市科学研究与发展计划(No.16zg031)和河北大学实验室开放(Nos.sy201833,KYZJX18144)资助项目

摘要: 以6-氟-7-氨基香豆素为荧光基团,氟代叠氮和7-硝基苯并氟咱(NBD)-哌嗪为H2S反应基团和荧光淬灭基团,合成一种双反应H2S荧光探针.探针对H2S的识别性质研究表明,探针的两个反应基团与H2S响应速率匹配,探针对H2S具有高选择性和灵敏性,其荧光增强约3600倍,检测极限为4.0×10-8 mol/L.酶活性测试表明,探针可用于胱硫醚β合成酶(CBS)酶活性检测和抑制剂筛选.细胞成像实验表明,探针可用于细胞内H2S的成像研究.

English

  • 硫化氢(H2S)具有独特的臭鸡蛋气味, 是一种有毒环境污染物.近年来研究发现, H2S是继一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之后的第三种内源性气体信号递质分子[1].在哺乳动物不同组织和器官中, 内源性H2S可由胱硫醚β合成酶(CBS)、胱硫醚γ裂解酶、3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MPST)/半胱氨酸氨基转移酶(CAT)以及氨基酸氧化酶(DAO)催化手性半胱氨酸生成[2].研究表明, 体内H2S浓度异常与许多疾病有关, 包括阿尔茨海默氏症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化等[3]. H2S被认为与多种生理和病理过程有关[4], 其在体内的潜在分子机制尚不明确[5].因此, 开发能够有效检测生物体内H2S的分析方法具有重要的研究意义[6].

    与传统的H2S检测方法相比, 荧光探针技术具有选择性好、灵敏度高等特点, 尤其是对生物系统无侵入性损伤、适于细胞及活体成像, 因此被广泛用于检测内源性生物活性分子[7].基于硫化氢的还原性和亲核性, 多种反应类型的H2S荧光探针被发展出来, 主要有芳香叠氮/硝基还原型[8]、亲核取代型[9]、亲核加成/双亲核加成型[10]和形成CuS沉淀型[11]等. 2013年, 我们[9d]发现7-硝基苯并氟咱(NBD)-哌嗪结构可以选择性与H2S发生亲核取代(硫解)反应, 并构建了基于荧光共振能量转移(FRET)原理的H2S荧光探针1.同时, 发现在叠氮基香豆素结构中引入吸电子基团氟原子, 可以在保持探针选择性的同时, 提高叠氮被H2S还原的速率(23)[8g].进一步, 利用双淬灭效应(NBD参与的FRET淬灭和叠氮参与的ICT淬灭)增加荧光淬灭程度, 当探针和H2S反应后, 双淬灭效应同时消失, 荧光增强明显, 可显著提高探针的灵敏性.充分利用H2S分子的强还原性和强亲核取代性, 降低单反应性分子的竞争性干扰, 显著提高探针的选择性.基于此设计理念, 发展了FRET-ICT双反应H2S荧光探针4[12].

    图 1

    图 1.  已报道的H2S荧光探针1~4和本工作设计的荧光探针5
    Figure 1.  Reported H2S fluorescent probe 1~4 and probe 5 in this work

    双反应探针与H2S的反应速率取决于反应活性较低的基团, 而探针2的反应速率(k2=6.95 L·mol-1·s-1)明显低于探针1的反应速率(k2=15.5 L·mol-1·s-1), 为了提高双反应探针的反应速率, 将邻位氟代叠氮基香豆素3(反应速率k2=13.2 L·mol-1·s-1)与NBD-Cl反应, 经一步反应制备了双反应荧光探针5 (Eq. 1), 测试了探针的选择性、灵敏性、与H2S反应速率及光/热稳定性等光谱性能, 初步探索了探针的实际应用能力(CBS酶活性测试和细胞内H2S荧光成像).

    (1)

    在37 ℃向1.0×10-6 mol/L探针1~5的磷酸缓冲盐(PBS)溶液(1.0×10-2 mol/L, pH 7.4, 含10%乙腈)中加入2.5×10-4 mol/L H2S, 测试了探针溶液随时间变化的荧光发射光谱.随着反应进行, 探针5荧光强度明显增强.反应结束后, 荧光增强倍数高达3600倍(图 2a).以最大发射波长处荧光强度对反应时间作图, 计算并比较相应的反应速率常数, 结果如图 2b表 1所示, 邻位氟代叠氮基香豆素3与H2S的二级反应速率常数k2是非氟代叠氮基香豆素2的1.9倍, 与探针1相近, 表明探针13与H2S的反应速率更匹配.同时, 氟代双反应探针5的二级反应速率常数k2是非氟代双反应探针4的1.5倍, 表明, 引入两个响应速率匹配的反应基团, 可以提高双反应探针与H2S的反应速率.

    图 2

    图 2.  探针1~5 (1.0×10-6 mol/L)与H2S (2.5×10-4 mol/L)的荧光反应动力学
    Figure 2.  Fluorescence kinetics of probe 1~5 (1.0×10-6 mol/L) in reaction with H2S (2.5×10-4 mol/L)

    (a) Time-dependent emission intensity at 440 nm of probe 5 after adding H2S. (b) The relationship between fluorescence intensity at 440 nm and reaction time of probe 1~5 on treatment with H2S

    表 1

    表 1  探针1~5与H2S的反应动力学参数
    Table 1.  Kinetic parameters of probe 1~5 in reaction with H2S
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    Probe kobs/s-1 K2/(L·mol-1·s-1) T1/2/min
    1 3.88×10-3 15.5 2.97
    2 1.74×10-3 6.95 6.65
    3 3.31×10-3 13.2 3.49
    4 1.30×10-3 5.20 8.88
    5 1.94×10-3 7.79 5.93

    测试了探针5分别与多种具有潜在干扰能力的分子如金属离子(Fe3+、Zn2+)、阴离子(SO42-、S2O32-、NO2)、具有氧化还原能力的活性分子(H2O2、HClO、Vc、Cys、Hcy、GSH)等的荧光响应能力, 其中除Cys、Hcy浓度为1.0×10-3 mol/L, GSH浓度为5.0×10-3 mol/L以外, 其它分子浓度均为1.0×10-4 mol/L.如图 3a所示, 与其它分子相比, 只有H2S能够使探针产生显著的荧光强度变化, 表明双反应探针5对H2S具有较高的选择性.探针的检测灵敏性如图 3b所示, 随着加入H2S浓度增大, 探针溶液荧光显著增强.以最大荧光强度对H2S浓度作图并拟合, 发现在H2S浓度0~1.0×10-4 mol/L范围内线性关系良好, 按照3σ/k方法[12]计算探针的检测极限为4.0×10-8 mol/L.上述实验结果表明, 探针5能够对H2S高选择性、高灵敏性检测.

    图 3

    图 3.  探针5的选择性和线性关系
    Figure 3.  Selectivity and linear relationship of probe 5

    (a) Fluorescence responses of probe 5 incubated with various analytes. 1, probe 5; 2, SO32-; 3, SO42-; 4, S2O32-; 5, H2O2; 6, HClO; 7, NO2; 8, Zn2+; 9, Fe3+; 10, Vc; 11, Cys; 12, Hcy; 13, GSH; 14, H2S. (b) Fluorescence response of probe 5 with different concentrations of H2S (Insert: The emission intensity at 440 nm of probe 5 with different concentrations of H2S). Probe 1.0×10-6 mol/L, Cys and Hcy 1.0×10-3 mol/L, GSH 5×10-3 mol/L, other interferents 1.0×10-4 mol/L; H2S 0~1.50×10-4 mol/L

    叠氮还原型探针结构容易被破坏, 在手提式紫外灯照射下, 对探针1~5的稳定性进行了测试.如图 4a所示, 随着紫外照射时间的延长, 邻位氟代叠氮基香豆素探针3很快产生较大强度的荧光, 双反应探针和其它对照探针分子并未产生明显的荧光变化.在生理温度甚至更高的温度(50 ℃), 叠氮还原型探针同样产生一定程度的荧光增强, 其它探针荧光基本不变.表明双反应探针5具有良好的高热稳定性.

    图 4

    图 4.  探针的光稳定(a)和热稳定性(b)
    Figure 4.  Optical stability (a) and thermal stability (b) of the probes

    UV lamp power 18 W for the optical stability test, 37 and 50 ℃ for the thermal stability test

    为了研究探针的识别机制, 测试了双反应探针5及其对照分子与H2S反应溶液的紫外可见吸收光谱和高分辨质谱.如图 5所示, 探针5结构中叠氮基香豆素和NBD-哌嗪结构的最大吸收峰分别在330和500 nm处, 随着反应进行, 它们的最大吸收峰分别红移至360和550 nm, 其变化趋势分别与对照分子13的紫外吸收光谱一致.探针5与H2S反应产物的高分辨质谱[M+H]+为306.1248, 与理论值(306.1248)一致.结合已报道工作[9d, 8g, 12], 推测了探针与H2S的作用机制, 可能是探针5结构中叠氮基团被H2S还原为胺基, NBD-哌嗪与H2S发生亲核取代反应(Eq. 2).

    图 5

    图 5.  探针5 (1.0×10-6 mol/L)与H2S (1.0×10-4 mol/L)反应的紫外吸收光谱
    Figure 5.  UV-Vis spectrum of probe 5 (1.0×10-6 mol/L) in reaction with H2S (1.0×10-4 mol/L)

    (2)

    荧光探针技术已经被用于多种酶的抑制剂高通量筛选.文献报道, 真核细胞内CBS能够以L-Cys为底物合成内源H2S, 并且羟胺、炔丙基甘氨酸(PPG)和氨基氧乙酸(AOAA)可以作为CBS的抑制剂调控细胞内源H2S的生物合成.用双反应探针5验证了体外表达的人源CBS (Δ414-551)的活性和PPG、AOAA的抑制能力.如图 6所示, 在加入底物L-Cys后, 随着孵育时间延长和CBS加入量增多, 探针荧光强度逐渐增强(图 6a); 加入抑制剂PPG和AOAA后, 探针荧光强度明显降低.表明, 探针5可以用于内源H2S合成酶CBS的活性检测和抑制剂筛选.

    图 6

    图 6.  探针5用于CBS酶活性检测
    Figure 6.  Detection of CBS activity using probe 5

    (a) The time-dependent emission intensity at 440 nm of probe 5, 10 mmol/L L-Cys and 0~10 µg CBS enzyme. (b) The fluorescence intensity at 440 nm of probe 5 before and after treatment with inhibitors. Probe 1.0×10-5 mol/L, CBS 0.01 μg/μL, inhibitors 1.0×10-3 mol/L

    探针5用于HeLa细胞中H2S荧光成像研究.向细胞中单独加入探针5 (2.0×10-6 mol/L), 孵育30 min, 细胞产生较弱的荧光(图 7a, 7b); 探针和Cys (5.0×10-4 mol/L)共孵育, 细胞荧光增强(图 7c, 7d); 先孵育探针30 min, 再加入H2S (2.5×10-4 mol/L)孵育30 min, 细胞荧光明显增强.表明, 探针5能够用于细胞内H2S生物成像研究.

    图 7

    图 7.  探针5用于HeLa细胞H2S荧光成像
    Figure 7.  Confocal imaging of H2S in HeLa cells using probe 5

    (a, b) Cells incubated with probe 5 only; (c, d) Cells co-incubated with probe 5 and D-cysteine; (e, f) Cells incubated with probe 5 firstly, and then incubated with H2S

    设计合成了一种响应速率匹配的FRET-ICT双反应H2S荧光探针5.探针可以与H2S发生还原和亲核取代反应, 具有良好的选择性, 并且探针中两个反应基团的反应速率相当.探针可以实现低浓度H2S检测, 检测极限为40 nmol/L.此外, 探针能够用于CBS活性检测和抑制剂筛选, 并且可以检测活细胞中H2S生物合成, 具有潜在的应用价值.

    Brucker核磁共振仪(400 MHz和600 MHz); Varian 7.0 T FTICR-MS质谱仪(美国Agilent公司); Hitachi F-7000型荧光光谱仪(日本Hitachi公司); UV-3600型分光光度计(美国Agilent公司).柱层析用硅胶(100~200目)及GF254薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂产品; 所用试剂和溶剂均为国产分析纯或者化学纯试剂, 无水试剂均按常规方法处理.

    3.2.1   探针5的合成及表征

    化合物4的合成参考文献[8g]进行.将化合物4 (165 mg, 0.05 mmol)溶解于25 mL二氯甲烷中, 加入NBD-Cl (100 mg, 0.05 mmol)和三乙胺(210 μL, 0.15 mmol), 室温搅拌过夜.蒸除溶剂, 柱层析分离[V(DCM)/V(MeOH)=40/1], 得160 mg淡橘色固体化合物5, 产率65%. m.p. 193~195 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.55 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.74 (d, J=12.0 Hz, 1H), 7.45 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.64 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 4.34 (s, 2H), 4.20 (s, 2H), 4.08 (s, 2H), 3.92 (s, 2H), 3.78 (s, 2H); 13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 163.3, 159.3, 154.8, 148.3, 145.3, 144.8, 144.7, 144.1, 136.3, 127.5, 121.6, 223.1, 112.2, 107.4, 103.6, 54.9, 49.3, 48.1, 44.9, 40.9. HRMS calcd for C21H15FN8NaO6 517.0996, found 517.0995.

    3.2.2   光谱测试

    探针1~5用二甲基亚砜(DMSO)配制成2.0×10-3 mol/L的母液, 测试浓度为1.0×10-6 mol/L.选择性测试所用各种干扰离子均为钠盐或钾盐, 除Cys和Hcy浓度为1.0×10-3 mol/L, GSH浓度为5×10-3 mol/L外, 其它干扰离子测试浓度为1.0×10-4 mol/L, 测试溶液为PBS缓冲溶液(1.0×10-2 mol/L, pH 7.4, 10% CH3CN).荧光光谱均在37 ℃条件下测试, 孵育时间为20 min, 样品池为1 cm×1 cm×4 cm石英比色皿, 激发波长为380 nm, 激发和发射狭缝宽度均为5 nm.

    3.2.3   CBS酶活测试

    人源CBS (Δ414-551)活性测试缓冲体系为Tris-HCl (pH 8.0, 0.2 mol/L), 含有5.0×10-6 mol/L磷酸吡哆醛(PLP)、1.0×10-2 mol/L GSH、0.5 mg/mL牛血清蛋白(BSA).测试体系总体积200 μL, 其中含有CBS (0.01 μg/μL, 2 μL), 探针5 (1.0×10-5 mol/L, 2 μL), L-Cys (1.0×10-2 mol/L, 10 mmol/L)和抑制剂(1.0×10-3 mol/L, 20 μL). 37 ℃避光孵育1 h.

    3.2.4   细胞实验

    HeLa细胞在高糖培养基中培养, 培养基含有体积分数为10%的胎牛血清、100 U/mL盘尼西林、100 mg/mL链霉素和4 mmol/L L-谷氨酰胺.体积分数为5% CO2, 待生长至融合度为75%左右时, 加入质量分数为0.25%的胰酶蛋白消化细胞, 进行后续实验.

    细胞成像实验: HeLa细胞接种于成像专用玻底培养皿, 密度为2×104 cm2.探针组仅加入探针5 (2.0× 10-6 mol/L)孵育30 min; 内源H2S成像组加入探针5 (2.0×10-6 mol/L)和底物D-Cys (5.0×10-4 mol/L)共孵育30 min; 外源H2S成像组先加入探针5 (2.0×10-6 mol/L)孵育30 min, PBS洗涤三次去除过量探针后, 再加入H2S (2.0×10-4 mol/L)继续孵育30 min.共聚焦荧光成像激发波长为405 nm, 收集范围450~500 nm.

    辅助材料(Supporting Information)  探针51H NMR, 13C NMR和HRMS图谱, 对照分子1~4与H2S反应的紫外吸收光谱.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.


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    11. [11]

      (a) Sasakura, K.; Hanaoka, K.; Shibuya, N.; Mikami, Y.; Kimura, Y.; Komatsu, T.; Ueno, T.; Terai, T.; Kimura, H.; Nagano, T. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 18003.
      (b) Qu, X. Y.; Li, C. J.; Chen, H. C.; Mack, J.; Guo, Z. J.; Shen, Z. Chem. Commun. 2013, 49, 7510.
      (c) Zhong, K. L.; Zhao, J.; Li, Q. Y.; Hou, S. H.; Tang, Y. W.; Bian, Y. J.; Tang, L. J. Chin. J. Org. Chem. 2018, 38, 1786 (in Chinese).
      (钟克利, 赵杰, 李秋莹, 侯淑华, 汤轶伟, 边延江, 汤立军, 有机化学, 2018, 38, 1786.)

    12. [12]

      (a) Zhang, C. Y.; Wei, L.; Wei, C.; Zhang, J.; Wang, R. Y.; Xi, Z.; Yi, L. Chem. Commun. 2015, 51, 7505.
      (b) Wei, C.; Wang, R. Y.; Zhang, C. Y.; Xu, G. C.; Li, Y. Y.; Zhang, Q. Z.; Li, L. Y.; Yi, L.; Xi, Z. Chem.-Asian J. 2016, 11, 1376.
      (c) Ma, C.; Wei, C.; Li, X. Y.; Zheng, X. Y.; Chen, B.; Wang, M.; Zhang, P. Z.; Li, X. L. Dyes Pigm. 2019, 162, 624.
      (d) Montoya, L. A.; Pearce, T. F.; Hansen, R. J.; Zakharov, L. N.; Pluth, M. D. J. Org. Chem., 2013, 78, 6550.

  • 图 1  已报道的H2S荧光探针1~4和本工作设计的荧光探针5

    Figure 1  Reported H2S fluorescent probe 1~4 and probe 5 in this work

    图 2  探针1~5 (1.0×10-6 mol/L)与H2S (2.5×10-4 mol/L)的荧光反应动力学

    Figure 2  Fluorescence kinetics of probe 1~5 (1.0×10-6 mol/L) in reaction with H2S (2.5×10-4 mol/L)

    (a) Time-dependent emission intensity at 440 nm of probe 5 after adding H2S. (b) The relationship between fluorescence intensity at 440 nm and reaction time of probe 1~5 on treatment with H2S

    图 3  探针5的选择性和线性关系

    Figure 3  Selectivity and linear relationship of probe 5

    (a) Fluorescence responses of probe 5 incubated with various analytes. 1, probe 5; 2, SO32-; 3, SO42-; 4, S2O32-; 5, H2O2; 6, HClO; 7, NO2; 8, Zn2+; 9, Fe3+; 10, Vc; 11, Cys; 12, Hcy; 13, GSH; 14, H2S. (b) Fluorescence response of probe 5 with different concentrations of H2S (Insert: The emission intensity at 440 nm of probe 5 with different concentrations of H2S). Probe 1.0×10-6 mol/L, Cys and Hcy 1.0×10-3 mol/L, GSH 5×10-3 mol/L, other interferents 1.0×10-4 mol/L; H2S 0~1.50×10-4 mol/L

    图 4  探针的光稳定(a)和热稳定性(b)

    Figure 4  Optical stability (a) and thermal stability (b) of the probes

    UV lamp power 18 W for the optical stability test, 37 and 50 ℃ for the thermal stability test

    图 5  探针5 (1.0×10-6 mol/L)与H2S (1.0×10-4 mol/L)反应的紫外吸收光谱

    Figure 5  UV-Vis spectrum of probe 5 (1.0×10-6 mol/L) in reaction with H2S (1.0×10-4 mol/L)

    图 6  探针5用于CBS酶活性检测

    Figure 6  Detection of CBS activity using probe 5

    (a) The time-dependent emission intensity at 440 nm of probe 5, 10 mmol/L L-Cys and 0~10 µg CBS enzyme. (b) The fluorescence intensity at 440 nm of probe 5 before and after treatment with inhibitors. Probe 1.0×10-5 mol/L, CBS 0.01 μg/μL, inhibitors 1.0×10-3 mol/L

    图 7  探针5用于HeLa细胞H2S荧光成像

    Figure 7  Confocal imaging of H2S in HeLa cells using probe 5

    (a, b) Cells incubated with probe 5 only; (c, d) Cells co-incubated with probe 5 and D-cysteine; (e, f) Cells incubated with probe 5 firstly, and then incubated with H2S

    表 1  探针1~5与H2S的反应动力学参数

    Table 1.  Kinetic parameters of probe 1~5 in reaction with H2S

    Probe kobs/s-1 K2/(L·mol-1·s-1) T1/2/min
    1 3.88×10-3 15.5 2.97
    2 1.74×10-3 6.95 6.65
    3 3.31×10-3 13.2 3.49
    4 1.30×10-3 5.20 8.88
    5 1.94×10-3 7.79 5.93
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  • 收稿日期:  2019-05-16
  • 修回日期:  2019-06-24
  • 网络出版日期:  2019-11-25
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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