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• 近年来, 小分子荧光探针的设计和应用受到研究者们的广泛关注^{[1, 2]}.荧光分子的设计一般是在光诱导电子转移(Photoinduced Electron Transfer, PET)、分子内电荷转移(Intramolecular Charge Transfer, ICT)、激发态分子内质子转移(Excited-State Intromolecular Proton Trans- fer, ESIPT)和荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)等识别机理的基础上进行设计的.其中, ESIPT机理是指在激发态下分子内氢键上的质子在烯醇式和酮式之间形成互变, 表现烯醇式和酮式的双发射^[3]; 当激发态以酮式发射为主时, 发射波长红移, 表现为较大的Stokes位移^[4], 大的Stokes位移避免了激发光谱和发射光谱重叠现象, 有效地提高荧光分子探针的灵敏度.近年来, 以苯并噻唑类衍生物^[5~11]和羟基黄酮类衍生物^[12~17]等为代表的ESIPT荧光分子的结构及其构效关系研究已成为探针领域热点课题之一.

  2001年, 唐本忠团队^[18]发现六苯基噻咯及其衍生物在形成聚集时, 由于分子旋转受限荧光强度急剧增强, 首次提出了荧光分子的聚集诱导发光(Aggregation Induced Emission)现象.自此, 包括四苯乙烯类^[19~22]、杂环类^{[23, 24]}、有机大分子^{[25, 26]}和金属有机化合物^{[27, 28]}等多种新型的AIE荧光体系迅速发展起来.

  ESIPT特征和AIE现象均能在一定程度上限制分子内的自由旋转, 导致探针分子的荧光增强.有文献报道同时具有AIE活性的ESIPT化合物^[29~31], 但是ESIPT过程并不一定会产生AIE效应.因此设计具有ESIPT特征的荧光分子, 并研究其结构与AIE活性之间的关系具有非常重要的理论意义.以菲并咪唑为母体, 通过引入苯酚基团, 构建具有ESIPT特征的菲并咪唑衍生物荧光分子, 通过考察其在水溶液中的光谱特征, 讨论其AIE行为.

  1.   结果与讨论

  1.1   PIP-o-OH的设计和晶体表征

  以菲并咪唑为母体, 在菲并咪唑2号位引入酚羟基, 使酚羟基与菲并咪唑C＝N之间形成ESIPT特征, 产生较大的Stokes位移.形成ESIPT的同时, 酚羟基与咪唑N原子之间的氢键作用提高了整个化合物的平面结构, 有利于聚集的形成, 促进AIE作用的产生. PIP-o-OH的合成路线如Eq. 1所示.

  在乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂中得到适合X射线单晶衍射的单晶.探针PIP-o-OH的分子结构如图 1所示, 属于三斜晶系, 空间群为P-1.从结构图 1a中看出, 晶体为双分子结构(A和B), 每个分子上酚羟基O—H与咪唑N原子之间形成O—H…N分子内氢键, 分子内氢键将苯酚和咪唑连接成六元环[C(1)/C(6)/C(7)/N(2)/H(1)/O(1)和C(28)/C(29)/C(34)/N(3)/H(2)/O(2)].两个六元环几乎呈平面结构, 偏差分别为0.00199(3)和0.00620(3) nm.单晶结构中分子内氢键的数据为探针ESIPT特征的形成提供了直观的证据.探针PIP-o-OH的晶胞结构如图 1b所示.

  图 1

  

  图 1.  探针PIP-o-OH的分子结构图(a)和堆积图(b)

  Figure 1.  Molecule structure (a) and packing arrangement (b) of probe PIP-o-OH

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  (1)

  1.2   PIP-o-OH的ESIPT活性

  为了表征探针PIP-o-OH的ESIPT性能, 首先考察了不同溶剂中的探针PIP-o-OH紫外和荧光光谱性能.在MeOH、DMF、CH₃CN、THF、CH₂Cl₂、CH₃COOEt和CH₃C₆H₅中探针PIP-o-OH (20 μmol/L)的紫外光谱见图 2a.从图中可以看出, 探针PIP-o-OH在7种溶剂中均出现三个吸收带, 分别在330、340和360 nm左右.在极性溶剂MeOH和DMF中的吸光度较低, 在非极性溶剂(CH₃CN、THF、CH₂Cl₂、CH₃COOEt和CH₃C₆H₅)中的吸光度较高, 其中探针PIP-o-OH (20 μmol/L)在CH₃C₆H₅中的吸光度最大, 且非极性溶剂中的吸收波长较极性溶剂发生了明显的红移, CH₂Cl₂溶液中的吸收波长与MeOH溶液相比, 三个吸收峰的位移值分别红移了3、3和4 nm.不同溶剂中紫外吸收光谱的结果表明, 探针PIP-o-OH具有典型的ESIPT特征.在质子性溶剂中的吸收峰波长较短, 非质子性溶剂中的吸收峰波长发生红移.质子性溶剂中, MeOH中的H原子与探针PIP-o- OH中羟基O—H形成分子间H…O—H氢键, 氢键的形成一方面限制了探针分子的自由旋转, 同时也限制了羟基O—H中H质子与咪唑N原子之间分子内N…O—H氢键的形成.即质子性溶剂中探针PIP-o-OH ESIPT作用被抑制, 吸收波长较低.而在非质子性溶剂中, 探针PIP-o-OH中羟基O—H与咪唑N原子之间的分子内N…O—H氢键的形成, 增加了探针PIP-o-OH分子的共轭平面, 使紫外吸收波长发生了红移.

  图 2

  

  图 2.  不同溶剂中PIP-o-OH的紫外吸收(a)和荧光发射光谱图(b) (20 μmol/L)

  Figure 2.  Absorption (a) and fluorescence spectra (b) of PIP-o-OH (20 μmol/L) in different solvents

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  随后, 以330 nm为激发波长, 研究上述7种溶剂中探针PIP-o-OH (20 μmol/L)的荧光发射光谱的变化情况, 如图 2b所示.在MeOH和DMF溶剂中, 由于两种溶剂的极性较强, 探针PIP-o-OH在两种溶剂中的溶解性较好, 没有形成明显的聚集, 分子中羟基和咪唑C＝N键之间存在烯醇式和酮式的互变, 荧光光谱表现为烯醇式和酮式的双发射, 波长分别为380和478 nm; 且由于分子内的自由旋转, 消耗了激发态的能量, 发射强度较低.当溶剂的极性下降(CH₃CN、THF、CH₂Cl₂、CH₃COOEt和CH₃C₆H₅)时, 探针PIP-o-OH在溶剂中的溶解度下降, 分子产生聚集, 分子内旋转受到限制, 荧光强度显著增强, 其中CH₃C₆H₅溶液的荧光强度最大; 同时, 在极性较低溶剂中, ESIPT分子在激发态以酮式发射为主(478 nm), 长波发射.以上结果表明, 探针PIP-o-OH在不同溶剂中的发射光谱变化符合EISPT特征, 具有显著的ESIPT活性.

  1.3   PIP-o-OH的AIE活性

  25 ℃下, 考察了探针PIP-o-OH在不同体积比DMF/H₂O (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)混合溶剂中荧光发射光谱的变化, 结果如图 3a所示.以330 nm为激发波长, 探针PIP-o-OH在纯DMF体系中具有双发射现象, 发射波长分别为380和478 nm, 且发射强度相当.少量H₂O的加入, 烯醇式发射(380 nm)强度略有增强, 酮式强度几乎没有变化, 这是由于H₂O与探针PIP-o-OH分子中的羟基O—H形成了分子间H…O—H氢键, 氢键的形成限制了羟基O—H与C＝N键之间的互变, 因此分子主要以烯醇式为主, 烯醇式发射强度略有增强.当H₂O体积分数达到80%时, 荧光光谱发生较大变化.探针PIP-o-OH的短波发射强度显著下降, 长波发射红移到478 nm, 且荧光强度明显增强; 水的体积分数增加到90%时, 长波发射强度达到最大, 约为纯DMF溶液长波发射的14倍.造成上述结果的主要原因是随着水含量的增加, 探针逐渐形成聚集, 聚集有利于酮式结构的形成, 因此荧光发射主要表现为酮式发射; 同时, 分子的聚集限制了其自由旋转, 激发态能量全部用于发射, 表现为强荧光.这是典型的聚集诱导的荧光增强(AIE)现象.同样, 在不同体积比MeOH/H₂O (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)的混合溶剂中, 探针PIP-o-OH也表现出类似的荧光发射变化(图 3b).此外, 5 ℃下探针PIP-o-OH在不同比例DMF/H₂O (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4, 5 ℃)的混合溶剂中荧光发射光谱的变化与常温(25 ℃)下荧光发射光谱变化趋势类似, 荧光强度随含量增加而增强, 说明了较低温度下探针PIP-o-OH在含水溶剂中也能够形成聚集, 表现为AIE现象.探针PIP-o-OH在水的体积分数为90%的DMF/H₂O混合溶剂中的发射波长为478 nm, Stokes位移约为150 nm, 这种较大的Stokes位移进一步证明了探针PIP-o-OH的ESIPT活性.

  图 3

  

  图 3.  PIP-o-OH (20 μmol/L)在不同体积比例的DMF/H₂O (a)和MeOH/H₂O (b) (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)溶液中的荧光光谱变化图谱

  Figure 3.  Changes of fluorescence spectra of PIP-o-OH (20 μmol/L) in different volume ratios of DMF/H₂O (a) and MeOH/H₂O (b)

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  探针PIP-o-OH在水溶液中的聚集和荧光增强现象明显, 可实现“裸眼”观察. 图 4分别为探针PIP-o-OH在不同比例的DMF/H₂O (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)溶液中的日光、紫外灯及红色激光笔照射下效果图. 图 4a中看出, 水的体积分数为80%和90%时, 探针溶液出现明显的浑浊现象, 说明探针分子形成了聚集.紫外灯照射下(365 nm), 观察到水的体积分数为80%和90%的探针溶液发射较强的蓝光(图 4b).在暗室中, 采用红色的激光笔照射探针水溶液时, 水体积分数为80%和90%的探针水溶液中具有显著的丁达尔现象(图 4c).这些结果都证明了探针在水溶液中形成了聚集, 产生了AIE作用.

  图 4

  

  图 4.  PIP-o-OH (20 μmol/L)在不同体积比例的DMF/H₂O (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)液中的日光(a)、紫外灯(b)及红色激光笔(c)照射下的“裸眼”观察图

  Figure 4.  "Naked eye" pictures of PIP-o-OH illuminated by daylight (a), UV lamp (b) and red laser pointer (c) in different proportions of DMF/H₂O (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)

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  为了直观的观察探针PIP-o-OH分子在水溶液中的聚集状态, 通过扫描电镜图像(SEM)观察了探针PIP-o-OH聚集态的形貌特征.水的体积分数是70%和80%时, 探针PIP-o-OH分子在水溶液中聚集成球状粒子(图 5a和5b), 形成有序聚集均匀分布铝箔上, 通过动态光散射(DLS)收集到水的体积分数为80%时球状粒子的平均粒径为100 nm左右; 水的体积分数为90%时, 探针PIP-o-OH由球状聚集成片状结构(图 5b), 聚集程度增强. SEM的形貌充分体现了探针PIP-o-OH在水溶液中的聚集行为.正是由于聚集的形成, 探针PIP-o-OH在水溶液中的旋转收到限制, 导致了显著的荧光增强, 表现为明显的AIE作用.

  图 5

  

  图 5.  PIP-o-OH在水的体积分数为70% (a)、80% (b)、90% (c)的DMF/H₂O (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)混合溶液中形成聚集体的SEM图

  Figure 5.  SEM images of PIP-o-OH in DMF/H₂O (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4) mixtures with different water fraction of 70% (a), 80% (b) and 90% (b)

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  1.4   探针PIP-o-OH对Fe³⁺的识别

  鉴于探针PIP-o-OH的结构特征, 在DMF/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)溶液中, 考察了探针PIP-o-OH在形成聚集的条件下对金属离子的识别情况, 发现在此体系下探针PIP-o-OH对金属离子无特异性识别.而在MeOH/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)溶液中探针PIP-o-OH对Fe³⁺表现出良好的识别性能.在探针PIP-o-OH (20 μmol/L)溶液中分别加入200 μmol/L的K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Pb²⁺、Ba²⁺、Hg²⁺、Ag⁺、Cr²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺和Cu²⁺后的荧光光谱如图 6a所示.加入Fe³⁺时, 荧光强度猝灭为探针强度的0.3倍左右; 而其它金属离子的加入并未改变探针PIP-o-OH分子的荧光强度.这种现象一方面是由于Fe³⁺顺磁性的影响, 另一方面Fe³⁺与探针PIP-o-OH分子发生配位作用后, 激发态下, 探针分子与Fe³⁺之间形成了光诱导电子转移(PET)作用, 猝灭了荧光.因此, 从荧光光谱的变化可以初步看出, 探针PIP-o-OH对Fe³⁺具有选择性识别性能.

  图 6

  

  图 6.  (a) 探针PIP-o-OH (20 μmol/L)在MeOH/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)溶液与不同金属离子(200 μmol/L)作用的荧光变化图; (b)其它金属离子(1 mmol/L)与Fe³⁺ (1 mmol/L)共存时探针PIP-o-OH溶液(20 μmol/L)的荧光光谱图

  Figure 6.  (a) Changes of emission spectra of PIP-o-OH (20 μmol/L) in MeOH/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4) solution with various cations (200 µmol/L); (b) fluorescence spectra of PIP-o-OH (20 μmol/L) in MeOH/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4) solution with Fe³⁺ (1 mmol/L) and other interfered cations (1 mmol/L)

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  为了进一步研究证明探针PIP-o-OH对Fe³⁺的选择性, 在相同的条件下考察了其它常用的金属离子与Fe³⁺共存时, 探针PIP-o-OH对Fe³⁺的识别情况(图 6).从图 6b中看出, Fe³⁺ (1 mmol/L)与其它金属离子(1 mmol/L)共存时, Fe³⁺对探针PIP-o-OH荧光强度的猝灭与Fe³⁺单独存在时类似.说明探针PIP-o-OH分子对Fe³⁺识别不受其他金属离子存在的干扰.同时也考虑了pH值的变化对探针PIP-o-OH分子对Fe³⁺识别的影响.在pH值为2~12的范围内, 探针PIP-o-OH分子单独存在时, 荧光强度只在小范围内波动, 未发生有意义的改变, 说明探针PIP-o-OH分子在大的pH范围内表现为稳定的强荧光; 加入Fe³⁺之后, 荧光猝灭也没有受到pH值变化的影响.上述结果说明, 探针PIP-o-OH分子对Fe³⁺识别既不受其它常用金属离子的干扰, 也不受pH值变化的影响, 具有较好的选择性.

  探针分子的灵敏性也是评价其识别性能的指标之一.探针PIP-o-OH分子随Fe³⁺浓度(0~1 mmol/L)变化时荧光光谱曲线见图 7a.在MeOH/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)体系中, 向探针PIP-o-OH (20 μmol/L)溶液中加入少量Fe³⁺ (100 μmol/L)时, 探针分子的荧光强度即可产生明显的下降, 并随着Fe³⁺浓度的增加, 荧光强度迅速下降, 当Fe³⁺浓度达到1 mmol/L时, 荧光强度猝灭到最低, 约为探针PIP-o-OH荧光强度的1/93.根据滴定实验的结果, 绘制探针PIP-o-OH随Fe³⁺浓度变化的工作曲线(图 7a插图).在Fe³⁺浓度为0~5 μmol/L的范围内, 探针PIP-o-OH荧光强度变化(I₀/I)随着Fe³⁺浓度变化呈良好的线性关系, 线性关系系数R²为0.9940.同时, 根据最低检出限公式S/N＝3^[32]计算得出探针PIP-o-OH对Fe³⁺的检出限为0.49μmol/L.此外, 探针PIP-o-OH对Fe³⁺时间响应表明(图 7b), 加入Fe³⁺ (1 mmol/L)的后20 s, 荧光强度即猝灭到最低值, 此后荧光强度维持不变.说明探针PIP-o-OH可以在短时间内实现对Fe³⁺的响应.以上数据表明, 探针PIP-o-OH对Fe³⁺响应灵敏, 可以在一定浓度范围内定量检测Fe³⁺, 而且具有实时检测能力.

  图 7

  

  图 7.  (a) 探针PIP-o-OH (20 μmol/L)在MeOH/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)溶液随Fe³⁺浓度(0~1 mmol/L)增加的荧光光谱图; (b)探针PIP-o-OH (20 μmol/L)识别Fe³⁺ (1 mmol/L)的荧光强度-时间变化曲线

  Insert: standard curve of the fluorescent intensity in range of Fe³⁺ concentration from 0 to 5 μmol/L

  Figure 7.  (a) Fluorescence spectra of PIP-o-OH (20 μmol/L) in MeOH/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4) solution with the increasing of Fe³⁺ (0~1 mmol/L); (b) time-dependent fluorescence intensity changes of PIP-o-OH (20 μmol/L) upon addition of Fe³⁺ (1 mmol/L)

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  1.5   探针PIP-o-OH对Fe³⁺的识别机理研究

  通过Job法^[33]考察了探针PIP-o-OH与Fe³⁺之间的络合情况, 当探针PIP-o-OH浓度与Fe³⁺浓度比为1:1时, 荧光强度变化比值(I/I₀)达到最低, 说明探针PIP-o-OH与Fe³⁺形成化学计量比为1:1的PIP-o- OH-Fe³⁺络合物.采用高分辨质谱(HR-MS)观察探针PIP-o-OH结合Fe³⁺前后的峰值变化情况.探针PIP-o-OH (C₂₇H₁₉ON₂)加入Fe³⁺后出现的质子峰为521.1678, 该峰归属为[PIP-o-OH+Fe³⁺+NO₃^–+H₂O－H⁺]⁺, 也说明了探针PIP-o-OH与Fe³⁺形成了1:1的络合.上述结果说明, 探针PIP-o-OH与Fe³⁺以1:1的比例形成了PIP-o-OH-Fe³⁺络合物. PIP-o-OH-Fe³⁺络合物形成后, 一方面由于Fe³⁺顺磁性, 另一方面由于探针分子与Fe³⁺之间的光诱导电子转移(PET)作用, 共同导致了荧光的猝灭.

  为了进一步证明探针PIP-o-OH分子内氢键及其与Fe³⁺配位作用和配位方式, 采用密度泛函理论(DFT), 对探针PIP-o-OH和PIP-o-OH-Fe³⁺络合物的基态分子结构进行了优化, 利用B3LYP对基态时前线分子轨道的电子分布情况进行了计算(图 8).在探针PIP-o-OH结构中, 分别优化和计算了酚羟基的氢键构型、非氢键构型两种基态分子的结构, 结果表面, 氢键构型和非氢键构型的HOMO能级相仿, 而氢键构型的LUMO能级较非氢键构型能级得到了一定程度的提升.非氢键构型HOMO和LUMO之间的能量差为4.27 eV, 氢键构型的HOMO和LUMO能级差为4.06 eV.计算结果说明, 酚羟基与咪唑N原子形成分子内氢键为探针PIP-o-OH基态的优势构型, DFT计算构型与得到的探针PIP-o-OH单晶结构一致.形成PIP-o-OH-Fe³⁺络合物后, HOMO和LUMO能级均显著减低, 且配合物中HOMO大部分电子云分布在苯环上, LUMO的电子云从苯环转移到菲并咪唑部分和Fe³⁺上, 说明配合物在激发态能够实现从苯环到Fe³⁺的电子转移(PET), 因此络合物PIP-o-OH- Fe³⁺表现为荧光的猝灭.

  图 8

  

  图 8.  探针PIP-o-OH及PIP-o-OH-Fe³⁺结构优化及能量计算图

  Figure 8.  Optimization stationary structures and energy calculation for PIP-o-OH and PIP-o-OH-Fe³⁺ complex

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  此外, 通过采用SEM观察了探针PIP-o-OH形成络合物后的形貌变化.从探针PIP-o-OH溶液中加入Fe³⁺之后形成的原位络合物的透射电镜图(图 9)可看出, 探针PIP-o-OH的片状结构被破坏, 变成松散的小颗粒平铺在载体上.这种松散的结构消耗了络合物在激发态的能量, 发生了荧光猝灭.所以, PIP-o-OH加入Fe³⁺前后SEM形貌特征也侧面证明了探针PIP-o-OH加入Fe³⁺后的荧光变化.

  图 9

  

  图 9.  PIP-o-OH-Fe³⁺络合物的扫描电镜图

  Figure 9.  SEM image of PIP-o-OH-Fe³⁺ complex

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  1.6   细胞成像

  为了证明探针PIP-o-OH在生物体内对Fe³⁺的响应能力, 测试了探针PIP-o-OH对HeLa细胞的毒性及在HeLa细胞内的荧光响应情况.毒性试验的结果表明, 探针浓度为20 μmol/L时, 在HeLa细胞内的成活率大于85%, 说明探针分子的毒性较低, 可用于细胞检测.在此基础上进行了探针PIP-o-OH在HeLa细胞中的成像研究(图 10).从图 10中看出, 探针PIP-o-OH细胞显示出强烈的蓝色荧光; Fe³⁺进入细胞后, 蓝色的荧光明显减弱.以上结果说明, 探针PIP-o-OH在细胞内的毒性较低, 在细胞内对Fe³⁺的荧光响应灵敏, 可用于细胞内Fe³⁺的检测.

  图 10

  

  图 10.  PIP-o-OH和PIP-o-OH-Fe³⁺络合物在HeLa细胞中的荧光成像图

  Figure 10.  Fluorescence images of HeLa cells treated with PIP-o-OH and PIP-o-OH-Fe³⁺

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  1.7   水样中Fe³⁺含量检测

  为了验证探针PIP-o-OH检测Fe³⁺的实际应用能力, 以自来水、瓶装水(哇哈哈公司)作为待测水样, 通过荧光光谱测定了水样中Fe³⁺浓度.所取水样经过滤漂浮物和沉淀杂质, 然后采用HEPES溶液(pH＝7. 4)稀释100倍后加入探针PIP-o-OH及不同量的Fe³⁺, 在478 nm处记录荧光信号.测定完毕后, 用标准加入法进行回收实验, 测定结果如表 1所示.水样中Fe³⁺的回收率在95.0%~103.0%之间.结果表明, 探针PIP-o-OH可用于水样中Fe³⁺的定量检测, 并具有较高的准确度和精密度.

  表 1

  

  表 1  探针PIP-o-OH对水样中Fe³⁺离子浓度检测结果

  Table 1.  Detection results of Fe³⁺ in real water samples using the probe PIP-o-OH

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  水样	c(Fe3+)/(μmol•L－1)		Recovery/%	RSD/%
  	加入值	测定值
  自来水	1	1.03	103.0	1
  	3	2.86	95.3	0.32
  	5	4.93	98.6	0.65
  瓶装水	1	0.95	95.0	1.12
  	3	2.95	98.3	0.52
  	5	4.89	97.8	0.23

  2.   结论

  设计并合成了酚羟基菲并咪唑荧光探针PIP-o-OH, 并对其ESIPT与AIE效应进行了详细的表征. Fe³⁺存在下, 探针PIP-o-OH可与Fe³⁺形成络合物, 实现对Fe³⁺的选择性识别.由于Fe³⁺的顺磁性和探针PIP-o-OH与Fe³⁺之间的PET作用, 导致探针PIP-o-OH的荧光猝灭.通过探针PIP-o-OH荧光强度的变化实现了HeLa细胞和实际水样中的Fe³⁺检测.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  北京泰克仪器有限公司X-6精细显微熔点测试仪(温度计未经校正); AVANCE-600核磁共振仪(瑞士布鲁克公司); Spectrum One傅里叶变换红外光谱仪(美国珀金埃尔默公司); ESCALAB 250Xi X射线光电子能谱仪(美国赛默公司); H-7650型透射电子显微镜(日本日立公司); Tecnai G2 F30高分辨电子显微镜(美国赛默飞公司); BRUKER-AXS X射线衍射仪(德国布鲁克公司); TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司); LS55荧光分光光度计(美国珀金埃尔默公司).动态光散射(DLS)实验在ALV5000激光散射仪上测定.

  菲醌、水杨醛、HEPES均购自上海阿拉丁试剂公司; 乙酸铵购自天津市天达净化材料精细化工厂; 冰乙酸、乙酸乙酯购自天津市富宇精细化工有限公司; 石油醚是由天津市天力化工有限公司购买; DMF等其它试剂是由天津市科密欧化学品公司购买.上述药品和试剂如未特别说明, 则直接使用.

  3.2   探针PIP-o-OH的合成及表征

  分别将菲醌(1.04 g, 5.0 mmol/L)、水杨醛(0.52 mL, 5.0 mmol/L)、乙酸铵(0.39 g, 5.0 mmol/L), 苯胺(0.55 mL, 6.0 mmol/L)加入到50 mL带有冷凝装置的三口瓶中, 并向其中加入25 mL的冰乙酸作为溶剂, 升温至沸腾回流, 不断搅拌.在反应过程中, 用薄层色谱(TLC)跟踪检测[展开剂为乙酸乙酯和石油醚, V(乙酸乙酯):V(石油醚)＝3:7], 反应进行10 h后, 反应完全, 停止反应, 冷却至室温.在三口瓶内加入50 mL水, 并置于200 mL的烧杯中, 用质量分数5%的NaHCO₃水溶液将pH值调节至6, 有固体析出; 抽滤, 滤饼用水洗涤, 收集滤饼, 干燥, 得到粗产物.用乙酸乙酯与石油醚(体积比1:3)的混合溶剂将粗产物重结晶, 得到淡粉色粉末状固体PIP-o-OH, 产率85%. m.p. 168~171 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 11.82 (s, 1H, OH), 8.96 (d, J＝8.4 Hz, 1H, ArH), 8.91 (d, J＝8.4 Hz, 1H, ArH), 8.61 (d, J＝7.2 Hz, 1H, ArH), 7.81 (t, J＝7.2 Hz, 1H, ArH), 7.66~7.75 (m, 6H, ArH), 7.58 (t, J＝7.2 Hz, 1H, ArH), 7.35 (t, J＝7.2 Hz, 1H, ArH), 7.22~7.24 (m, 1H, ArH), 7.02~7.06 (m, 2H, ArH), 6.94 (d, J＝7.8 Hz, 1H, ArH), 6.66 (t, J＝7.2 Hz, 1H, ArH); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ: 138.5, 135.3, 131.4, 130.8, 129.3, 128.2, 127.3, 126.4, 125.9, 125.9, 124.2, 122.3, 120.7, 118.7, 117.1, 115.6; IR (KBr) v: 3435, 3051, 1610, 1585, 1493, 1481, 757 cm^–1. Anal. calcd for C₂₇H₁₉N₂O: C 83.92, H 4.69, N 7.25; found C 83.54, H 4.66, N 7.15; HRMS calcd for C₂₇H₁₉N₂O (M+H)⁺: 387.1497, found 387.1483.

  3.3   探针PIP-o-OH的单晶培养与测定

  以乙酸乙酯和石油醚的混合物为溶剂, 自然挥发5 d后得到适合X射线单晶衍射的晶体.在Bruker Rigaku Saturn 70 CCD X射线单晶衍射仪上, 在128(2) K温度下, 采用Mo Kα射线(λ＝0.071073 nm)收集衍射数据, 选用I＞2σ(I)的衍射点进行单晶结构分析.晶体结构解析用SHELXS-2018/3和SHELXL-2018/3程序进行.晶体数据已在英国剑桥数据中心沉积(CCDC 1918757).

  辅助材料(Supporting Information) 实验用的试剂与仪器以及细胞毒性测试实验, 探针PIP-o-OH的单晶数据表, ¹H NMR、¹³C NMR、IR、HRMS图谱, 探针PIP-o-OH荧光光谱性能图, DLS曲线, 细胞兼容性图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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  图 1  探针PIP-o-OH的分子结构图(a)和堆积图(b)

  Figure 1  Molecule structure (a) and packing arrangement (b) of probe PIP-o-OH

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  图 2  不同溶剂中PIP-o-OH的紫外吸收(a)和荧光发射光谱图(b) (20 μmol/L)

  Figure 2  Absorption (a) and fluorescence spectra (b) of PIP-o-OH (20 μmol/L) in different solvents

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  图 3  PIP-o-OH (20 μmol/L)在不同体积比例的DMF/H₂O (a)和MeOH/H₂O (b) (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)溶液中的荧光光谱变化图谱

  Figure 3  Changes of fluorescence spectra of PIP-o-OH (20 μmol/L) in different volume ratios of DMF/H₂O (a) and MeOH/H₂O (b)

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  图 4  PIP-o-OH (20 μmol/L)在不同体积比例的DMF/H₂O (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)液中的日光(a)、紫外灯(b)及红色激光笔(c)照射下的“裸眼”观察图

  Figure 4  "Naked eye" pictures of PIP-o-OH illuminated by daylight (a), UV lamp (b) and red laser pointer (c) in different proportions of DMF/H₂O (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)

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  图 5  PIP-o-OH在水的体积分数为70% (a)、80% (b)、90% (c)的DMF/H₂O (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)混合溶液中形成聚集体的SEM图

  Figure 5  SEM images of PIP-o-OH in DMF/H₂O (Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4) mixtures with different water fraction of 70% (a), 80% (b) and 90% (b)

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  图 6  (a) 探针PIP-o-OH (20 μmol/L)在MeOH/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)溶液与不同金属离子(200 μmol/L)作用的荧光变化图; (b)其它金属离子(1 mmol/L)与Fe³⁺ (1 mmol/L)共存时探针PIP-o-OH溶液(20 μmol/L)的荧光光谱图

  Figure 6  (a) Changes of emission spectra of PIP-o-OH (20 μmol/L) in MeOH/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4) solution with various cations (200 µmol/L); (b) fluorescence spectra of PIP-o-OH (20 μmol/L) in MeOH/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4) solution with Fe³⁺ (1 mmol/L) and other interfered cations (1 mmol/L)

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  图 7  (a) 探针PIP-o-OH (20 μmol/L)在MeOH/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4)溶液随Fe³⁺浓度(0~1 mmol/L)增加的荧光光谱图; (b)探针PIP-o-OH (20 μmol/L)识别Fe³⁺ (1 mmol/L)的荧光强度-时间变化曲线

  Figure 7  (a) Fluorescence spectra of PIP-o-OH (20 μmol/L) in MeOH/H₂O (V:V＝1:9, Hepes 10 μmol/L, pH＝7.4) solution with the increasing of Fe³⁺ (0~1 mmol/L); (b) time-dependent fluorescence intensity changes of PIP-o-OH (20 μmol/L) upon addition of Fe³⁺ (1 mmol/L)

  Insert: standard curve of the fluorescent intensity in range of Fe³⁺ concentration from 0 to 5 μmol/L

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  图 8  探针PIP-o-OH及PIP-o-OH-Fe³⁺结构优化及能量计算图

  Figure 8  Optimization stationary structures and energy calculation for PIP-o-OH and PIP-o-OH-Fe³⁺ complex

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  图 9  PIP-o-OH-Fe³⁺络合物的扫描电镜图

  Figure 9  SEM image of PIP-o-OH-Fe³⁺ complex

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  图 10  PIP-o-OH和PIP-o-OH-Fe³⁺络合物在HeLa细胞中的荧光成像图

  Figure 10  Fluorescence images of HeLa cells treated with PIP-o-OH and PIP-o-OH-Fe³⁺

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  表 1  探针PIP-o-OH对水样中Fe³⁺离子浓度检测结果

  Table 1.  Detection results of Fe³⁺ in real water samples using the probe PIP-o-OH

  水样	c(Fe3+)/(μmol•L－1)		Recovery/%	RSD/%
  	加入值	测定值
  自来水	1	1.03	103.0	1
  	3	2.86	95.3	0.32
  	5	4.93	98.6	0.65
  瓶装水	1	0.95	95.0	1.12
  	3	2.95	98.3	0.52
  	5	4.89	97.8	0.23

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