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• 小连翘Hypericum erectum Thunb为藤黄科金丝桃属植物, 该属植物在全球约有500种, 我国约有50种, 主要分布在华东和台湾地区.小连翘性苦, 味平, 具有抗菌消炎和收敛止血等功效, 用于治疗外伤出血、疔疮肿毒、毒蛇咬伤等^{[1, 2]}.前期国内外学者对小连翘化学成分进行了研究, 发现其主要的化学成分包括间苯三酚、黄酮和酮等多种结构类型^[3~5].药理活性的研究发现, 部分化合物具有抗幽门螺旋杆菌^[6]和抗疟原虫^[7]等生物活性.

  为了进一步从金丝桃属植物中寻找结构新颖的天然产物^[8], 本工作对小连翘的化学成分进行了系统的研究.从其地上部分的氯仿提取物中分离得到18个化合物, 其中hyperipyone (1), hyperiflavone (2)和hyperalcohol (3) (图 1)为新化合物, 分别属于吡喃酮、黄酮和脂肪醇类.另外, 还分离得到了15个已知化合物, 包括8个呫吨酮、1个芳香酸、3个间苯三酚、2个呋喃酮和1个倍半萜.本文报道这些化合物的提取分离、结构鉴定以及抗炎活性的筛选.

  图 1

  

  图 1.  化合物1~3结构式

  Figure 1.  Structures of compounds 1~3

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  1.   结果与讨论

  1.1   化合物的结构鉴定

  化合物1, 黄色粉末, m.p. 197~201 ℃; 比旋光度[α]_D²⁰+226.42 (c 0.74, MeOH).由HR-ESI-MS得到准分子离子峰m/z: 273.11203 [M+H]⁺(计算值273.11214), 推断化合物的分子式为C₁₆H₁₆O₄, 不饱和度为9. ¹H NMR显示1存在1个苯环的AA'XX'自旋系统[δ_H 7.73 (d, J＝9.0 Hz, 2H), 6.86 (d, J＝9.0 Hz, 2H)]、1个双键质子信号[δ_H 6.67 (s, 1H)]、1个连氧次甲基信号[δ_H 4.61 (q, J＝6.6 Hz, 1H)]和3个甲基信号[δ_H 1.40 (d, J＝6.6 Hz, 3H), 1.38 (s, 3H), 1.20 (s, 3H)]. ¹³C NMR谱显示该化合物有16个碳原子, 结合DEPT谱, 说明该化合物含有1个共轭酯羰基的信号[δ_C 163.6 (s)]、3个sp²杂化的季碳[δ_C 109.1 (s), 172.9 (s), 165.3 (s)]、1个sp²杂化的次甲基信号[δ_C 92.7 (d)]和1个sp³杂化的次甲基信号[δ_C 93.8 (d)], 同时还有1个对羟基苯基[δ_C 2×116.9 (d), 2×128.9 (d), 162.0 (s), 123.9 (s)]和3个甲基[δ_C 14.9 (q), 20.6 (q), 25.9 (q)]信号.将该化合物的¹H NMR, ¹³C NMR数据和文献[9]报道的化合物Japopyrone A对比, 发现二者具有相同的6-取代-2, 3, 3-三甲基-2H-2, 3-二氢呋喃并[3, 2-c]吡喃-4-酮母核, 差别仅仅在于C-2的构型和苯环的取代方式不同. HMBC谱(图 2)中, H-2′, 6′ (δ_H 7.73)与C-6 (δ_C 165.3), C-4′ (δ_C 162.0)相关, 说明对羟基苯基连接在α-吡喃酮的C-6位. H₃-9 (δ_H 1.38), H₃-10 (δ_H 1.20)和H₃-8 (δ_H 1.40)分别与C-3 (δ_C 43.8)相关, H-2 (δ_H 4.61)与C-3, C-3a (δ_C 109.1), C-7a (δ_C 172.9), C-8 (δ_C 14.9), C-9和C-10相关, 说明2, 3, 3-三甲基二氢呋喃环在C-3a和C-7a位同吡喃酮母核稠和, 同时在C-2和C-7a位形成醚键, 可确定该化合物的平面结构如图 1所示.将化合物1的CD图谱与文献所报道的japopyrone A^[9]比较, 发现1在210, 260和351 nm处均出现正的cotton效应, 与文献报道的japopyrone A [211 (Δε －0.79), 252 (Δε －0.10), 355 (Δε －0.18) nm]相反, 因此确定C-2的绝对构型为R.综上所述, 推断化合物1为(2R)-6-(4-羟基苯基)-2, 3, 3-三甲基-2H-2, 3-二氢呋喃并[3, 2-c]吡喃-4-酮, 将其命名为hyperipyone.

  图 2

  

  图 2.  化合物1~3的关键HMBC与¹H-¹H COSY相关

  Figure 2.  Key HMBC and ¹H-¹H COSY correlations of compounds 1~3

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  化合物2, 黄色粉末, m.p. 210~212 ℃.由HR-ESI-MS得到准分子离子峰m/z: 383.11295 [M+H]⁺(计算值383.11253), 推断化合物的分子式为C₂₁H₁₈O₇, 不饱和度为13. ¹H NMR显示存在1个苯环的AMX系统δ_H 8.21 (d, J＝1.8 Hz, 1H)、7.38 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 7.82 (dd, J＝1.8, 8.4 Hz, 1H)、1个芳香质子δ_H 6.52 (s, 1H)、1个2, 2-二甲基-2H-吡喃环[δ_H 5.66 (d, J＝10.2 Hz, 1H), 6.92 (d, J＝10.2 Hz, 1H), 1.45 (s, 6H)]和1个甲氧基δ_H 3.89 (s, 3H); ¹³C NMR显示该化合物有21个碳原子, 结合DEPT谱, 有1个共轭羰基的信号[δ_C 179.5 (s)]、10个sp²杂化的季碳[δ_C 160.0 (s), 157.2 (s), 156.8 (s), 151.4 (s), 156.8 (s), 147.7 (s), 139.2 (s), 122.4 (s), 106.7 (s), 105.8 (s)]和4个sp²杂化的次甲基信号[δ_C 95.6 (d), 117.2 (d), 117.2 (d), 122.1 (d)].综合文献[10]报道的数据, 可知存在一个黄酮骨架, 除去黄酮骨架上的15个碳原子外, 还存在一个2, 2-二甲基-2H-吡喃环[δ_C 129.1 (d), 116.2 (d), 78.6 (s), 2×28.6 (q)]和一个甲氧基[δ_C 60.3 (q)]. HMBC图谱(图 2)显示, H-3 (δ_H 5.66)与C-4a (δ_C 105.8)相关, H-4 (δ_H 6.92)与C-4a和C-10a (δ_C160.0)相关, 说明2, 2-二甲基-2H-吡喃环在C-4a和C-10a位同黄酮母核稠和, 同时在C-10a和C-2位形成醚键. MeO (δ_H 3.89)与C-7 (δ_C 139.2)相关, 可知在C-7位上有一个甲氧基, 根据C环存在一个AMX自旋系统以及相关的HMBC, 推测两个羟基分别位于C-3′和C-4′位, 综上所述, 推断化合物2的结构为为8-(3, 4-二羟基苯基)-5-羟基-7-甲氧基-2, 2-二甲基-2H, 6H-吡喃并[3, 2-g]色烯-6-酮, 命名为hyperiflavone.

  化合物3, 无色油状物, 比旋光度[α]_D²⁰－24.44 (c 0.15, MeOH).由HR-ESI-MS得到准分子离子峰m/z: 199.16939 [M+H]⁺(计算值: 199.16926), 推断化合物的分子式为C₁₂H₂₂O₂, 不饱和度为2. ¹³C NMR显示6个碳信号, 说明3为对称结构, 根据对称结构的特点, 我们以其结构的一半为例进行讨论, NMR的数据显示该化合物有1个乙烯基[δ_H 5.91 (dd, J＝10.8, 17.4 Hz), 5.21 (dd, J＝1.8, 17.4 Hz), 5.04 (dd, J＝1.8, 10.8 Hz); δ_C 146.2 (d), 112.4 (t)]、1个甲基信号[δ_H 1.25 (s); δ_C 27.8 (q)]、1个连氧季碳[δ_C 73.8 (s)]以及两个亚甲基信号[δ_H 2.18 (m), 1.59 (m); δ_C 24.5 (t), 42.3 (t)], 由¹H-¹H COSY和HSQC推测存在CH₂CH₂结构片段.结合HMBC谱(图 2)显示的信息, H-1 (δ_H 5.21, 5.04), H-2 (δ_H 5.91), H₃-11 (δ_H 1.25)和H₂-4 (δ_H 1.59)分别与C-3 (δ_C 73.8)相关, 说明甲基, 乙烯基和CH₂CH₂分别与季碳原子C-3相连, 由于C-3的化学位移在低场, 结合分子式, C-3位必然连接1个羟基.综上所述, 该化合物的平面结构如图 1所示.由于该化合物具有光学活性, 进一步推测化合物3为苏式-3, 8-二甲基癸烷-1, 9-二烯-3, 8-二醇, 命名为hyperalcohol.其余已知化合物的结构, 通过与文献的NMR数据对照, 分别鉴定为isocudraniaxanthone A (4)^[11], isocudraniaxanthone B (5)^[11], 2-deprenyl-rheedia- xanthone B (6)^[12], 5-O-methyl-2- deprenylrheediaxanthone B (7)^[12], 6-脱氧异巴西红厚壳素(8)^[13], 异巴西红厚壳素(9)^[12], hyperireflexin (10)^[14], 4-羟基呫吨酮(11)^[15], 3-乙氧基-4-羟基苯甲酸(12)^[16], 1-[5, 7-dihydroxy-2-methyl-2-(4-methylpent-3-enyl)chroman-8-yl]-2-methylpropan-1-one (13)^[17], empetrikarinol (14)^[17], 3-geranyl-1-(2′-methanpropanoyl)phloroglucinol (15)^[18], (4S, 5S)-5-(4′-methyl-3′-pentenyl)-4-hydroxy-5-methyldihydrofuran-2-one (16)^[19], (4S, 5R)-5-(4′-methyl-3′-pentenyl)-4-hydroxy-5-methyldihydrofuran-2-one (17)^[19], 3-羟基-β-紫罗兰酮(18)(图 3)^[20].

  图 3

  

  图 3.  化合物4~18结构式

  Figure 3.  Structures of compounds 4~18

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  1.2   化合物的生物活性

  以脂多糖(LPS)诱导体外培养的小鼠巨噬细胞株RAW264.7为体外炎症模型, 通过Griess法检测细胞培养上清液中一氧化氮(NO)量, 测试了化合物1~17的抗炎活性.结果表明, hyperiflavone (2)、isocudraniaxan- thone B (5)和2-deprenylrheediaxanthone B (6)表现出对NO分泌的抑制活性, 其IC₅₀分别为12.90, 16.24和9.86 μmol·L^－1.

  表 1

  

  表 1  化合物1~17对LPS诱导的RAW264.7细胞产生NO的抑制作用

  Table 1.  Inhibitory effects of compounds 1~17 against LPS-induced NO production in RAW264.7 cells

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  Compd.	IC50/(μmol·L－1)	Cell viability a/%
  1	＞20	88.14
  2	12.90	85.90
  3	＞20	95.77
  4	＞20	66.08
  5	16.24	86.15
  6	9.86	89.75
  7	＞20	112.54
  8	＞20	90.15
  9	＞20	93.90
  10	＞20	90.58
  11	＞20	83.45
  12	＞20	90.80
  13	＞20	98.75
  14	＞20	89.75
  15	＞20	97.38
  16	＞20	102.81
  17	＞20	101.61
  地塞米松	9.58	96.35
  a c＝20 μmol·L－1.

  2.   结论

  利用各种现代分离技术, 从小连翘乙醇提取物中分离得到18个化合物, 其中以酮和间苯三酚类成分为其主要的结构类型, 三个新化合物分别属于α-吡喃酮、黄酮醇和脂肪醇类化合物, 化合物hyperiflavone (2)、isocudraniaxanthone B (5)和2-deprenylrheediaxanthone B (6)表现出一定的抗炎活性, 说明该植物发挥抗炎活性的物质基础可能是黄酮类化合物, 为后续开发该药用植物提供科学依据.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  核磁共振仪(BrukerAM-600型); 质谱仪(Thermo/Q Exactive型); 高效液相色谱仪(Ultimate 3000 HPLC系统); 半制备型色谱柱(YMC-Pack ODS-A (250 mm×10 mm, 5 μm)); 薄层色谱硅胶(青岛海洋化工厂产品); RP-18反相硅胶(日本YMC公司, 50 μm); 电子天平(JA2103型, 上海明桥精密科学仪器有限公司); X-4数字显示显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司); 净化工作台(SW-CJ-2FD型苏州博莱尔净化设备有限公司); 二氧化碳培养箱(MCO-5AC型日本三洋公司); 全波长酶标仪(Multiskan GO型美国Thermo Fisher公司); 倒置显微镜(E200型日本Nikon公司).石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、甲醇(分析纯), 国药集团; 甲醇(色谱级), Sigma公司; 乙腈(色谱级), 中国昌泰兴业有限公司; LPS、地塞米松、二甲亚砜, 美国sigma公司; 高糖DMEM培养基、青霉素-链霉素溶液, 美国GE公司; 胰酶(质量分数为0.25%)、胎牛血清, 美国Gibco公司; 一氧化氮检测试剂盒、CCK-8试剂盒, 上海碧云天生物技术有限公司.

  3.2   植物材料

  小连翘2016年7月采于湖北宣恩七姊妹山国家级自然保护区(N 30°02′07.51″; E 109°43′42.77″′), 经中南民族大学生命科学学院刘虹副教授鉴定为藤黄科金丝桃属植物小连翘(Hypericum erectum Thunb), 植物标本现保存于中南民族大学生命科学学院标本室, 编号为20160709.

  3.3   提取与分离

  取小连翘地上部分3.0 kg, 粉碎后用体积分数为95%乙醇冷浸提取, 减压浓缩提取液, 得乙醇提取物410 g, 将乙醇提取物溶于水后, 然后用氯仿萃取三次, 减压浓缩, 得氯仿提取物.将得到的氯仿提取物(147.9 g)进行正相硅胶柱层析, 用石油醚-乙酸乙酯(体积比19:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 1:1, 3:7, 2:8, 0:1)梯度洗脱, 薄层色谱(TLC)检测合并, 得到13个组分(记作Fr.A~Fr.M), 将Fr.F (8.18 g)进行反相硅胶色谱柱层析, 依次用甲醇-水(体积比3:7, 1:1, 7:3, 8:2, 1:0)梯度洗脱, TLC检测合并, 得到12个组分(Fr.F-1~Fr.F-12). Fr.F-12重结晶得到8 (2.17 mg). Fr.H (4.20 g)进行反相硅胶色谱柱层析, 依次用水-甲醇(体积比7:3, 1:1, 3:7, 2:8, 0:1)梯度洗脱, TLC检测合并, 得到11个组分(Fr.H-1~Fr.H-11), Fr.H-5 (31.3 mg)经HPLC(甲醇-水体积比为71:29)制备得到11 (2.0 mg, t_R＝12.4 min), Fr.H-9 (90.1 mg)经HPLC(甲醇-水体积比为75:25)制备得到化合物5 (8.0 mg, t_R＝26.0 min)和7 (2.0 mg, t_R＝33.0 min), Fr.H-11 (463.6 mg)经半制备HPLC(乙腈-水体积比为74:26, 检测波长220 nm)得到化合物13 (1.0 mg, t_R＝12.1 min)、14 (2.7 mg, t_R＝29.7 min)和15 (4.7 mg, t_R＝19.4 min). Fr.I (4.54 g)进行反相硅胶色谱柱层析, 依次用水-甲醇(体积比为7:3, 1:1, 3:7, 2:8, 0:1)梯度洗脱, TLC检测合并, 得到7个组分(Fr.I-1~Fr.I-7), Fr.I-1 (50.0 mg)经HPLC(甲醇-水体积比为35:65, 检测波长220 nm)得到化合物3 (1.7 mg, t_R＝50.4 min)和12 (1.9 mg, t_R＝33.7 min), Fr.I-3 (30.0 mg)经HPLC(甲醇-水体积比为49.5:50.5)得到化合物18 (4.0 mg, t_R＝19.1 min), Fr.I-4 (210.0 mg)经HPLC(甲醇-水50:50, 检测波长220 nm)得到化合物16 (9.0 mg, t_R＝26.2 min)和17 (24.1 mg, t_R＝27.0 min), Fr.I-6 (230.0 mg)经HPLC(甲醇-水体积比为65:35)得到化合物1 (8.7 mg, t_R＝20.2 min)、4 (3.8 mg, t_R＝26.4 min)和10 (1.9 mg, t_R＝19.4 min), Fr.I-7 (960.0 mg)经HPLC(甲醇-水体积比为79.5:20.5, 检测波长220 nm)得到化合物2 (14.1 mg, t_R＝18.3 min)、6 (6.3 mg, t_R＝12.8 min)和9 (2.5 mg, t_R＝13.5 min).

  Hyperipyone (1):黄色粉末, m.p. 197~201 ℃; [α]_D²⁰+226.42 (c 0.07, MeOH); UV (MeOH) λ [log ε/(L·mol^－1·cm^－1)]: 235 (3.16), 290 (3.85), 350 (4.18) nm; ECD (c 2.7×10^－3 mol·L^－1, MeOH) [[θ]/(deg·cm²· dmol^－1)]: 344 (+3.90), 257 (+4.24), 208 (+27.56) nm; ¹H NMR (600 MHz, CD₃OD) δ: 4.61 (q, J＝6.6 Hz, 1H, H-2), 6.67 (s, 1H, H-7), 7.73 (d, J＝9.0 Hz, 2H, H-2′, 6′), 6.86 (d, J＝9.0 Hz, 2H, H-3′, 5′), 1.40 (d, J＝6.6 Hz, 3H, H₃-8), 1.38 (s, 3H, H₃-9), 1.20 (s, 3H, H₃-10); ¹³C NMR (150 MHz, CD₃OD) δ: 93.8 (C-2), 43.8 (C-3), 109.1 (C-3a), 163.6 (C-4), 165.3 (C-6), 92.7 (C-7), 172.9 (C-7a), 14.9 (C-8), 25.9 (C-9), 20.6 (C-10), 123.9 (C-1′), 128.9 (C-2′, 6′), 116.9 (C-3′, 5′), 162.0 (C-4′); HRESIMS calcd for C₁₆H₁₇O₄ [M+H]⁺ 273.11214, found 273.11203.

  Hyperiflavone (2):黄色粉末, m.p. 210~212 ℃; UV (MeOH) λ [log ε/(L·mol^－1·cm^－1)]: 210 (2.88), 255 (3.01), 345 (3.09) nm; ¹H NMR (600 MHz, C₅D₅N) δ: 6.52 (s, 1H, H-10), 1.45 (s, 6H, 2×CH₃), 5.66 (d, J＝10.2 Hz, 1H, H-3), 6.92 (d, J＝10.2 Hz, 1H, H-4), 3.89 (s, 3H, 7-OCH₃), 8.21 (d, J＝1.8 Hz, 1H, H-2′), 7.38 (d, J＝8.4 Hz, 1H, H-5′), 7.82 (d, J＝8.4, 1.8 Hz, 1H, H-6′); ¹³C NMR (150 MHz, C₅D₅N) δ: 157.2 (C-8), 139.2 (C-7), 179.5 (C-6), 156.8 (C-5), 105.8 (C-4a), 160.0 (C-10a), 95.6 (C-10), 156.8 (C-9a), 106.7 (C-6a), 78.6 (C-2), 28.6 (2-CH₃), 129.1 (C-3), 116.2 (C-4), 60.3 (7-OCH₃), 122.4 (C-1′), 117.2 (C-2′, 5′), 147.7 (C-3′), 151.4 (C-4′), 122.1 (C-6′); HRESIMS calcd for C₂₁H₁₉O₇ [M+H]⁺ 383.11253, found 383.11295.

  Hyperalcohol (3):无色油状物. UV (MeOH) λ: 220 (3.43) nm; [α]_D²⁰－24.44 (c 0.15, MeOH); ¹H NMR (600 MHz, CD₃OD) δ: 5.21 (dd, J＝1.8, 17.4 Hz, 2H, H-1, 10), 5.04 (dd, J＝1.8, 10.8 Hz, 2H, H-1, 10), 5.91 (dd, J＝10.8, 17.4 Hz, 2H, H-2, 9), 1.56~1.64 (m, 2H, H-4, 7), 2.12~2.25 (m, 2H, H-5, 6), 1.25 (s, 3H, H₃-11, 12); ¹³C NMR (150 MHz, CD₃OD) δ: 112.4 (C-1, 10), 146.2 (C-2, 9), 73.8 (C-3, 8), 42.3 (C-4, 7), 24.5 (C-5, 6), 27.8 (C-11, 12); HRESIMS calcd for C₁₂H₂₃O₂ [M+H]⁺ 199.16926, found199.16939.

  3.4   生物活性测试

  以LPS诱导体外培养的小鼠巨噬细胞株RAW264.7为体外炎症模型, 采用CCK-8法对化合物进行体外细胞毒活性测试.采用Griess法检测细胞培养上清液中NO的含量, 计算抑制率. CCK-8^[21]法:将处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞调整密度至5×10³个/mL, 每孔100 μL接种于96孔板.在37 ℃, 体积分数为5% CO₂的培养条件下培养过夜后, 吸出96孔中的培养液, 然后每孔加入200 μL含有不同浓度梯度化合物(20, 10, 5, 2.5, 1.25 μmol·L^－1)的培养液, 设置空白孔和对照孔. 24 h后, 吸出培养液, 加入含体积分数为10%的CCK-8溶液的培养液100 μL. 37 ℃孵育1 h, 在450 nm波长下检测吸光度, 计算细胞存活率.细胞存活率大于80%展开抗炎活性研究. Griess^[22]法:将RAW264.7细胞按照上述实验的条件接种于96孔板中. 12 h后吸出培养液, 加入1 μg·mL^－1 LPS以及不同浓度的单体化合物共同作用, 单独加入LPS的为模型组. 37 ℃, 体积分数为5% CO₂孵育24 h.吸取50 μL的细胞培养上清液, 与反应试剂混合, 用酶标仪检测540 nm处的吸光度, 空白对照组为等量DMEM培养液.通过标准曲线将吸光度换算成浓度, 计算NO抑制率, 抑制率大于50%视为有活性, 用graphpad prism 5.0计算IC₅₀, 选择地塞米松为阳性药.

  辅助材料(Supporting Information)   化合物1~3的¹H NMR, ¹³C NMR, HSQC, HMBC, ¹H-¹H COSY谱和HR-ESIMS谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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  图 1  化合物1~3结构式

  Figure 1  Structures of compounds 1~3

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  图 2  化合物1~3的关键HMBC与¹H-¹H COSY相关

  Figure 2  Key HMBC and ¹H-¹H COSY correlations of compounds 1~3

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  图 3  化合物4~18结构式

  Figure 3  Structures of compounds 4~18

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  表 1  化合物1~17对LPS诱导的RAW264.7细胞产生NO的抑制作用

  Table 1.  Inhibitory effects of compounds 1~17 against LPS-induced NO production in RAW264.7 cells

  Compd.	IC50/(μmol·L－1)	Cell viability a/%
  1	＞20	88.14
  2	12.90	85.90
  3	＞20	95.77
  4	＞20	66.08
  5	16.24	86.15
  6	9.86	89.75
  7	＞20	112.54
  8	＞20	90.15
  9	＞20	93.90
  10	＞20	90.58
  11	＞20	83.45
  12	＞20	90.80
  13	＞20	98.75
  14	＞20	89.75
  15	＞20	97.38
  16	＞20	102.81
  17	＞20	101.61
  地塞米松	9.58	96.35
  a c＝20 μmol·L－1.

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