光学纯脱氢枞胺杂环衍生物与DNA作用及初步细胞毒活性

屠双燕 徐武双 齐芬 何卫江 费宝丽

引用本文: 屠双燕, 徐武双, 齐芬, 何卫江, 费宝丽. 光学纯脱氢枞胺杂环衍生物与DNA作用及初步细胞毒活性[J]. 有机化学, 2019, 39(11): 3269-3276. doi: 10.6023/cjoc201904003 shu
Citation:  Tu Shuangyan, Xu Wushuang, Qi Fen, He Weijiang, Fei Baoli. Interaction of Optically Pure Dehydroabietylamine Heterocyclic Derivatives with DNA and Preliminary Cytotoxic Activity[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2019, 39(11): 3269-3276. doi: 10.6023/cjoc201904003 shu

光学纯脱氢枞胺杂环衍生物与DNA作用及初步细胞毒活性

    通讯作者: 何卫江, hgfbl@njfu.edu.cn; 费宝丽, heweij69@nju.edu.cn
  • 基金项目:

    江苏省高等学校自然科学研究重大项目(No.18KJA150006)、广西师范大学省部共建药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室(No.CMEMR2018-B13)资助项目

摘要: 根据活性叠加原理,在天然产物松香的改性产品光学纯脱氢枞胺(1)的B环和C环中引入不同的芳香杂环,合成了三个光学纯脱氢枞基杂环衍生物,乙酰脱氢枞胺-6,7-(3-巯基)-1,2,4-三嗪(5)、乙酰脱氢枞胺-6,7-吲哚(7)和12-(2-氨基噻唑)乙酰脱氢枞胺(10).荧光光谱和圆二色谱分析证明,化合物5、710均能够与DNA发生作用,且作用强度为5 > 10 > 7.凝胶电泳实验结果表明,5、710都能够对pBR 322质粒DNA进行单链切割且5的切割能力最强.另外,脱氢枞胺及化合物5、710与氯化铜的复配物(32 μmol/L)对人乳腺肿瘤细胞MCF-7的增殖抑制率,分别为86.0%(1),86.7%(5),34.4%(7)和0(10).

English

  • 脱氢枞胺是天然产物松香的重要改性产品之一[1], 是含有三个手性碳原子的菲结构[2], 其衍生物具有抗菌、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等生物活性[3~6].对脱氢枞胺进行改性并拓展其应用领域, 一直是林产化学与工业的前沿研究课题.含N杂环化合物在药物的研究领域举足轻重[7], 例如三嗪类化合物具有抗结核、抗病毒、抗菌和抗炎等活性[8]; 吲哚作为自然界中广泛分布的杂环之一, 具有广泛的药理功能[9]. 2-氨基噻唑及其各种衍生物经常被用来合成各种生物活性分子的前体[10].因此, 根据活性叠加原理, 将脱氢枞胺和上述含氮杂环进行拼接, 可能会获得生物活性良好的化合物.

    DNA是抗肿瘤药物的重要作用靶点之一.抗肿瘤药物通过与肿瘤细胞的DNA作用, 抑制DNA复制, 引起DNA损伤, 进而阻断细胞分裂并最终导致细胞死亡.以顺铂为代表的靶向DNA的铂类金属基抗肿瘤药物在临床上获得了极大的成功[11].相比于金属配合物与DNA作用的机理研究取得的巨大进步, 作为抗肿瘤药物重要组成部分的有机小分子与DNA相互作用的研究还没有得到足够的重视, 需要大力地研究以明确其抗肿瘤机理.

    据统计, 1940~2014间批准上市的抗肿瘤药物, 质量分数约为37%的抗肿瘤药物来自于天然产物及其衍生物[12].以文卡生物碱、紫杉碱、鬼臼毒素和喜树碱为代表的抗肿瘤药物, 使得植物成为抗肿瘤制剂的重要来源.

    综上所述, 本文对脱氢枞胺的环B与C进行了改性, 设计、合成了如Scheme 1所示的3个光学纯含氮脱氢枞基杂环化合物, 乙酰脱氢枞胺-6, 7-(3-巯基)-1, 2, 4-三嗪(5)、乙酰脱氢枞胺-6, 7-吲哚(7)和12-(2-氨基噻唑)-乙酰脱氢枞胺(10).并采用荧光光谱、圆二色光谱及DNA凝胶电泳实验, 探讨了标题脱氢枞胺杂环衍生物5710与DNA作用的模式.通过噻唑蓝(MTT)法测试了它们及其协同氯化铜对MCF-7肿瘤细胞的增殖抑制作用.本研究将为新型脱氢枞胺衍生物的设计、合成及生物活性研究提供理论参考和实验数据.

    图式 1

    图式 1.  目标化合物的合成路线
    Scheme 1.  Synthesis route of target compounds

    以提纯后的光学纯脱氢枞胺(1)为母体, 经过乙酰化、氧化、溴代得到乙酰脱氢枞胺-6-溴-7-酮(4), 然后与硫代氨基脲在N, N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应得到目标产物乙酰脱氢枞胺-6, 7-(3-巯基)-1, 2, 4-三嗪(5).中间体乙酰脱氢枞胺-7-酮(3)与苯肼盐酸盐在乙醇溶液中经催化、闭环可得到乙酰脱氢枞胺-6, 7-吲哚(7).乙酰脱氢枞胺(2)经催化、溴代、闭环可得到12-(2-氨基噻唑)-乙酰脱氢枞胺(10).最后经柱层析提纯, 得到的产物产率适中.化合物5, 710均保留了1的手性中心.

    溴化乙锭(EB)是具有共轭芳香环的平面荧光分子, 在溶液中会发生荧光猝灭. DNA本身没有荧光, 当溶液中形成DNA-EB复合物时, EB由于插入了DNA碱基对之间, 受到疏水性保护从而使其荧光增强.因此, EB常作为研究小分子与DNA相互作用模式的荧光探针.在EB-DNA-小分子化合物体系中, 如果小分子也能与DNA发生类似于EB的插入作用, EB与DNA的结合位点会被小分子占据, 就有EB分子游离出来, 体系的荧光强度减弱.化合物56710对鲑鱼精DNA-EB体系荧光光谱的影响如图 1所示. DNA-EB体系的荧光强度随着化合物浓度的增加而减弱, 表明化合物与DNA发生了作用[13].根据Stern-Volmer方程F0/F=1+KSVCQ, 可以计算出化合物对DNA-EB体系的荧光猝灭常数KSV; 以F0/FCQ作图, 其线性拟合斜率即为KSV.化合物56710KSV值分别为1.32×105、9.68×104、1.08×105、1.25×105 mol•L-1, 这些数值提示作用模式可能是插入作用[14], 且作用强度依次是51076.

    图 1

    图 1.  化合物对鲑鱼精DNA-EB体系的荧光光谱的影响

    cDNA=1.0×10-4 mol•L-1; cQ=0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60 μmol•L-1

    Figure 1.  Effects of compounds on fluorescence spectra of salmon sperm DNA-EB system

    DNA是手性生物大分子, 其CD光谱在278 nm左右的特征正峰是由于DNA碱基对的π-π堆积作用产生的, 在249 nm左右的特征负峰是由DNA的右手螺旋结构引起的[15]. CD光谱是探测DNA构象变化的有效手段, 小分子化合物与DNA发生作用后, 会影响DNA的构象, 从而使得DNA的CD光谱发生变化.一般来说, 静电和沟槽作用对DNA正负吸收峰影响较小或没有影响, 而插入作用对正负吸收峰影响较大[16], CD光谱的变化也可以作为判断化合物与DNA结合模式的依据之一.在cDNA=0.1 mmol•L-1, 结合比率rc化合物/cDNA=0.12的条件下, 化合物56710对鲑鱼精DNA溶液CD光谱的影响如图 2所示.化合物56710均能使DNA溶液在278 nm处的正峰强度降低, 且降低幅度51076, 其中510分别使DNA的正峰发生了2和1 nm的红移. 710使负峰的强度降低且变化幅度107; 56使负峰的强度增强且变化幅度56.并且57分别使负峰发生了1 nm的蓝移和红移.这些数据表明56710都能够使DNA的构型发生一定的变化[16].

    图 2

    图 2.  化合物对鲑鱼精DNA溶液CD光谱的影响
    Figure 2.  Effects of compounds on CD spectra of salmon Sperm solution

    pBR 322质粒DNA通常有三种构型:闭环超螺旋型(Form I), 单链开环缺刻型(Form II), 双链断裂线型(Form III).不同构型的DNA分子量与空间结构紧密程度不同, 导致它们在凝胶电泳中的迁移速率Form I>Form III>Form II[17]. 图 3为不同浓度的化合物56710切割pBR 322 DNA的凝胶电泳图.

    图 3

    图 3.  化合物切割pBR 322质粒DNA的凝胶电泳图谱

    Lane 1: DNA; Lane 2: DNA+50 µmol•L-1 compounds 5, 6, 7 and 10; Lane 3: DNA+100 µmol•L-1 compounds 5, 6, 7 and 10; Lane 4: DNA+150 µmol• L-1 compounds 5, 6, 7 and 10

    Figure 3.  Gel electrophoresis patterns of compounds cleaved pBR 322 plasmid DNA

    图 3可以看出, 化合物5710都能对DNA进行切割, 特别是化合物5在高浓度时对DNA的切割活性显著增强, 缺刻型的Form II DNA浓度不断增加, 超螺旋型的Form I DNA持续减少[18].对于化合物6而言, 即使增加浓度, 也不会产生任何Form II或Form III DNA.因此, 化合物6不具备切割DNA的活性.凝胶电泳实验结果表明, 化合物5对pBR 322 DNA的切割活性最高, 化合物710的切割活性相似, 而化合物6则没有切割活性.这一结果和荧光光谱的结果一致.另外, 芳香杂环的结构及存在与否, 对脱氢枞基衍生物切割pBR 322质粒DNA的活性影响很大.

    采用噻唑蓝(MTT)法[19]测定了化合物5, 7, 10及其与CuCl2按1:1的物质的量比进行研磨得到的复配物对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用(24 h), 以临床用药顺铂(IC50=6.3 µmol•L-1)为阳性对照.结果表明, 化合物5710没有细胞毒活性; 在浓度为32 µmol• L-1时, 化合物1和CuCl2对MCF-7细胞增殖的抑制率分别为86.0%和5.9%, 化合物57与铜形成的复配物对MCF-7细胞的抑制率分别为86.7%和34.4%, 而化合物10的铜复配物则没有对MCF-7细胞的增殖产生抑制作用.另外, 化合物15的铜复配物对MCF-7细胞的半致死量IC50值分别为3.7和13.8 µmol•L-1.与氯化铜进行复配, 显著地提高了化合物157的细胞毒活性, 说明金属铜离子能够加强此类化合物杀伤肿瘤细胞的能力, 二者发生协同作用的原因, 很有可能是它们发生了配位作用, 这非常值得进行后续的深入研究.

    荧光光谱和圆二色光谱研究表明, 依据活性叠加原理设计、制备的3个新型的脱氢枞胺芳香杂环衍生物5710与鲑鱼精DNA发生了作用, 且作用能力5107.凝胶电泳实验证明化合物5710能够单链切割DNA, 切割能力与荧光光谱研究结果相吻合. MTT实验结果表明, 与氯化铜的协同作用大大增强了化合物57对MCF-7细胞的增殖抑制作用; 化合物5的铜复配物对MCF-7细胞的细胞毒活性远高于7的铜复配物.本研究表明在脱氢枞胺B环和C环上引入芳杂环, 可以获得具有良好生物活性的脱氢枞胺衍生物, 并且化合物的生物活性与改性后的结构关系密切.另外, 与铜离子复配能够显著改善化合物的细胞毒活性.

    Avance DRX-600核磁共振仪; Ls-55荧光光谱仪; 6310 Ionn Trap LC/MS; Jasco J-810型圆二色谱仪; Elementar Vario Micro型元素分析仪; DYY2-C-核酸电泳仪; PCR梯度仪; Bio-rad Universal Hood II S.N.76S凝胶成像仪; 恒温培养振荡器; Versa max型酶标仪; Thermo-3111二氧化碳培养箱; AllegraX-15R离心机; Olympus倒置荧光显微镜; Esco洁净工作台.

    歧化松香胺(广西桂林松泉林化工业有限公司, 含脱氢枞胺70%), 经纯化后使用[20], [α]D20+45 (c 0.10, CHCl3); 乙酸酐(上海阿拉丁试剂有限公司, 分析纯); 氨基硫脲, 硫脲, 苯肼盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司); pBR 322质粒DNA、鲑鱼精DNA(南京都莱生物科技有限公司), 其余试剂均为市售分析纯.

    3.2.1   乙酰脱氢枞胺(2)的合成

    在100 mL反应瓶中, 将1 (14.50 g, 50 mmol)溶解在乙酸(30 mL)中, 将乙酸酐(28 mL, 296 mmol)加入, 在室温下搅拌3 h后, 用氯仿(100 mL×3)萃取.萃取液用水洗至中性后, 用无水硫酸钠干燥, 滤液经减压蒸馏后得到粘稠状的2粗品, 经过硅胶柱层析纯化得14.22 g淡黄色油状物, 产率87%. [α]D20+31 (c 0.50, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 1.03 (s, 3H), 1.31~1.33 (m, 9H), 1.48~1.54 (m, 3H), 1.74~1.87 (m, 3H), 1.99 (t, J=7.8 Hz, 1H), 2.06 (s, 3H), 2.13 (d, J=2.4 Hz, 1H), 2.38 (d, J=12.6 Hz, 1H), 2.90~2.99 (m, 3H), 3.17 (q, 1H), 3.34 (q, 1H), 6.14 (s, 1H), 6.99 (s, 1H), 7.10 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.26~7.27 (d, J=8.4 Hz, 1H); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ: 18.7, 18.8, 19.0, 21.0, 23.4, 24.0, 25.3, 30.2, 33.5, 37.4, 37.5, 38.4, 45.2, 49.9, 123.8, 124.2, 126.9, 134.8, 145.6, 147.2, 170.7; MS (70 eV) m/z: 328.3 [M+H]+. Anal. calcd for C22H33NO: C 80.52, H 10.05, N 4.21; found C 80.68, H 10.16, N 4.28.

    3.2.2   乙酰脱氢枞胺-7-酮(3)的合成

    在100 mL反应瓶中, 将2溶解在(23.90 g, 70 mmol)乙酸(30 mL)中, 将15 mL三氧化铬溶液(12.00 g, 120 mmol)加入, 在0 ℃条件下搅拌4 h后, 用氯仿(100 mL×3)萃取.萃取液用水洗至中性后, 用无水硫酸钠干燥, 滤液减压蒸馏后得到粘稠状的3粗品.经过硅胶柱层析纯化得14.67 g黄色油状产物, 产率86%. [α]D20+51 (c 0.10, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 1.03 (s, 3H), 1.32 (t, J=7.2 Hz, 9H), 1.48~1.55 (m, 3H), 1.75 (d, J=13.8 Hz, 1H), 1.85 (t, J=13.2 Hz, 1H), 2.04 (s, 3H), 2.11 (s, 1H), 2.38 (d, J=12.6 Hz, 1H), 2.90~2.95 (m, 2H), 3.14 (q, 1H), 3.34 (q, 1H), 6.43~6.45 (t, J=5.4 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 7.09 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.27 (d, J=8.4 Hz, 1H); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ: 19.1, 21.0, 23.3, 24.1, 25.4, 33.5, 36.2, 37.4, 37.5, 38.4, 45.2, 50.0, 123.9, 124.2, 126.9, 134.9, 145.6, 147.3, 170.6; IR (KBr) ν: 3373, 3073, 2937, 1721, 1685, 1625, 1562, 1436, 1238 cm-1; MS (70 eV) m/z: 342.19 [M+H]+. Anal. calcd for C22H31NO2: C 77.42, H 9.38, N 4.11; found C 77.54, H 9.46, N 4.02.

    3.2.3   乙酰脱氢枞胺-6-溴-7-酮(4)的合成

    方法一:在100 mL反应瓶中, 将3 (1.67 g, 5 mmol)溶解在乙醇(30 mL)中, 再加入溴化铜固体(2.78g, 12.5 mmol), 所得混合物在搅拌条件下回流12 h.然后, 将反应液倒入水(200 mL)中, 用乙酸乙酯(100 mL×3)萃取.有机相用无水硫酸钠干燥后, 经减压蒸馏得到红棕色膏状的4.经过硅胶柱层析纯化得0.97 g黄色油状产物, 产率46%.

    方法二:在100 mL反应瓶中, 将3 (1.67 g, 5 mmol)溶解在乙酸(40 mL)中, 加入液溴(1.00 g, 6.25 mmol), 所得混合物在室温下搅拌过夜.反应结束后, 将反应液倒入饱和碳酸氢钠水溶液中, 用乙酸乙酯(100 mL×3)萃取.有机相用无水硫酸钠干燥后, 经减压蒸馏得到红棕色膏状的4粗品.经过硅胶柱层析纯化得1.53 g黄色油状产物, 产率73%. [α]D20+64 (c 0.10, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 1.15 (s, 3H), 1.21~1.25 (m, 9H), 1.41 (s, 2H), 1.49 (d, J=5.7 Hz, 1H), 1.52 (d, J=5.7 Hz, 1H), 1.67~1.72 (m, 3H), 1.96 (s, 3H), 2.91~2.96 (m, 1H), 3.23~3.27 (m, 2H), 3.54 (q, 1H), 4.72 (d, J=8.7 Hz, 1H), 6.15 (s, 1H), 7.21 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.43 (m, 1H), 7.63 (d, J=2 Hz, 1H); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ: 19.4, 23.0, 23.5, 23.7, 25.0, 33.5, 36.2, 36.4, 38.6, 39.2, 41.8, 51.4, 60.3, 121.8, 125.8, 131.3, 147.0, 147.7, 170.9, 194.4; IR (KBr) ν: 3421, 2960, 1686, 1652, 1558, 1388 cm-1; MS (70 eV) m/z: 420.08 [M]+. Anal. calcd for C22H30BrNO2: C 62.86, H 7.38, N 3.33; found C 62.77, H 7.21, N 3.37.

    3.2.4   乙酰脱氢枞胺-6, 7-(3-巯基)-1, 2, 4-三嗪(5)的合成

    在50 mL反应瓶中, 将4 (2.10 g, 5 mmol)溶解在DMF (20 mL)中, 加入硫代氨基脲固体(0.55 g, 6 mmol), 在60 ℃下搅拌4 h后, 用乙酸乙酯(100 mL×3)萃取.有机相用无水硫酸钠干燥后, 经减压蒸馏得到黄色膏状的5粗品.经过硅胶柱层析纯化得1.12 g黄色固体产物, 产率58%. m.p. 183.1~184.2 ℃; [α]D20-181 (c 0.10, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 1.11 (d, J=5.4 Hz, 6H), 1.25~1.28 (m, 6H), 1.42 (d, J=18.6 Hz, 1H), 1.49 (d, J=2.8 Hz, 1H), 1.54~1.58 (m, 1H), 1.69 (q, 1H), 1.75~1.77 (m, 2H), 1.95 (s, 3H), 2.51 (q, 1H), 3.16 (m, 1H), 3.32 (m, 1H), 5.64 (s, 1H), 6.66 (s, 1H), 7.23~7.28 (m, 3H), 7.45 (s, 1H), 7.76 (d, J=4 Hz, 1H), 9.37 (s, 1H); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ: 18.6, 23.3, 23.5, 24.1, 24.5, 33.7, 36.4, 36.8, 37.7, 42.3, 45.8, 49.6, 122.8, 123.0, 128.4, 129.9, 146.6, 148.9, 149.8, 170.7; IR (KBr) ν: 3427, 3278, 2957, 2925, 2867, 1649, 1685, 1572, 1494, 1421, 1287 cm-1; MS (70 eV) m/z: 413.2 [M+H]+, 847.2 [2M+Na]+. Anal. calcd for C23H32N4OS: C 66.83, H 8.00, N 13.56; found C 66.69, H 7.91, N 13.37.

    3.2.5   乙酰脱氢枞胺-(5, 6-烯)-7-酮(6)的合成

    在50 mL反应瓶中, 将4 (2.10 g, 5 mmol)溶解在乙醇(20 mL)中, 然后加入氢氧化钾溶液, 控制pH=10, 在60 ℃条件下搅拌4 h后, 用氯仿(100 mL×3)萃取.有机相用无水硫酸钠干燥后, 经减压蒸馏得到黄色膏状的6粗品.经过硅胶柱层析纯化得1.42 g黄色油状产物, 产率84%. [α]D20+52 (c 0.10, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 1.28~1.30 (m, 6H), 1.38 (s, 3H), 1.54 (s, 3H), 1.62~1.65 (m, 4H), 1.84~1.87 (m, 1H), 1.95 (s, 3H), 2.51 (d, J=16.2 Hz, 1H); 2.95~2.99 (m, 1H), 3.34 (q, 1H), 3.68 (q, 1H), 5.67 (s, 1H), 6.29 (s, 1H), 7.41 (s, 2H), 7.98 (s, 1H); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ: 18.7, 23.4, 24.0, 24.1, 25.3, 33.4, 36.1, 37.3, 38.3, 45.2, 49.9, 123.8, 124.1, 126.9, 132.6, 134.8, 145.6, 147.2, 153.5, 170.4, 199.2; IR (KBr) ν: 3360, 2960, 1632, 1607, 1545, 1492, 1276 cm-1; MS (70 eV) m/z: 340.22 [M+H]+, 357.00 (M+NH4)+, 362.28 (M+Na)+. Anal. calcd for C22H29NO2: C 77.65, H 8.82, N 4.12; found C 77.75, H 8.89, N 4.05.

    3.2.6   乙酰脱氢枞胺-6, 7-吲哚(7)的合成

    在100 mL反应瓶中, 将3 (1.75 g, 5 mmol)溶解在乙醇(30 mL)中, 然后分别加入苯肼盐酸盐(1.44 g, 10 mmol)和盐酸, 控制pH=1~2, 在80 ℃条件下搅拌6 h后, 用氯仿(100 mL×3)萃取.有机相用无水硫酸钠干燥后, 经减压蒸馏得到黄色油状的7粗品.经过硅胶柱层析纯化得1.12 g黄色固体产物, 产率53.7%. m.p.169.1~170.2 ℃; [α]D20+21 (c 0.10, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 1.03 (s, 3H), 1.28 (t, J=7.2 Hz, 1H), 1.34 (q, 6H), 1.39 (d, J=3.2 Hz, 1H), 1.50 (s, 3H), 1.69~1.83 (m, 4H), 2.00 (s, 3H), 2.32 (d, J=13.3 Hz, 1H), 2.98 (m, 2H), 3.35 (d, J=18.8 Hz, 1H), 5.76 (s, 1H), 7.18 (m, 3H), 7.30 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.35 (d, J=3.6 Hz, 1H), 7.47 (m, 1H), 8.01 (m, 1H), 8.66 (s, 1H); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ: 17.7, 19.9, 21.3, 23.5, 24.1, 33.8, 36.5, 37.2, 37.4, 40.0, 48.8, 51.2, 111.4, 119.0, 119.7, 121.2, 122.8, 123.6, 126.1, 126.9, 128.4, 129.2, 135.0, 137.2, 146.7, 146.8, 170.7; IR (KBr) ν: 3289, 2959, 2926, 2867, 1656, 1550, 1509, 1440, 1371 cm-1; MS (70 eV) m/z: 415.55 [M+H]+, 432.00 (M+NH4)+, 437.02 (M+Na)+. Anal. calcd for C28H34- N2O: C 80.96, H 8.43, N 6.75; found C 81.01, H 8.51, N 6.71.

    3.2.7   12-乙酰脱氢枞胺(8)的合成

    在100 mL反应瓶中, 将无水氯化铝(3.60 g, 9 mmol)和乙酰氯(0.70 g, 9 mmol)加入到二氯甲烷(30 mL)中, 室温搅拌1 h后, 向其中滴加含2 (1.96 g, 6 mmol)的二氯甲烷(15 mL)溶液, 在室温继续反应8 h后, 用氯仿(100 mL×3)萃取.有机相用无水硫酸钠干燥后, 经减压蒸馏得到粘稠状的8粗品.经过硅胶柱层析纯化得2.26 g淡黄色固体物, 产率68%. m.p. 190.1~193.3 ℃; [α]D20+38 (c 0.10, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 0.96 (s, 3H), 1.21~1.24 (m, 9H), 1.28 (q, 1H), 1.43 (q, 4H), 1.71~1.81 (m, 4H), 1.98 (s, 3H), 2.56 (s, 3H), 2.82~2.87 (m, 1H), 2.96 (q, 1H), 3.07 (q, 1H), 3.30 (q, 1H), 3.46~3.48 (m, 1H), 5.52 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 7.40 (s, 1H); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ: 18.7, 18.8, 23.4, 24.1, 24.2, 25.2, 28.7, 30.1, 30.5, 36.1, 37.3, 37.4, 38.2, 45.0, 49.8, 124.2, 127.0, 136.3, 138.8, 144.8, 146.8, 170.2, 203.4; IR (KBr) ν: 3299, 2966, 2922, 2864, 1683, 1641, 1555, 1460, 1371 cm-1; MS (70 eV) m/z: 370.19 [M+H]+. Anal. calcd for C24H35NO2: C 77.84, H 9.73, N 3.78; found C 77.79, H 9.69, N 3.84.

    3.2.8   12-(α-溴代)-乙酰基乙酰脱氢枞胺(9)的合成

    在100 mL反应瓶中, 将8(1.85 g, 5 mmol)溶解在乙酸(40 mL)中, 然后加入液溴(1.00 g, 6.25 mmol), 在室温条件下搅拌6 h后, 将反应液倒入饱和碳酸氢钠水溶液中, 用氯仿(100 mL×3)萃取.有机相用无水硫酸钠干燥后, 经减压蒸馏得到红棕色膏状的9粗品.经过硅胶柱层析纯化得1.42 g淡黄色油状物, 产率63.1%. [α]D20+33 (c 0.10, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 0.95 (s, 3H), 1.20~1.24 (m, 9H), 1.25~1.28 (m, 2H), 1.39~1.43 (m, 3H), 1.71~1.78 (m, 4H), 1.99 (s, 3H), 2.85~2.87 (m, 1H), 2.95~2.97 (m, 1H), 3.02~3.06 (m, 1H), 3.29~3.38 (m, 2H), 4.40 (d, J=3.4 Hz, 2H), 5.59 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 7.39 (s, 1H); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ: 18.7, 18.8, 22.8, 23.0, 24.0, 25.2, 29.6, 30.9, 32.3, 34.4, 36.1, 37.4, 38.1, 45.0, 50.3, 120.3, 127.9, 128.4, 134.5, 143.9, 149.1, 171.4; IR (KBr) ν: 3288, 2966, 2962, 2926, 2867, 1695, 1657, 1549, 1452, 1377 cm-1; MS (70 eV) m/z (%): 450.68 [M+H]+. Anal. calcd for C24H34BrNO2: C 64.29, H 7.81, N 3.12; found C 64.31, H 7.86, N 3.09.

    3.2.9   12-(2-氨基噻唑)-乙酰脱氢枞胺(10)的合成

    在50 mL反应瓶中, 将9 (2.25 g, 5 mmol)溶解在DMF (20 mL)中, 然后加入硫脲(0.46 g, 6 mmol), 在75 ℃条件下搅拌4 h后, 用乙酸乙酯(100 mL×3)萃取.有机相用无水硫酸钠干燥后, 经减压蒸馏得到黄色膏状的10粗品.经过硅胶柱层析纯化得1.03 g米白色固体产物, 产率48.3%. m.p. 122.5~123.9 ℃; [α]D20+93 (c 0.10, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 0.95 (s, 3H), 1.18 (q, 6H), 1.23 (s, 3H), 1.26~1.29 (m, 2H), 1.40~1.44 (m, 3H), 1.64~1.67 (m, 1H), 1.73~1.79 (m, 2H), 1.93 (s, 1H), 1.99 (s, 3H); 2.84~2.88 (m, 1H), 2.96 (q, 1H), 3.09 (q, 1H), 3.24~3.29 (m, 2H), 5.28 (s, 2H), 5.51 (s, 1H), 6.34 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 7.23 (s, 1H); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ: 18.7, 18.9, 21.0, 23.5, 24.1, 24.2, 25.1, 28.8, 29.9, 36.1, 37.3, 37.4, 38.3, 45.1, 49.8, 104.7, 125.7, 126.0, 131.6, 135.2, 144.1, 146.8, 166.6, 170.2; IR (KBr) ν: 3301, 3184, 2960, 2925, 2866, 1650, 1548, 1517, 1543, 1375 cm-1; MS (70 eV) m/z: 426.29 [M+H]+. Anal. calcd for C25H35N3OS: C 70.42, H 8.45, N 9.86; found C 70.48, H 8.51, N 9.79.

    3.3.1   荧光光谱

    室温条件下, 向样品池中加入3 mL的鲑鱼精DNA-EB(溴化乙锭)混合溶液(cDNA/cEB=10:1)后, 依次向样品池中加入等体积的化合物样品, 使得化合物和DNA的浓度比值梯度地增加, 静置5 min后, 在520 nm的激发波长下测定其荧光发射谱[21].

    3.3.2   圆二色光谱

    用Tris缓冲溶液配制鲑鱼精DNA溶液和含化合物的鲑鱼精DNA溶液(结合比率rc化合物/cDNA), 混匀后室温下静置5 min, 测定其圆二色谱, 测试时扣除Tris缓冲溶液和化合物的吸收[22].

    3.3.3   琼脂糖凝胶实验

    将pBR 322质粒DNA (200 μg)与浓度梯度增加的化合物在pH=7.26的TBE缓冲溶液中活化2.5 h (37 ℃), 用溴酚蓝-EDTA终止反应, 在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳, 电泳结束后, 在凝胶成像系统上成像, 观察化合物对DNA的切割情况.

    3.3.4   抗肿瘤活性测试

    采用MTT法测试了目标化合物对MCF-7肿瘤细胞的体外细胞毒活性, 以临床用药顺铂作为阳性对照.首先将待测化合物溶解于DMSO中, 配制成10 mmol•L-1的溶液, 然后用培养液和牛血清将浓度稀释至1, 2, 4, 8, 16, 32 µmol•L-1 (最终DMSO含量<0.5%).将MCF-7细胞经常规消化、计数, 接种到96孔板中, 置于37 ℃, 5%的CO2培养箱中培养24 h.再将配制好的不同浓度的待测化合物加入96孔板中, 设置对照组, 每孔3个复孔, 于培养箱中培养24 h后, 每孔加入20 μL的MTT溶液, 继续培养4 h.弃去上清液后每孔加入150 μL的DMSO, 摇床振荡10 min混匀, 随后用酶标仪测定570 nm处的吸光值(OD)并计算抑制率, 化合物作用于MCF-7细胞的抑制率达到50%时所对应的浓度定义为半数抑制浓度(IC50).

    辅助材料(Supporting Information)  所合成目标化合物的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱及高分辨质谱谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.


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  • 图式 1  目标化合物的合成路线

    Scheme 1  Synthesis route of target compounds

    图 1  化合物对鲑鱼精DNA-EB体系的荧光光谱的影响

    Figure 1  Effects of compounds on fluorescence spectra of salmon sperm DNA-EB system

    cDNA=1.0×10-4 mol•L-1; cQ=0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60 μmol•L-1

    图 2  化合物对鲑鱼精DNA溶液CD光谱的影响

    Figure 2  Effects of compounds on CD spectra of salmon Sperm solution

    图 3  化合物切割pBR 322质粒DNA的凝胶电泳图谱

    Figure 3  Gel electrophoresis patterns of compounds cleaved pBR 322 plasmid DNA

    Lane 1: DNA; Lane 2: DNA+50 µmol•L-1 compounds 5, 6, 7 and 10; Lane 3: DNA+100 µmol•L-1 compounds 5, 6, 7 and 10; Lane 4: DNA+150 µmol• L-1 compounds 5, 6, 7 and 10

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  • 收稿日期:  2019-04-02
  • 修回日期:  2019-06-28
  • 网络出版日期:  2019-11-25
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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