English

• 硫化氢(H₂S)因其恶臭、高毒, 曾被列为有毒气体, 被认为毫无医药用途.但近年来通过对其在体内生物系统中影响生理病理过程的了解, 发现H₂S作为继NO和CO以后的第三种气体信号分子, 具有广泛的生物学效应^[1], 在多种重大疾病的治疗中显示了良好的前景.内源性硫化氢可通过胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)、胱硫醚-β-合成酶(CBS)以及3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-MST)产生^[2].目前, 内源性硫化氢已被证实, 在心血管、神经、呼吸、消化、血液、新陈代谢等多系统中具有重要调节作用^{[2a, 3]}.

  除内源性硫化氢的生物调控作用外, 由硫化氢供体释放的外源性硫化氢还可能起治疗作用, 目前报道的硫化氢供体主要有两类.第一类为无机H₂S供体, 如Na₂S、NaHS, 这类供体在机体内释放明确, 无明显副产物, 在糖尿病、神经保护等研究中表现出有意义的结果.但无机硫化氢供体存在一些待解决的问题, 如需实现高效精准的检测、水溶液的稳定性不佳等.第二类为有机H₂S供体, 根据其释放硫化氢方式的不同, 有机硫化氢供体主要有包括如下几种: (1)通过游离硫醇活化机理释放硫化氢, 此类供体如大蒜中含有的己二烯二硫化物(DADS) 1、己二烯三硫化物(DATS)等^[4], 硫酰胺类2^[5], 异硫氰酸酯类3^[6], N-硫羰基取代衍生物(NSHD) 4^[7], 过硫化合物(perthiol) 5^[1a]等; (2)通过水解反应释放硫化氢, 此类供体如Lawesson’s试剂6^[8]、1, 2-二硫-3-硫酮衍生物(DTTS)类^[9]及1, 2-二硫-3-硫酮(DTT)和非甾体抗炎药(NSAIDs)如双氯芬酸钠等杂合的衍生物7^[10]、GYY4317 8^{[2a, 11]}等; (3)紫外光催化释放硫化氢, 此类供体如偕二硫醇9^[12]、酮取代的布洛芬衍生物10^[13]、氧杂蒽酮类衍生物^[14]等; (4)通过pH调控硫化氢的释放, 此类供体如硫代氨基酸11^[15]; (5)通过酯酶催化释放硫化氢, 此类供体如酯酶敏感型类化合物12^[16]; (6)通过碳酸酐酶水解释放硫化氢, 此类供体如硫羰基类化合物13^[17].

  上述有机硫化供体在生物学评价时, 大部分都表现出了良好的生物活性, 但也存在一些问题^[1a]: (1)大多供体释放硫化氢的速度不可控; (2)有些供体如DTT类、劳森试剂等, 供体本身水溶性很差, 且具有恶臭; (3)有些供体如GYY4137本身具有活性, 且释放硫化氢的机理只是推测, 并未真正阐明, 所以难以准确判断其表现出来的生物活性是供体本身还是硫化氢产生的; (4)部分供体释放硫化氢的条件如紫外催化和pH调控, 在生物体实现的可行性不高, 如通过紫外光敏的硫化氢供体, 其细胞毒性和有限的光穿透能力使其应用受到了一定的限制; (5)很多情况下, 为了达到硫化氢发挥生物效应的微摩尔浓度, 需要毫摩尔的有机供体, 如此高浓度的底物可能带来许多其他问题, 如毒性、溶解性以及和生物体其他组分的相互作用; (6)有机硫化氢供体在制备和保存时的化学稳定性也需要高度关注.所以, 开发新型硫化氢供体具有重要的理论价值和应用前景.

  目前国际上硫化氢供体的研究思路还是设计新型有机小分子硫化氢供体, 核心在于可控地释放硫化氢但尚未有药物上市, 也未曾提出用有机碱的硫化氢盐作为硫化氢供体, 用于重大疾病的治疗.

  除本课题组专利^[18]报道的15个有机碱硫化氢盐以外, 文献报道的有机碱硫化氢盐多为简单胺类化合物, 且未见有机碱硫化氢盐相关化学的系统研究, 亦无有机碱硫化氢盐的生物活性报道. 1931年Achterhof等^[19]报道了12个简单有机碱硫化氢盐的合成方法以及它们的熔点、元素分析和颜色性状等理化性质.其它一些有机碱硫化氢盐多是作为反应副产物被报道, 而硫化氢作为重要的内源性活性物质, 是最近20多年来才被发现, 因此有机碱硫化氢盐是药物化学中尚未开发的化合物类型.

  二甲双胍是临床上广泛应用的治疗糖尿病的小分子药物, 近年来被报道还具有减肥、抗衰老等多种生理活性^[20], 同时也是一种碱性很强的有机碱, 而硫化氢是一种弱酸性物质, 故本文设想利用酸碱成盐原理, 将市售的二甲双胍盐酸盐处理成强碱性的二甲双胍, 再与硫化氢成盐, 制成二甲双胍的硫化氢盐(DMGS).二甲双胍硫化氢盐可作为第三种创新类型的硫化氢供体, 且二甲双胍是治疗糖尿病的一线用药, 其有效性和安全性得到了多年的临床验证.鉴于此, 本文合成了二甲双胍硫化氢盐, 并通过氢谱、碳谱、元素分析及X单晶衍射进行了结构鉴定, 通过碘量法、醋酸铅法和荧光亚甲蓝法测定了硫化氢的含量, 并通过HPLC测定了二甲双胍的含量.二甲双胍硫化氢的溶液稳定性及固体稳定性结果表明, 该化合物有望作为一种新型小分子硫化氢供体.考虑到二甲双胍硫化氢盐良好的应用前景, 其药理学研究和其他有机碱硫化氢盐的系统化学研究正在进行中.

  1.   结果与讨论

  1.1   目标化合物的合成

  市售二甲双胍是1, 1-二甲基双胍盐酸盐, 合成二甲双胍硫化氢盐需要首先得到强碱性的二甲双胍游离碱, 再与弱酸性的硫化氢成盐(Scheme 1).本文参考文献[21]方法, 在筛选了一系列将二甲双胍盐酸盐游离的条件后, 发现在金属钠/乙醇体系的条件下可以得到高纯度的二甲双胍游离碱, 并获得了单晶结构, 数据详见结构鉴定部分.

  图式 1

  

  图式 1.  目标化合物DMGS的合成路线

  Scheme 1.  Synthetic route of target compounds DMGS

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  后续研究发现, 游离二甲双胍的纯度对于二甲双胍硫化氢盐的质量具有决定性影响, 本文参考文献[21]采用金属钠/乙醇体系得到二甲双胍游离碱粗品, 进而以丙酮为溶剂反复脱盐析晶, 得到高纯度的二甲双胍晶体.相较于其它文献[22]报道, 如采用氢氧化钠为碱进行游离, 该体系所得产物纯度高, 炽灼残渣显示无机盐含量为0, HPLC纯度大于99.50%, 含量大于98.50%.

  得到高纯度二甲双胍游离碱后, 本文筛选了二甲双胍游离碱和硫化氢气体的成盐条件, 最终确定采用硫化氢丙酮溶液与二甲双胍丙酮溶液滴加沉淀的方法, 制备了含量大于96.00%的二甲双胍硫化氢盐.

  作者也曾尝试以水为溶剂, 将二甲双胍溶于水中, 再把硫化氢气体直接通入, 最后通过冻干获得二甲双胍硫化氢盐, 所得产品含量94.00%.两种方法相比, 直接沉淀时间短, 同时, 目标物从溶液中析出, 还可除去溶解于丙酮的杂质, 所得产物含量高, 且无需在高真空下长时间冻干获得, 操作简便, 产品质量可控.

  1.2   目标化合物的结构鉴定

  本文通过氢谱、碳谱、元素分析及X单晶衍射对二甲双胍硫化氢盐进行了结构确证.

  比较二甲双胍游离碱、盐酸盐和硫化氢盐核磁数据, 大部分信号差别不大, 游离碱的碳谱有一个碳原子的化学位移和盐酸盐、硫化氢盐有明显差异(161.55 vs 160.09, 以D₂O为溶剂), 而硫化氢盐的碳谱和盐酸盐无明显差异(160.09 vs 160.15, 以D₂O为溶剂).

  剑桥结构数据中心(The Cambridge Crystallographic Data Centre, CCDC)报道了二甲双胍的盐酸盐、硝酸盐、醋酸盐以及一些复合物晶体结构, 但未见二甲双胍游离碱和二甲双胍硫化氢盐的晶体结构报道.本文培养得到了二甲双胍游离碱(No. CCDC 1881154), 二甲双胍硫化氢盐(No. CCDC 1881155)和盐酸盐单晶结构, 如图 1所示.二甲双胍游离碱的亚胺氮原子与另外一个质子化的亚胺氮上氢原子存在N—H氢键相互作用.

  图 1

  

  图 1.  二甲双胍游离碱(a)、二甲双胍盐酸盐(b)及二甲双胍硫化氢盐(c)的单晶结构

  Figure 1.  Crystal structures of metformin (a), metformin hydrochloride (b) and metformin hydrosulfide (c)

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  二甲双胍盐酸盐的单晶结构显示质子化位点在二甲胺基相邻的亚胺氮原子上, 二甲双胍硫化氢盐的单晶结构也显示出质子化位点在二甲胺基相邻的亚胺氮原子上, 且二甲双胍与硫化氢1:1成盐.

  1.3   目标化合物的含量测定

  目标化合物由硫化氢和二甲双胍组成, 所以本文分别测定其含量.

  文献[23]报道硫化氢的测定方法有碘量法、醋酸铅法和荧光亚甲蓝法, 本文利用此三种方法分别测定二甲双胍硫化氢盐中硫化氢的含量, 所得结果比较一致(表 1和表 2), 硫化氢含量均大于96.00%.另外, 通过HPLC测定了二甲双胍的含量, 结果显示其含量大于98.50%.

  表 1

  

  表 1  碘量法和醋酸铅法测定结果

  Table 1.  Results of iodometry method and lead acetate method

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  碘量法				醋酸铅法
  m/g	VNa2S2O3/mL	含量/%		m/g	含量/%
  0.3015	13.88	96.71		0.8162	97.70
  0.3014	13.91	96.87		5.1204	98.96

  表 2

  

  表 2  荧光亚甲法测定结果

  Table 2.  Results of methylene blue spectrophotometric method

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  V/mL	1.00	3.00	5.00
  平均值A	0.26	0.54	0.90
  S2－含量/µg	10.79	28.09	50.56
  H2S含量/%	19.60	19.60	19.60
  含量/%	98.02	98.01	98.02

  1.4   二甲双胍硫化氢盐的稳定性研究

  鉴于硫化氢的强还原性, 二甲双胍硫化氢盐的稳定性是其成药性的重要影响因素.本文分别探索了二甲双胍硫化氢的溶液稳定性及固体稳定性, 结果表明, 溶液在避光、脱氧、4 ℃情况下, 24 h后未见含量明显下降(表 3), 而固体在避光、－18 ℃情况下保存3个月也未见含量明显下降(表 4).

  表 3

  

  表 3  二甲双胍硫化氢盐溶液稳定性试验

  Table 3.  Stability of metformin hydrosulfide solution

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  t/h	m/g	VNa2S2O3/mL	含量/%
  0	0.3010	14.90	96.68
  2	0.3014	14.90	96.65
  4	0.3016	14.84	96.75
  8	0.3020	14.79	96.75
  12	0.3027	14.76	96.62
  18	0.3030	14.69	96.71
  24	0.3045	14.50	96.74

  表 4

  

  表 4  二甲双胍硫化氢盐固体稳定性试验

  Table 4.  Stability of metformin hydrosulfide

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  t/d	m/g	VNa2S2O3/mL	含量/%
  7	0.3023	14.76	96.74
  15	0.3051	14.48	96.62
  30	0.3017	14.81	96.79
  90	0.3040	14.59	96.66

  将固体样品密封于西林瓶中, 分别于1周、2周、1个月、3个月检测含量, 结果如表 4所示, 3个月内含量无明显降低(表 4).

  2.   结论

  本文以盐酸二甲双胍为原料, 通过游离得到二甲双胍, 进而与硫化氢成盐两步反应合成了二甲双胍硫化氢盐.其中, 游离二甲双胍的纯度和含量对二甲双胍硫化氢盐的质量具有决定性影响, 本文参考文献采用了金属钠/乙醇体系、丙酮反复脱盐析晶制得二甲双胍游离碱晶体, 炽灼残渣结果显示该晶体中没有无机盐的存在, HPLC纯度大于99.50%, 含量大于98.50%.在得到高纯度的游离二甲双胍后, 再通过摸索, 确定采用硫化氢丙酮溶液与二甲双胍丙酮溶液滴加沉淀的方法获得含量大于96.00%的二甲双胍硫化氢盐.含量测定时, 作者比较了三种方法, 所得结果一致, 相互验证了准确性, 在后续工作中根据目标物数量的不同可选择不同方法.如荧光亚甲蓝样品用量最少, 碘量法适中, 而醋酸铅法虽操作简便, 用量较大时准确度相对较高, 但大量时, 烘干至恒重也需要准确判断.二甲双胍硫化氢盐的溶液及固体相对稳定, 同时其0.05%浓度水溶液的pH为8.94, 上述数据均为二甲双胍硫化氢盐能成为药用硫化氢供体提供了支撑, 生物学评价工作正在进行中.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  核磁共振仪(Bruker-AC-E20, Varian-Unity INOVA-400);高分辨质谱仪(Waters Q-TOF-Premier); 岛津UV-2450紫外分光光度计; Varian InovaA400型核磁共振仪; X射线单晶衍射仪(Oxford, Xcalibur EOS); 元素分析仪(vario MICRO select).

  盐酸二甲双胍(苏州亚科科技有限公司).实验中所用的试剂除另有说明外, 均为市售分析纯.无水溶剂和试剂按规定的方法进行干燥处理; 实验用水除另有说明外, 均指去离子除氧水.对苯二胺溶液、醋酸锌-醋酸钠溶液及硫酸铁铵溶液按照文献[24]配制.

  3.2   化合物的合成

  3.2.1   1, 1-二甲基双胍(DMG)游离碱的制备

  在室温下, 向装有机械搅拌、温度计、无水CaCl₂干燥管、温度计及冷凝管的3000 mL夹套反应瓶中, 加入无水乙醇(1200 mL), 分批加入金属钠(23.45 g, 1.02 mol), 20 min内加毕, 内温升到56 ℃, 15 min后钠块完全溶解, 然后向反应液中分批加入二甲双胍盐酸盐(DMGH, 168.90 g, 1.02 mol), 内温迅速下降至42 ℃, 用150 mL无水乙醇冲洗加料漏斗, 继续剧烈搅拌2 h后, 得到白色悬浮液.置冰箱冷至内温10 ℃后, 过滤, 得到澄清滤液, 在35 ℃下减压浓缩, 得到124.93 g白色固体粗品DMG, 粗产率95%.

  3.2.2   1, 1-二甲基双胍游离碱的精制

  室温下, 取上述二甲双胍(DMG)粗品60.00 g, 加入1500 mL无水丙酮, 室温下超声并搅拌直到无大颗粒固体, 加入1.00 g活性炭搅拌10~15 min过滤.滤液于－18 ℃析晶48 h, 过滤得35.72 g无色颗粒状晶体DMG, 产率60%. m.p. 118~120 ℃ (lit. ^[25] m.p. 119~120 ℃); ¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ: 2.87 (s, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, D₂O) δ: 37.14 (2C), 158.44, 161.55.

  3.2.3   1, 1-二甲基双胍硫化氢盐(DMGS)的制备

  在已称重的500 mL三口瓶中, 加入250 mL丙酮, 室温搅拌下通入H₂S气体, 通入2 h后, 称量增重5.50 g, 放置待用.称量DMG的精制品(20.83 g)于1000 mL锥形瓶内, 加入450 mL丙酮, 室温下搅拌直到固体全部溶解后, 过滤, 将滤液转移到1000 mL三颈瓶中, 在室温搅拌下, 用恒压滴液漏斗缓慢滴入上述H₂S丙酮溶液, 滴加过程中有白色固体析出.滴毕, 用20 mL丙酮冲洗滴液漏斗, 抽滤, 得白色滤饼, 用30 mL丙酮洗涤一次, 真空干燥, 得25.35 g白色、略有臭味固体DMGS, 产率96%. m.p. 158~160 ℃; ¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ: 3.01 (s, 6H); ¹³C NMR (100MHz, D₂O) δ: 37.45 (2C), 158.39, 160.15. Anal. calcd for C₄H₁₃N₅S: C 29.43, H 8.03, N 42.90; found C 29.41, H 7.94, N 42.77. HRMS calcd for C₄H₁₄N₅S (M－HS⁺) 130.1014, found 130.1034.

  3.3   含量测定

  3.3.1   碘量法测定硫化氢含量

  参照文献[26]报道的方法, 用碘量法测定二甲双胍硫化氢盐中硫化物的含量, 结果见表 1.

  3.3.2   醋酸铅法测定硫化氢含量

  精密称量一定质量的二甲双胍硫化氢盐, 加少量水溶解后, 再加入过量(4 equiv.)醋酸铅溶液, 室温搅拌1 h后, 静置冷藏30 min, 用精密称量后的玻砂漏斗过滤, 滤饼用水洗涤多次后, 105 ℃干燥至恒重, 计算二甲双胍硫化氢的含量, 结果见表 1.

  3.3.3   荧光亚甲蓝法测定硫化氢含量

  参照文献[24], 配制实验所需的试液及Na₂S标准溶液(需临用新制), 进而绘制标准曲线图.精密称取适量样品DMGS, 然后按照标准试样的配制方法进行配制并稀释, 得样品使用液.分别取1.00、3.00、5.00 mL样品液分别进行5次平行试验测定吸光度, 再通过校准曲线得出硫化物的含量, 通过计算转换为二甲双胍硫化氢盐的质量分数(见表 2).

  3.3.4   二甲双胍含量测定

  参考《中国药典》(2015版)盐酸二甲双胍的含量测定方法, 选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子, 1.7%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调pH＝3.0)为流动相, 以1.0 min/mL的流速, 在波长233 nm处进行检测.以二甲双胍对照品, 按外标法以峰面积计算即可得含量.

  辅助材料(Supporting Information)盐酸二甲双胍、游离二甲双胍及二甲双胍硫化氢盐的¹H NMR、¹³C NMR、HRMS、元素分析、单晶数据与晶体结构图, 以及HPLC含量测定的色谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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  图式 1  目标化合物DMGS的合成路线

  Scheme 1  Synthetic route of target compounds DMGS

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  图 1  二甲双胍游离碱(a)、二甲双胍盐酸盐(b)及二甲双胍硫化氢盐(c)的单晶结构

  Figure 1  Crystal structures of metformin (a), metformin hydrochloride (b) and metformin hydrosulfide (c)

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  表 1  碘量法和醋酸铅法测定结果

  Table 1.  Results of iodometry method and lead acetate method

  碘量法				醋酸铅法
  m/g	VNa2S2O3/mL	含量/%		m/g	含量/%
  0.3015	13.88	96.71		0.8162	97.70
  0.3014	13.91	96.87		5.1204	98.96

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  表 2  荧光亚甲法测定结果

  Table 2.  Results of methylene blue spectrophotometric method

  V/mL	1.00	3.00	5.00
  平均值A	0.26	0.54	0.90
  S2－含量/µg	10.79	28.09	50.56
  H2S含量/%	19.60	19.60	19.60
  含量/%	98.02	98.01	98.02

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  表 3  二甲双胍硫化氢盐溶液稳定性试验

  Table 3.  Stability of metformin hydrosulfide solution

  t/h	m/g	VNa2S2O3/mL	含量/%
  0	0.3010	14.90	96.68
  2	0.3014	14.90	96.65
  4	0.3016	14.84	96.75
  8	0.3020	14.79	96.75
  12	0.3027	14.76	96.62
  18	0.3030	14.69	96.71
  24	0.3045	14.50	96.74

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  表 4  二甲双胍硫化氢盐固体稳定性试验

  Table 4.  Stability of metformin hydrosulfide

  t/d	m/g	VNa2S2O3/mL	含量/%
  7	0.3023	14.76	96.74
  15	0.3051	14.48	96.62
  30	0.3017	14.81	96.79
  90	0.3040	14.59	96.66

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