English

• 肼(N₂H₄)又称联氨, 是一种重要的化工原料, 广泛用于药物、染料、显像剂、抗氧剂的原料^[1~4], 还可用于航空航天工业^[5].肼有类似于氨的刺鼻性气味的液体, 具有很强的毒性.研究表明, 肼很容易经过人的皮肤组织渗透或口腔进入到人的体内, 对人的眼睛、肝脏、肾脏和中枢神经系统造成严重损伤^[6~8].因此, 世界卫生组织和美国环境保护局(EPA)规定肼的阈限值为0.11 μmol/L^[8].由于N₂H₄在生理和病理过程中的多重作用, 近年来成为生物领域研究的热点, 检测N₂H₄具有非常重要的意义^[9~11].

  荧光探针法检测N₂H₄与分光光度法、色谱法和电化学方法等传统检测方法相比^[12~14], 该方法具有检测效率高、灵敏度高、选择性好等优势已经成为检测N₂H₄的重要手段^[15~17].近年来, 基于激发态分子内质子转移机制(ESIPT)设计的识别N₂H₄的荧光分子探针主要有2-(邻羟基苯)苯并噁唑、2-(邻羟基苯)苯并噻唑、2-羟基查尔酮和3-羟基黄酮等^[18~21].由于3-羟基黄酮是一类具有抗氧化性、抗癌活性的天然产物, 具有大的Stokes位移、较高的荧光量子产率和光学稳定性, 被广泛用于分子或离子识别以及生物成像研究^[22~25].

  目前, 文献报道关于检测N₂H₄的荧光探针, 大部分是基于单波长检测荧光增强或淬灭原理设计的分子探针, 检测信号容易受到物质浓度、外界环境以及设备稳定性等因素的影响^{[20, 21]}.相比之下, 比率型荧光探针与单波长荧光探针相比, 其能有效克服检测中的不确定因素, 从而提高方法的可信度^{[26, 27]}.本工作以3-羟基黄酮为荧光母核, 设计合成了一种基于ESIPT机制比率型荧光探针HFBA (Scheme 1), 该探针利用保护与脱保护基团, 即肼解反应实现识别N₂H₄, 其他阴离子没有干扰, 其细胞成像结果表明在医药领域具有潜在应用价值.

  图式 1

  

  图式 1.  探针分子HFBA的合成路径

  Scheme 1.  Synthetic route of probe HFBA

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  1.   结果与讨论

  1.1   探针HFBA光谱性质

  探针HFBA的结构通过NMR和高分辨质谱进行了表征.将探针HFBA用溶剂二甲基亚砜(DMSO)和水(V:V＝7:3)配制成1×10^－5 mol/L的溶液, 向探针HFBA溶液中加入5×10^－5 mol/L的N₂H₄, 测试了探针HFBA的紫外-可见吸收光谱, 探针HFBA的最大吸收波长为308 nm, 当加入N₂H₄后引起最大吸收波长红移至350 nm.又测试了探针HFBA的DMSO-H₂O溶液的荧光光谱变化.探针HFBA在408 nm处有一个很弱的发射峰.当加入N₂H₄后引起最大发射波长在408 nm处的荧光强度略有增强, 而在535 nm处出现一个新的荧光发射峰(图 1), 且在365 nm紫外灯下可以看到溶液由无荧光变成黄绿色荧光.由此可见, 探针HFBA加入N₂H₄后, 引起红移了185 nm, 斯托克斯位移较大, 且呈现出比率荧光的特性, 可用于定量检测N₂H₄.最后又将探针母核HF配成1×10^－5 mol/L DMSO-H₂O (V:V＝7:3)的溶液, 测试了其紫外-可见吸收光谱和荧光光谱, 结果表明母核HF吸收光谱和发射光谱与探针HFBA中加入N₂H₄后的波谱基本一致, 说明探针 HFBA与N₂H₄作用后可能生成了HF.

  图 1

  

  图 1.  探针HFBA (10 μmol/L)在DMSO/PBS缓冲溶液(V: V＝7:3)与加入水合肼(50 μmol/L)以及母核HF (10 μmol/L)的荧光光谱

  Figure 1.  Fluorescence spectra of probe HFBA (10 mmol/L) in the absence and presence of hydrazine (50 μmol/L) and HF (10 μmol/L) in a mixture of DMSO and phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4, 20 mmol/L, V:V＝7:3).

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  1.2   探针HFBA的荧光选择性

  为了研究探针HFBA对N₂H₄具有更好的选择性和实用性, 选取了部分可能干扰的阴离子(如$\rm {SO}_4^{2 - }$、$\rm{NO}_3^ - $、$\rm{SO}_3^{2 - }$、$\rm{CO}_3^{2 - }$、Cl^－、Br^-和Ac^-等)、阳离子(如K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺和Fe³⁺等)以及小分子(如尿素、硫脲、三乙胺、半胱氨酸、谷胱甘肽等), 在DMSO/PBS buffer (V:V＝7:3, pH 7.4)的缓冲溶液中测试了探针HFBA的选择性实验.向1×10^－5 mol/L的探针HFBA溶液中分别加入2×10^－5 mol/L的各种离子或分子, 测试探针HFBA的荧光光谱变化.当加入可能有干扰的离子或分子后, 测试探针HFBA的荧光均没有明显变化, 当加入2×10^－5 mol/L的N₂H₄后, 荧光强度明显增强(图 2), 由此可以推测, 该探针HFBA对N₂H₄具有专一的选择性, 可以用于肼的分析检测.

  图 2

  

  图 2.  (A) 探针HFBA (10 μmol/L)分别加入各种分析物(20 mol/L)和N₂H₄ (20 μmol/L)的荧光光谱, 以及(B)探针HFBA (10 μmol/L)中分别加入各种分析物和随后加入N₂H₄ (20 μmol/L)的荧光强度变化柱状图

  Figure 2.  (A) Fluorescence enhancement of probe HFBA (10 μmol/L) upon the individual addition of different analytes (20 μmol/L) and 20 mol/L N₂H₄, and (B) column diagram for fluorescence intensity changes of probe HFBA (10 μmol/L) upon individual addition of different analytes (20 μmol/L) and followed by further addition of N₂H₄ (20 μmol/L).

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  1.3   探针HFBA与N₂H₄的响应动力学

  向探针HFBA (10 μmol/L)中加入N₂H₄ (50 μmol/L)后, 荧光强度显著增强(如图 3所示), 说明探针HFBA对N₂H₄响应也较快, 大约在20 min左右荧光强度达到最强.依据公式I_t＝I_max+A×exp(－k×t)计算了准一级反应的反应速率常数^[28].在公式中, I_t代表t时刻535 nm处的荧光强度, I_max代表 535 nm处的最大荧光强度.计算出的一级反应速率常数k为0.201 min^－1.

  图 3

  

  图 3.  室温下DMSO-H₂O (V:V＝7:3)溶液中探针HFBA对N₂H₄的准一级反应动力学曲线

  Figure 3.  Kinetic study of the response of HFBA to N₂H₄ under pseudo-first-order conditions in DMSO-H₂O (V:V＝7:3) solution at room temperature

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  1.4   探针HFBA与N₂H₄的线性关系

  DMSO和PBS缓冲液体积比为7:3, 反应时间为20 min, 该探针HFBA与不同浓度水合肼反应之后分别进行荧光波谱分析, 结果如图 4所示.由图可知, 反应产物的荧光在535 nm处的荧光强度显著增加, 408 nm处荧光强度微弱增加, 荧光强度的比率(I₅₃₅/I₄₀₈)与肼的浓度成线性关系.其响应线性方程为: Y＝0.834+3.404X (R²＝0.9810), 其中Y为I₅₃₅/I₄₀₈的值, X为肼的浓度, 根据3δ_空白/k (δ_空白为连续测量空白溶液荧光强度的标准方差, k为标准曲线的斜率)^[29], 其检测限为0.11 μmol/L, 线性范围为1~10 μmol/L.实验结果表明, 该探针检测水合肼的荧光比率检测法线性范围宽, 检测灵敏度高.

  图 4

  

  图 4.  (a) 探针分子HFBA (10 μmol/L)加入N₂H₄ (0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 equiv.)后荧光强度的变化, 以及(b) I₅₃₅/I₄₀₈对N₂H₄浓度的线性关系

  Figure 4.  (a) Fluorescence spectral changes of probe HFBA (10 μmol/L) upon addition of increasing concentration (0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 and 1 equiv.) of hydrazine, and (b) liner relationship between I₅₃₅/I₄₀₈ and concentrations of hydrazine

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  1.5   pH值的影响

  为了说明pH值对探针HFBA (10 μmol/L)的稳定性及对探针HFBA (10 μmol/L)与N₂H₄ (50 μmol/L)作用的影响.通过不同pH值对探针HFBA及探针HFBA与N₂H₄作用的荧光强度实验研究, 实验结果如图 5所示.探针HFBA的荧光强度在pH 4.0到10.0的范围内没有明显的变化, 说明pH值对探针HFBA稳定性几乎没有影响.而HFBA与N₂H₄作用的荧光强度随pH值的变化较为明显, pH值在4.0到7.5的区间内, HFBA与N₂H₄作用的荧光强度变化明显, 而pH值在7.5到10.0的区间内变化趋于平稳.

  图 5

  

  图 5.  探针HFBA和探针HFBA+N₂H₄的荧光强度随pH的变化曲线

  Figure 5.  Fluorescence intensity for free probe HFBA (10 μmol/L) and in the presence of 5 equiv. N₂H₄ in DMSO/H₂O (V:V＝7:3) under various pH values.

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  1.6   探针HFBA与N₂H₄的作用机理

  为了阐明探针HFBA与肼的作用机理, 我们应用高分辨质谱跟踪探针HFBA与肼反应的整个过程.没有加入水合肼之前, 离子峰为m/z＝436.0587 (calcd for C₂₃H₁₄ClNO₆ [M+H]⁺ 436.0582), 说明探针HFBA结构与检测结果一致; 当加入水合肼后, 正电离子模式下, 检测结果: m/z＝436.0587的离子峰消失, 说明探针与水合肼已经完全反应, 并在m/z＝253.0858 (calcd for C₁₆H₁₂O₃ [M+H]⁺ 253.0859)出现一个离子峰, 其结构与探针母核的结构一致, 即为HF; 负电离子模式下, 检测结果:在m/z＝214.0011 (calcd for C₇H₆ClN₃O₃ [M－H]^－ 214.0025)出现一个离子峰, 对应的结构可能是2-氯-4硝基苯甲酰肼.结合相关文献报道^{[25, 30, 31]}, 以及探针HFBA与N₂H₄的作用机制(Eq. 1), 推测可能是肼与探针HFBA发生肼解反应, 脱去2-氯-4硝基苯甲酰基, 得到3-羟基黄酮HF和2-氯-4硝基苯甲酰肼.由于2位的氯和4位的硝基均为拉电子基团, 有利于肼解反应, 响应时间缩短, 与预测结果一致.

  (1)

  1.7   细胞毒性实验

  为了评价探针HFBA和N₂H₄的对细胞的毒性.采用噻唑蓝(MTT)比色法考察了探针HFBA和N₂H₄对Eca-109食管癌细胞的细胞毒性, 其结果如图 6所示.由图 6可以看出, 探针HFBA浓度为100 μmol/L, 细胞存活率仍保持在80%以上.当N₂H₄浓度高达100 μmol/L, 细胞存活率仍保持在80%以上, 说明该探针HFBA和N₂H₄对Eca-109食管癌细胞具有低毒性.

  图 6

  

  图 6.  MTT法考察探针HFBA和N₂H₄对Eca-109食管癌细胞的细胞毒性

  Figure 6.  MTT assay on Eca-109 cells treated with different concentrations of HFBA and N₂H₄, respectively.

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  1.8   细胞荧光成像

  为了评价该探针HFBA的细胞膜通透性并且能够检测活细胞中的N₂H₄, 进行了细胞成像实验.选取Eca-109食管癌细胞, Eca-109食管癌细胞铺于6孔板, 密度为2×10⁴个/mL, 每孔2 mL, 待细胞贴壁24 h后, 用20 μmol/L的探针HFBA溶液在37 ℃条件下孵育30 min, 然后用磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次, 在荧光显微镜下观察细胞图像; 接着向孵育过的细胞中加入浓度为100 μmol/L的水合肼, 于37 ℃下孵育0.5 h, 然后用磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次, 在荧光显微镜下观察细胞图像.探针HFBA单独孵育细胞没有荧光(图 7b); 而该探针中加入N₂H₄孵育的细胞, 表现出较强的黄绿色荧光(图 7d).细胞显微成像实验结果说明该探针具有良好的细胞膜渗透能力, 该探针有可能用于生物细胞内N₂H₄的检测.

  图 7

  

  图 7.  不同N₂H₄浓度下, 探针HFBA在Eca-109活细胞中的荧光成像

  Bright-field transmission images (a, c) and fluorescence images (b, d) of Eca-109 cells incubated with 20 mol/L HFBA and 0 or 100 mol/L N₂H₄ for 30 min, respectively

  Figure 7.  Fluorescence images of HFBA as a function of concentration of N₂H₄ in Eca-109 cells

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  2.   结论

  设计合成一种新型的具有激发态分子内质子转移机制(ESIPT)、较大斯托克斯位移的荧光探针HFBA, 对其结构进行了表征.该探针在DMSO-PBS溶液体系中可以高效识别水合肼, 检测限为0.11 μmol/L, 远低于美国环境保护局(EPA)规定肼的阈限值(0.313 μmol/L), 表现出高灵敏性和选择性.此外, 该探针能够应用于活细胞中N₂H₄的微量检测, 表明其在生物活体分析方面具有潜在的应用价值.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  400 NMR核磁共振仪(瑞士, Bruker公司); 高分辨质谱仪(美国, Thermofisher); 荧光分光光度计(美国, Agilent公司); 紫外-可见光光谱仪(北京普析); DFM-60荧光倒置显微镜(Eclipse Ti, Nikon); 全波长扫描式多功能读数仪(美国Thermo公司).所有试剂和溶剂均为市售分析纯, 未经处理直接使用.化合物HF^[25]根据文献方法合成.

  3.2   实验方法

  3.2.1   探针HFBA的合成

  将2-氯-4-硝基苯甲酸(1.005 g, 5.0 mmol)加入到二氯亚砜(3 mL)的烧瓶中, 加热到40 ℃保持2 h, 然后蒸出过量的二氯亚砜得到粗产品2-氯-4-硝基苯甲酰氯.

  将化合物HF (2 mmol, 504 mg)溶解在无水四氢呋喃(30 mL)中, 加入NaH (4 mmol, 160 mg), 大约30 min后, 再将2-氯-4-硝基苯甲酰氯缓慢加入到该体系中, 室温反应1 h左右.加入10 mL水, 然后用乙酸乙酯萃取(20 mL×3), 合并有机相, 无水MgSO₄干燥, 过滤, 除去溶剂, 粗产品用柱色谱分离[V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝1:1]得到白色固体455 mg, 产率为52.3%. m.p. 142.5~144.0 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.37 (d, J＝2.1 Hz, 1H), 8.32 (d, J＝8.6 Hz, 1H), 8.29 (dd, J＝8.0, 1.5 Hz, 1H), 8.23 (dd, J＝8.6, 2.2 Hz, 1H), 7.81 (d, J＝8.3 Hz, 2H), 7.77 (ddd, J＝8.6, 7.2, 1.6 Hz, 1H), 7.62 (d, J＝8.2 Hz, 1H), 7.53~7.45 (m, 1H), 7.33 (d, J＝8.1 Hz, 2H), 2.44 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 171.69, 161.50, 157.21, 155.74, 149.88, 142.40, 135.38, 134.70, 134.27, 133.36, 133.01, 132.61, 129.57, 128.34, 126.69, 126.15, 125.99, 125.50, 123.51, 121.60, 121.46, 118.26, 21.62. HRMS calcd for C₂₃H₁₅ClNO₆ [M+H]⁺ 436.0582, found 436.0587.

  3.2.2   荧光光谱测定方法

  探针HFBA以DMSO为溶剂配制成1.0×10^－3 mol/L的溶液, 然后用PBS缓冲液(20 mmol/L, pH＝7.4)稀释成1.0×10^－5 mol/L溶液; 以二次蒸馏水为溶剂, 采用钠盐或钾盐配制2.0×10^－3 mol/L的各种阴离子($\rm{SO}_4^{2 - }$, $\rm{HSO}_3^ - $, $\rm{CO}_3^{2 - }$, CH₃COO^-, $\rm{NO}_3^ - $和Br^-), 各种阴离子(K⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, Pb²⁺, Mn²⁺, Mg²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺和Co²⁺)以及分子(尿素, 硫脲, TEA, Cys和GSH).荧光光谱测定均在室温条件下进行, 灵敏度设置为3, 激发狭缝宽5 nm, 发射狭缝宽5 nm, 激发波长350 nm, 于360~670 nm范围内检测荧光光谱.

  3.2.3   细胞毒性测定方法

  选取Eca-109食管癌细胞, Eca-109食管癌细胞密度为5×10³个/mL, 每孔2 mL, 设置单独的培养基作为空白对照, 饱和湿度, 5% CO₂, 37 ℃无菌二氧化碳培养箱中培养24 h.用培养基稀释配制的HFBA储备液和N₂H₄储备液, 再分别加入样品孔中, 使各样品组HFBA或N₂H₄的最终浓度分别为20, 30, 50和100 μmol/L.孵育24 h后, 在37 ℃下PBS溶液小心洗去孔内液体, 每孔加入MTT溶液10 μL (5 mg/mL)及90 μL培养基, 37 ℃孵育2 h后, 小心吸去孔内液体, 每孔加入DMSO 100 μL, 室温低速振摇5 min后, 测定光密度(Optical Sensity, OD)值.根据细胞增殖抑制率公式计算HFBA和N₂H₄对Eca-109食管癌细胞的抑制率, 抑制率＝1－[OD(样品)－OD(空白)]/[OD(对照)－OD(空白)]×100%^[32].

  辅助材料(Supporting Information) 探针母核HF及探针HFBA的¹H NMR, ¹³C NMR, HRMS以及紫外-可见光谱谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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  图式 1  探针分子HFBA的合成路径

  Scheme 1  Synthetic route of probe HFBA

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  图 1  探针HFBA (10 μmol/L)在DMSO/PBS缓冲溶液(V: V＝7:3)与加入水合肼(50 μmol/L)以及母核HF (10 μmol/L)的荧光光谱

  Figure 1  Fluorescence spectra of probe HFBA (10 mmol/L) in the absence and presence of hydrazine (50 μmol/L) and HF (10 μmol/L) in a mixture of DMSO and phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4, 20 mmol/L, V:V＝7:3).

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  图 2  (A) 探针HFBA (10 μmol/L)分别加入各种分析物(20 mol/L)和N₂H₄ (20 μmol/L)的荧光光谱, 以及(B)探针HFBA (10 μmol/L)中分别加入各种分析物和随后加入N₂H₄ (20 μmol/L)的荧光强度变化柱状图

  Figure 2  (A) Fluorescence enhancement of probe HFBA (10 μmol/L) upon the individual addition of different analytes (20 μmol/L) and 20 mol/L N₂H₄, and (B) column diagram for fluorescence intensity changes of probe HFBA (10 μmol/L) upon individual addition of different analytes (20 μmol/L) and followed by further addition of N₂H₄ (20 μmol/L).

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  图 3  室温下DMSO-H₂O (V:V＝7:3)溶液中探针HFBA对N₂H₄的准一级反应动力学曲线

  Figure 3  Kinetic study of the response of HFBA to N₂H₄ under pseudo-first-order conditions in DMSO-H₂O (V:V＝7:3) solution at room temperature

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  图 4  (a) 探针分子HFBA (10 μmol/L)加入N₂H₄ (0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 equiv.)后荧光强度的变化, 以及(b) I₅₃₅/I₄₀₈对N₂H₄浓度的线性关系

  Figure 4  (a) Fluorescence spectral changes of probe HFBA (10 μmol/L) upon addition of increasing concentration (0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 and 1 equiv.) of hydrazine, and (b) liner relationship between I₅₃₅/I₄₀₈ and concentrations of hydrazine

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  图 5  探针HFBA和探针HFBA+N₂H₄的荧光强度随pH的变化曲线

  Figure 5  Fluorescence intensity for free probe HFBA (10 μmol/L) and in the presence of 5 equiv. N₂H₄ in DMSO/H₂O (V:V＝7:3) under various pH values.

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  图 6  MTT法考察探针HFBA和N₂H₄对Eca-109食管癌细胞的细胞毒性

  Figure 6  MTT assay on Eca-109 cells treated with different concentrations of HFBA and N₂H₄, respectively.

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  图 7  不同N₂H₄浓度下, 探针HFBA在Eca-109活细胞中的荧光成像

  Figure 7  Fluorescence images of HFBA as a function of concentration of N₂H₄ in Eca-109 cells

  Bright-field transmission images (a, c) and fluorescence images (b, d) of Eca-109 cells incubated with 20 mol/L HFBA and 0 or 100 mol/L N₂H₄ for 30 min, respectively

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