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巯基类荧光探针的研究进展

闫沛沛 ,  王婷 ,  张丹 ,  马晓雪

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引用本文: 闫沛沛, 王婷, 张丹, 马晓雪. 巯基类荧光探针的研究进展[J]. 有机化学, 2019, 39(4): 916-928. doi: 10.6023/cjoc201807055 shu
Citation:  Yan Peipei, Wang Ting, Zhang Dan, Ma Xiaoxue. Progress in Fluorescence Sensors for Detection of Thiols[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2019, 39(4): 916-928. doi: 10.6023/cjoc201807055 shu

巯基类荧光探针的研究进展

  • a.

    山东医药技师学院 泰安 271000

  • b.

    贵州大学化学与化工学院 贵阳 550000

    • 通讯作者: Yan, Peipei, E-mail: 1458851831@qq.com
摘要: 生物硫醇类物质，如半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽等，在生命体中有至关重要的生理和病理作用.因此，近几年对生物硫醇的研究成了一大热点.目前巯基类荧光探针的设计主要是基于巯基的强亲核性.根据荧光探针与巯基反应的不同的机理，综述了近几年关于检测硫醇的荧光探针的合成报道，从迈克尔加成、醛基的环化、裂解、取代和其他几个方面对探针的检测限、响应时间、当量比、选择性、稳定性等进行了综述.

English

  • 生物硫醇, 如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH), 在各个生理过程中起着至关重要的作用, 因此对生命体中的生物硫醇进行定量的跟踪分析监测成为近几年来的研究热点[1~3].半胱氨酸是生命体中非常常见的一种氨基酸, 存在多种蛋白质和多肽中; 具有淡化黑色素、延缓衰老、促进体制生长等作用[4, 5].半胱氨酸缺乏与许多疾病密切相关, 如儿童生长缓慢[6]、毛发脱色[7]、水肿[8]、肝损伤[9]、皮肤损伤[10]等.高半胱氨酸又称同型半胱氨酸, 是半胱氨酸的异种, 高水平的同型半胱氨酸称为高同型半胱氨酸血症, 会导致人体的认知功能障碍[11], 严重者会导致阿尔茨海默病和精神分裂症[12, 13].此外, 半胱氨酸和高半胱氨酸的水平异常是心血管疾病的重要原因之一[14, 15].谷胱甘肽几乎存在于人体每一个细胞中, 它具有维持正常免疫功能、调整氧化作用、整合解毒作用等功能[16, 17].因此对生命体中生物硫醇的分析检测具有非常重要的生理和病理意义.

    目前, 硫醇检测的主要分析技术包括高效液相色谱法(HPLC)[18, 19]、毛细管电泳(CE)[20]、电化学检测[21]等.而这些分析技术成本高, 选择性差, 精度低.因此, 荧光探针法因其简单、低成本、高选择性和适用于细胞内硫醇的检测而被广泛报道.

    目前, 用于硫醇检测的荧光探针的设计原理主要是基于其强亲核性和对金属离子的高亲和性.本文综述了迈克尔加成反应、醛类环化、裂解、取代等反应的机理, 探讨了硫醇类化合物探针的最新研究进展.

    1.   基于迈克尔加成反应

    1978年, Sippel[22]首次报道了, 用迈克尔加成的反应机理设计合成了用于检测大鼠体内生物硫醇的荧光探针.此后该方法成为了设计合成硫醇类荧光探针的热门[23, 24], 并经过近几年的研究在选择性、稳定性、灵敏度等方面取得了突破性进展.虽然现在生物硫醇总量的检测取得了突破性进展, 但是在单一硫醇的选择性监测、探针的灵敏度等方面仍然是个艰巨的挑战[25].

    2017年, Fan等[26]设计报道的光诱导电子转移(Photo induced Electron Transfer, PET)体系的荧光探针1 (Scheme 1).当探针1在与巯基类物质识别之前, 由于PET效应探针荧光基团的荧光大幅减弱; 当探针与巯基类物质通过迈克尔加成反应识别之后, 荧光探针的PET过程被阻断, 进而使得探针荧光基团的荧光恢复.在CH3CN/H2O (V:V=1:1, 20 mmol/L PBS, pH 7.4)的溶液中, 探针1在在波长为525 nm处发出较强的荧光(激发波长为360 nm).加入Cys后525 nm处的荧光发射急剧减少, 当加入的Cys达到探针1的50 equiv.时, 荧光几乎被完全萃灭, 与探针1单独存在时相比荧光值下降了近20 equiv.探针1与Cys响应后2 h荧光值就会被完全萃灭, 而探针1与Hcy的响应时间大约为3 h, 与GSH的响应时间则更长.因此可以利用探针对三中巯基化合物响应时间的不同来区分鉴别三种氨基酸.此外探针1已经成功地被应用于A375细胞中Cys的检测.

    图式 1

    图式 1.  探针1与生物硫醇识别示意图
    Scheme 1.  Schematic illustration of reaction of 1 with thiols
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    2014年, Dai等[27]报道了一种检测Cys的基于香豆素和吡唑啉的比例型探针2 (图 2).相较于其他的氨基酸, 包括谷胱甘肽和同型半胱氨酸, 探针2对半胱氨酸有很高的选择性.在探针2 (10 μmol•L-1)磷酸缓冲溶液(CH3CN:PBS=1:1, pH 7.4)中, 加入不同浓度的Cys (0~13 equiv.), 随着Cys浓度的增加, 荧光强度在560 nm处逐渐增强, 直至荧光值增加9 equiv., 且检测限为5.08 μmol•L-1.探针2对Cys的响应时间为40 min.另外, 探针2已经被成功应用于A549细胞中Cys的检测.

    图 2

    图 2.  探针2与半胱氨酸识别示意图
    Figure 2.  Schematic illustration of reaction of 2 with Cys
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    2013年, Lim等[28]报道了检测Cys的罗丹明类荧光探针3 (图 3).探针3表现出对Cys的高选择性, 可以有效从各种氨基酸(包括GSH和Hcy)中鉴别出Cys.探针3与Cys的响应速率较快(k2=0.0176 mol•L-1•s-1), 说明探针3的灵敏度较高.在探针3 (20 μmol•L-1)的HEPES缓冲溶液(0.10 mol•L-1, pH 7.4)中, 加入不同浓度的Cys (0~20 mmol•L-1), 在波长为525 nm处的荧光值随着Cys浓度的增加而增加, 最终达到峰值, 检测限低至7.62 μmol•L-1.另外细胞成像实验表明, 探针3能够对活细胞中的Cys进行成像检测.

    图 3

    图 3.  探针3与半胱氨酸识别示意图
    Figure 3.  Schematic illustration of reaction of 3 with Cys
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    2014年, Huo等[29]研究报道了一种检测硫脲类化合物的荧光探针4 (图 4).探针4与GSH和Cys识别后发出较强的绿色荧光, 而与Hcy识别后的荧光强度较弱, 与其他氨基酸几乎不响应.在探针4 (10 μmol•L-1)的DMSO/H2O (V:V=1:3, 10 mmol•L-1 HEPES, pH 7.4)溶液中, 加入不同浓度的GSH (0~60 μmol•L-1).实验结果表明, 探针4与GSH识别后的荧光强度与GSH的浓度呈线性关系, 检测限为0.026 μmol•L-1.此外, 探针4已经成功应用于活细胞中巯基的标记.

    图 4

    图 4.  探针4与硫醇类物质识别示意图
    Figure 4.  Schematic illustration of reaction of 4 with thiols
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    2014年, Qu等[30]报道了检测生物硫醇的马来酰亚胺类的荧光探针5 (图 5).探针5对生物硫醇类物质表现为较高的选择性.探针5 (0.6 μmol•L-1)与生物硫醇(10 μmol•L-1)的响应时间监测实验表明, 探针5与Cys、Hcy、GSH的反应均在20 s内完成, 说明探针5对生物硫醇的检测具有很高的灵敏度.在探针5 (0.6 μmol•L-1)的HEPES (10 mmol/L, pH 7.4)缓冲溶液中加入不同浓度的Hcy (0~0.6 μmol•L-1), 随着Hcy浓度的增加荧光强度不断增加直至达到峰值, 检测限在10-8~10-7 mol• L-1之间.此外, 探针5具有良好的细胞膜穿透性, 可用于标记活细胞中的Cys、Hcy和GSH.

    图 5

    图 5.  探针5与生物硫醇类物质识别示意图
    Figure 5.  Schematic illustration of reaction of 5 with bio-thiols
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    2015年, Shen等[31]报道了一种含7-硝基-2-氧代-1, 3-二唑和4-马来酰亚胺苯酚片段的用于检测生物硫醇的荧光探针6 (图 6).探针6对生物硫醇类物质具有较好的选择性.探针6 (5 μmol•L-1)的CH3CN/H2O (V: V=1:9, 50 mmol•L-1 PBS, pH 7.0)溶液几乎无荧光发射, 当加入Cys (70 μmol•L-1)后随着时间的推移其荧光强度不断增加, 15 min后达到峰值.探针6与不同浓度的Cys响应实验表明, 探针6可以定量检测Cys, 检测限为12×10-7 mol•L-1.此外, 探针6已经成功地用于对HeLa细胞中硫醇的成像.

    图 6

    图 6.  探针6与半胱氨酸类物质识别示意图
    Figure 6.  Schematic illustration of reaction of 6 with Cys
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    2016年, Liu等[32]报道了一种制备简便的检测生物硫醇的荧光探针7 (图 7).探针7本身是没有荧光发射现象的, 当加入GSH后在480 nm处出现一个很强的荧光发射峰, 荧光值相较于没有加入GSH之前增加了近24 equiv.探针7与GSH和Hcy的响应时间均在75 s之内, 与Cys的响应时间为150 s.在探针7 (0.5 μmol•L-1)的CH3OH/H2O (V:V=1:1, 10 mmol/L HEPES, pH 7.4)中加入GSH (0~3.5 μmol•L-1), 其荧光值与GSH的浓度程较好的线性关系, 检测限为0.085 mmol/L.此外, 探针7已经成功应用于HepG2细胞中生物硫醇的检测.

    图 7

    图 7.  探针7与生物硫醇类物质识别示意图
    Figure 7.  Schematic illustration of reaction of 7 with thiols
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    2016年, Zhao等[33]报道了用于检测生物硫醇类物质的荧光探针8(图 8).探针8的ESIPT荧光团被连接的马来酰亚胺触发PET效应, 使得探针本身无荧光发射现象, 而当巯基与马来酰亚胺发生迈克尔加成反应后, PET效应被阻断进而使得ESIPT荧光团的荧光恢复, 并伴有较大的Stokes位移.探针8的溶液中加入Cys, 30 s内荧光值就能达到Cys之前的荧光值的23 equiv.的峰值.在探针8 (2 μmol•L-1)的PBS缓冲溶液(10 mmol• L-1, pH 7.4, 0.1% DMSO)中加入Cys (0~3.2 μmol•L-1), 随着Cys浓度的增加荧光强度逐渐增加, 检测限为3.78×10-8 mol•L-1.此外, 探针8成功的应用于活细胞中生物硫醇的检测.

    图 8

    图 8.  探针8与半胱氨酸识别示意图
    Figure 8.  Schematic illustration of reaction of 8 with Cys.
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    2017年, Yue等[34]报道了一种可以同时检测Cys及其代谢产物SO2的荧光探针9 (图 9).探针9对Cys表现出极高的选择性, 甚至可以从结构较为相似的Hcy和GSH中区分检测出Cys.探针9 (10 μmol•L-1)和Cys (20 μmol•L-1)在100 s内荧光值达到峰值, 在发射峰为514 nm处荧光值最大增量为130 equiv.此外, 探针9与Cys响应的荧光值和Cys的浓度呈较好的线性关系, 检测限为0.46 μmol•L-1.更重要的是, 探针9可以用于观察在A549细胞中Cys向SO2的转化, 并且已成功地应用于斑马鱼的外源性半胱氨酸和SO2成像.

    图 9

    图 9.  探针9与半胱氨酸和SO2识别示意图
    Figure 9.  Schematic illustration of reaction of 9 with Cys and SO2
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    2017年, Sok等[35]报道了两种检测GSH的具有α, β-不饱和羰基的高效荧光探针10和11 (图 10).探针10和11对GSH都有较好的选择性.其中探针11 (5 μmol• L-1)的发射荧光随GSH浓度(0~5 μmol•L-1)呈非线性增加, 这意味着探针可能有助于评价硫醇含量.将GSH (1 μmol•L-1)分别加入到探针10 (5 μmol•L-1)和探针11 (5 μmol•L-1)的PBS缓冲溶液(0.1 mmol•L-1, pH 7.4)中, 监测320 nm处的吸光度变化, 探针11中的GSH在20 min被消耗完全, 而探针10中的GSH在130 min后被消耗了20%.总体来看, 探针10和11都可以较好地检测GSH, 其中探针11的检测性能更好.

    图 10

    图 10.  探针10和探针11与谷胱甘肽识别示意图
    Figure 10.  Schematic illustration of reaction of 10 and 11 with GSH.
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    2013年, Long等[36]报道了检测生物硫醇的基于迈克尔加成的香豆素类荧光探针12(图 11).在探针12 (5 μmol•L-1)的磷酸钾缓冲溶液(10 mmol•L-1, pH 7.4, 2% DMSO)中加入不同浓度的Cys (0~350 μmol•L-1), 其在发射波长为455 nm处的荧光值随Cys的浓度增加而增加, 检测限为0.22 μmol•L-1. 5 μmol•L-1的探针12与350 μmol•L-1的Cys、Hcy、GSH的响应时间分别为1.5、5和10 min.此外, 探针12已经被成功应用于人血清中生物硫醇的检测.

    图 11

    图 11.  探针12与生物硫醇类物质识别示意图
    Figure 11.  Schematic illustration of reaction of 12 with thiols
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    2015年, Dai等[37]报道了一系列基于巯基与不饱和酮的迈克尔加成反应的荧光探针13~22.探针13~17是7号位被取代的2-(喹啉-2-亚甲基)丙二酸类物质, 而探针18~22是7号位被取代的2-(喹啉-2-亚甲基)丙二酸乙酯类物质(图 12).两类探针的pH适应性不同, 探针13~17可以在pH＜7的条件下检测硫醇类物质, 探针18~22可以在pH＞7的条件下检测硫醇类物质.其中, 在探针13 (20 μmol•L-1)的DMSO/0.1 mol•L-1的磷酸柠檬酸缓冲溶液(V:V=2:98, pH 5)加入Cys (80 μmol• L-1), 20 min内荧光值达到原来的96 equiv.的峰值.此外, 由于探针13和14的高度敏感和选择性可以检测活细胞中的硫醇物质, 并且这两个探针已经成功标记活细胞中的溶酶体.

    图 12

    图 12.  探针13~22的结构示意图
    Figure 12.  Chemical Structures of Two Kinds of Probes, 13~22
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    2.   基于醛的环化

    2016年, Yang等[38]报道了一种检测GSH的高水溶性的荧光探针23(图 13).该探针通过引入羧基来提高探针的水溶性, 减少了探针用于活细胞检测时有机溶剂对细胞的损伤.探针23对GSH具有较高的选择性, 不受其它两种生物巯基(Cys、Hcy)和其他19种氨基酸的干扰.探针23 (10 μmol•L-1)与GSH (25 μmol•L-1)响应90 s内荧光值增加近70 equiv., 说明探针与GSH响应的速率快且具有较大的当量比.在探针23 (10 μmol•L-1)的PBS缓冲溶液中加入不同浓度的GSH (0~25 μmol• L-1), 其荧光值与GSH的浓度程线性关系.探针23为提高罗丹明类荧光探针的水溶性提供了新的方法.另外, 探针23已经被成功应用于活细胞中GSH的检测.

    图 13

    图 13.  探针23与谷胱甘肽识别示意图
    Figure 13.  Schematic illustration of reaction of 23 with thiols
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    2014年, Meng等[39]报道了一种检测Cys和Hcy的双光子的荧光探针24 (图 14).探针24的荧光发射波长在505 nm, 当加入Cys后由于ICT效应荧光发射波长蓝移至410 nm.探针对Cys和Hcy有较好的选择性, 与其他巯基类物质均无响应.在探针24 (25 μmol•L-1)的PBS/DMSO (V:V=1:9, pH 7.4)溶液中加入不同浓度的Cys (0~80 μmol•L-1), 在波长为410 nm处荧光值随着Cys浓度的增加而增加, 而在波长为505 nm处荧光值随Cys浓度的增加而降低.探针24 (10 μmol•L-1)和Cys (100 μmol•L-1)反应约6 min结束.此外, 探针24提供了一种简单且可见的检测Cys的方法, 并能实时地检测双光子激发.

    图 14

    图 14.  探针24与Cys/Hcy识别示意图
    Figure 14.  Schematic illustration of reaction of 24 with Cys/ Hcy
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    2016年, Chen等[40]报道了一种检测生物硫醇的香豆素类荧光探针25 (图 15).探针25只对Cys和Hcy有荧光响应, 对包括GSH在内的其他氨基酸几乎无荧光响应.室温下探针25 (10 μmol•L-1)与Cys (20 equiv.)混合10 min后, 荧光值有明显的增加, 30 min后荧光值基本达到峰值.在探针25 (10 μmol•L-1)的PBS缓冲溶液(20 mmol•L-1, pH 7.4)中加入不同浓度的Cys (0~70 equiv.), 荧光值随着Cys浓度的增加而增大, 检测限为0.874 μmol•L-1.此外, 探针25已经成功地用于HeLa细胞中生物硫醇的荧光成像.

    图 15

    图 15.  探针25与Cys/Hcy识别示意图
    Figure 15.  Schematic illustration of reaction of 25 with Cys/ Hcy
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    2016年, Zhang等[41]报道了基于PET效应的荧光探针26 (图 16).探针26对Cys和Hcy的检测选择性很高.在探针26的DMSO/PBS缓冲溶液(V:V=7:3, 10 mmol•L-1, pH 7.4)中加入不同浓度的, 探针的荧光值均随Cys或Hcy浓度的增加而增加, 检测限分别为0.82和1.45 μmol•L-1.探针26 (10 μmol•L-1)分别于Cys (3 mmol•L-1)和Hcy (5 mmol•L-1)反应, 荧光值分别在30和40 min后达到峰值.此外, 初步的生物荧光成像结果表明, 探针26具有良好的生物相容性.

    图 16

    图 16.  探针26与Cys/Hcy识别示意图
    Figure 16.  Schematic illustration of reaction of 26 with Cys/ Hcy
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    2013年, Kong等[42]报道了一种检测Cys/Hcy的高选择性的近红外荧光探针27(图 17).近红外荧光探针的发射波长在600~1000 nm之间, 这类荧光探针有效地避开了生物细胞中自身荧光的干扰.在探针27 (2 μmol• L-1)的PBS缓冲溶液(40 mmol•L-1, PH 7.4)中加入不同浓度的Cys (0~2 μmol•L-1), 其荧光值在波长为778 nm处随着Cys浓度的增加而增加, 检测限低至7.9×10-9 mol•L-1.此外, 探针27已经被成功地用于在活的HepG2细胞中成像内源性Cys/Hcy.

    图 17

    图 17.  探针27与半胱氨酸识别示意图
    Figure 17.  Schematic illustration of reaction of 27 with Cys
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    2016年, Gong等[43]报道了一种基于ICT机制的荧光探针28(图 18).探针28对Cys具有较好的选择性, 包括Hcy和GSH在内的其他氨基酸与探针28几乎不反应.在探针28 (20 μmol•L-1)的CH3CN/PBS缓冲溶液(V: V=2:8, 10 mmol•L-1, pH7.4)中加入不同浓度的Cys (0~700 μmol•L-1), 探针28的荧光强度会随着Cys的增加而增加, 检测限为54.6 nmol•L-1.探针28与50 equiv. Cys反应5 min即可达到饱和, 说明探针具有很高的灵敏度.此外, 探针28已经成功地应用于活细胞内的Cys的生物成像.

    图 18

    图 18.  探针28与半胱氨酸识别示意图
    Figure 18.  Schematic illustration of reaction of 28 with Cys
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    2017年, Gao等[44]报道了含醛基的金属铱复合物荧光探针29(图 19).探针29对Hcy具有较好的选择性, 可以有效地区分Hcy与其他两种生物硫醇(Cys和GSH).探针29 (10 μmol•L-1)的荧光值与Hcy的浓度(0~700 μmol•L-1)成正比, 检测限为4.6 μmol•L-1.此外, 探针29具有明显的细胞通透性和低细胞毒性, 并且已经成功地应用于活细胞中Hcy的成像.探针29的优良性能, 使其在对细胞中Hcy的跟踪研究方面具有巨大的潜力.

    图 19

    图 19.  探针29与半胱氨酸识别示意图
    Figure 19.  Schematic illustration of reaction of 29 with Hcy
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    2017年, Kim等[45]报道了一种检测Cys的可回收的荧光探针30 (图 20).探针30与Cys在水溶液中发生环化反应, 同时伴随着颜色由橙色变为黄色.然而当探针30与Cys反应后的产物与汞离子识别, 又会产生探针30, 因此探针30可以重复利用.探针30对Cys的选择性非常好, 甚至包括结构较为相似的Hcy和GSH在内的其他氨基酸对探针识别Cys均无干扰.探针30对Cys的检测的良好性能, 说明探针30具有应用于细胞内Cys检测的潜力.

    图 20

    图 20.  探针30与半胱氨酸识别示意图
    Figure 20.  Schematic illustration of reaction of 30 with Cys
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    3.   基于裂解反应

    2016年, Wang等[46]报道了一种检测生物硫醇的PET效应的荧光关-开探针31 (图 21).探针31对生物硫醇具有较好的选择性, 基本不受其他几种氨基酸的干扰.当pH=3.5时, 探针30只对Cys有响应, 而当pH=5.5时, 探针31对Cys、Hcy、GSH均有响应.在探针31 (10 μmol•L-1)的DMSO/H2O溶液(V:V=9:1, 10 mmol•L-1 PBS, pH=3.5)中加入不同浓度的Cys (0~15 equiv.), 探针31的荧光值与Cys的浓度呈线性关系, 检测限为0.117 μmol•L-1.在pH=3.5的条件下, 探针31 (10 μmol•L-1)与Cys (15 equiv.)反应80 min后达到饱和.此外, 探针31已成功检测到HeLa细胞中的硫醇.

    图 21

    图 21.  探针31与生物硫醇类物质识别示意图
    Figure 21.  Schematic illustration of reaction of 31 with bio-thiols
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    2017年, Chen等[47]报道了一种具有较大Stokes位移(202 nm)的荧光探针32 (图 22).探针32由于PET和ESIPT效应基本无荧光发射, 当加入Cys后, 探针的PET效应被阻断在482 nm处的荧光值显著增加.在探针32 (10 μmol•L-1)的HEPES/DMSO溶液(V:V=4:1, 50.0 mmol•L-1, pH 7.4)中加入不同浓度的Cys (0~80 μmol•L-1), 探针的荧光值会随着Cys浓度增加而增加, 检测限为2×10-8 mol•L-1.探针32 (10 μmol•L-1)与Cys (80 μmol•L-1)反应30 min内荧光值增加近20 equiv.峰值.此外, 探针32已经被成功应用于NCI-H226细胞中生物硫醇的检测.

    图 22

    图 22.  探针32与生物硫醇类物质识别示意图
    Figure 22.  Schematic illustration of reaction of 32 with bio-thiols
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    2013年, Wei等[48]报道了一种检测Cys和GSH的高选择性的荧光探针33 (图 23).探针33对生物硫醇的检测具有较好的选择性和稳定性, 响应的程度大小为GSH＞Cys＞Hcy.在探针33的磷酸盐缓冲溶液(10 μmol•L-1)中分别加入不同浓度的Cys (0~60 μmol•L-1)和GSH (0~60 μmol•L-1), 探针33的荧光强度与Cys和GSH的浓度程线性关系, 线性相关系数分别为0.9956和0.9966.此外, 根据探针33在细胞中检测生物硫醇的结果判断, 其在疾病诊断中具有潜在的应用前景.

    图 23

    图 23.  探针33与生物硫醇类物质识别示意图
    Figure 23.  Schematic illustration of reaction of 33 with thiols
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    2016年, Liu等[49]报道了检测生物硫醇的高选择性荧光探针34 (图 24).探针34的溶液中加入生物硫醇后肉眼可见其颜色由无色变为黄色, 其荧光从无荧光变为强黄色荧光.在探针34 (10 μmol•L-1)的PBS缓冲溶液(10 mmol•L-1, pH=7.4)中加入Cys (0~3 μmol•L-1), 其荧光值会随Cys浓度增加而增加, 检测限为0.16 μmol• L-1.探针34 (10 μmol•L-1)和生物硫醇(5 equiv.)反应1 min后荧光强度急剧增加, 反应5 min后荧光值达到饱和.所有数据表明探针34在生物成像中显示出潜在用途应用.

    图 24

    图 24.  探针34与生物硫醇类物质识别示意图
    Figure 24.  Schematic illustration of reaction of 34 with bio-thiols
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    2016年, Fan等[50]报道了一种检测生物硫醇的双光子荧光探针35(图 25).双光子荧光探针因为其光毒性小、穿透力强、可视性强等优点一直是生物荧光探针领域的研究重点.探针35与Cys的响应时间约为20 min, 而与GSH和Hcy的响应时间相对要长一点, 且探针35与Cys相应的最大荧光值增加了近74 equiv.在探针35 (10 μmol•L-1)的DMSO/HEPES (V:V=3:7, 10 mmol•L-1, pH 7.4)溶液中加入不同浓度的Cys (0~500 μmol•L-1), 探针35的荧光强度与Cys的浓度程线性关系, 检测限为0.26 μmol•L-1.此外, 探针35已经成功地应用于活细胞中生物硫醇的检测.

    图 25

    图 25.  探针35与生物硫醇类物质识别示意图
    Figure 25.  Schematic illustration of reaction of 35 with bio-thiols
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    2014年, Yoshida等[51]报道了一种检测生物硫醇的高灵敏度的荧光探针36(图 26), 该探针可以在短时间内监测细胞中生物硫醇的水平.探针36 (1 μmol•L-1)与GSH (10 μmol•L-1)响应1 h后, 荧光值及达到饱和, 比没有加入GSH之前的荧光值增加了近6000 equiv.之多.更重要的是, 该探针已经成功地检测到小鼠卵巢的癌细胞中的生物硫醇.

    图 26

    图 26.  探针36与生物硫醇类物质识别示意图
    Figure 26.  Schematic illustration of reaction of 36 with bio-thiols
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    2017年, Wang等[52]报道了一种监测生物硫醇的近红外荧光探针37 (图 27).将GSH (0~25 μmol•L-1)滴定到探针37 (10 μmol•L-1)的PBS (10 mmol•L-1, pH 7.4, 50% DMSO)缓冲溶液中, 在676 nm处可观察到荧光强度逐渐增强, 检测限低至1.19 nmol•L-1.此外探针37与GSH的响应非常迅速, 将GSH (2 μmol•L-1)加入到探针37 (10 μmol•L-1)的溶液中, 6 min荧光值即可达到峰值.更重要的是, 探针37已经成功应用于活细胞中GSH的检测.

    图 27

    图 27.  探针37与生物硫醇类物质识别示意图
    Figure 27.  Schematic illustration of reaction of 37 with bio-thiols
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    2013年, Xu等[53]报道了一种可循环利用的检测GSH的近红外荧光探针38 (图 28).在探针38 (10 μmol• L-1)的HEPES (10 mmol•L-1, pH 7.4)溶液中加入不同浓度的GSH (0~20 μmol•L-1), 探针38的荧光值在794 nm处随GSH浓度的增加而减弱, 而当在探针38与GSH (20 μmol•L-1)的反应产物中加入不同浓度的H2O2 (0~200 μmol•L-1)时, 其荧光值在794 nm处又会随H2O2浓度的增加而增加.当GSH (20 μmol•L-1)加入到探针38 (10 μmol•L-1)的溶液中, 5 min后荧光值发生明显的减小.此外, 探针38实现了细胞凋亡过程中GSH的氧化还原过程的实时监测.

    图 28

    图 28.  探针38与谷胱甘肽识别示意图
    Figure 28.  Schematic illustration of reaction of 38 with GSH
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    4.   基于取代反应

    2014年, Zheng等[54]报道了检测生物硫醇的FRET效应的荧光探针39 (图 29).荧光探针39的荧光由于FRET效应被大大减弱, 当探针39与Cys响应后FRET效应被阻断荧光恢复.在探针39 (10 μmol•L-1)的溶液中加入不同浓度的Cys (0~40 μmol•L-1), 荧光值随Cys浓度的增加而增加, 检测限为0.8 μmol•L-1.探针39 (10 μmol•L-1)与Cys (10 μmol•L-1)响应16 min后荧光值达到饱和.此外, 探针39已经成功地应用于复方氨基酸注射液中Cys浓度的测定.

    图 29

    图 29.  探针39与生物硫醇类物质识别示意图
    Figure 29.  Schematic illustration of reaction of 39 with bio-thiols
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    2013年, Lim等[55]报道了一种检测生物硫醇的荧光探针40 (图 30).探针40对生物硫醇表现出良好的选择性和灵敏度, 并且探针40具有较好的水溶性.在探针40 (20 μmol•L-1)的HEPES (0.10 mol•L-1, pH 7.4)缓冲溶液中加入不同浓度的GSH (0~20 mmol•L-1), 荧光值会随着GSH浓度的增加呈比例增加, 检测限为6 μmol• L-1.探针40具有定量检测细胞中GSH含量变化的潜力.

    图 30

    图 30.  探针40与谷胱甘肽识别示意图
    Figure 30.  Schematic illustration of reaction of 40 with GSH
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    2017年, Shen等[56]报道了一种检测GSH的双光子荧光探针41 (图 31).在探针41的溶液中加入GSH分别在350和450 nm处激发会分别在460和530 nm处出现两个荧光发射峰.在探针41 (5 μmol•L-1)的PBS/MeCN (V:V=1:1, pH 7.4)溶液中加入不同浓度的GSH (0~1000 μmol•L-1), 460和530 nm处的荧光发射峰均会随着GSH的增加而增加, 检测限为2.9 μmol•L-1.此外, 探针41对GSH的检测具有高度的选择性, 并且探针41的设计思路也可以为双光子类荧光探针的设计研究提供借鉴.

    图 31

    图 31.  探针41与谷胱甘肽识别示意图
    Figure 31.  Schematic diagram of the response mechanism of 41 and GSH
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    2016年, Song等[57]报道了基于卤素取代反应的检测生物硫醇的荧光探针42 (图 32).该探针最大的优点是, 在不同的介质下区分结构较为相似的三种生物硫醇(Cys、Hcy、GSH), 并且探针的水溶性较好.探针42在Tris-HCl (20 mmol•L-1, pH 7.4)缓冲溶液中加入等量的Cys、Hcy、GSH及其他19种氨基酸, 结果表明在有Cys存在的情况下探针42的荧光值增加最大, 其次是Hcy和GSH, 其他19种氨基酸与其基本无响应.探针42通过选择介质可以有效地检测并区分生物硫醇, 具有较好的应用前景.

    图 32

    图 32.  探针42与生物硫醇识别示意图
    Figure 32.  Schematic illustration of reaction of 42 with bio-thiols
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    2015年, Dai等[58]报道了一种能区分检测GSH和Cys、Hcy的氯代香豆素醛荧光探针43 (图 33).通过与探针43两个不同的位点反应, 能有效地区分GSH和Cys、Hcy.在探针43的PBS缓冲溶液中分别加入GSH、Cys和Hcy, 溶液的颜色会发生比较明显的变化, 其中加入GSH的溶液变为红色而加入Cys和Hcy的溶液则变为浅黄色.更重要的是, 探针43已经成功应用于活细胞中生物硫醇的检测, 并且观察到不同生物硫醇所引起的探针43颜色的变化.

    图 33

    图 33.  探针43与生物硫醇识别示意图
    Figure 33.  Schematic illustration of reaction of 43 with bio-thiols
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    2018年, Hou等[59]报道了一种检测GSH/Cys的新型的荧光探针44 (图 34).探针44对GSH/Cys的检测性能明显高于包括Hcy在内的其他氨基酸, 此外探针44与GSH/Cys的响应时间均低于1 h, 因此探针对GSH/Cys的检测具有较好的选择性和灵敏度.在探针44 (10 μmol•L-1)的CH3CN/H2O (V:V=3:7, PBS缓冲溶液, 10 mmol•L-1, pH 7.4)溶液中加入不同浓度的GSH/Cys (0~3 equiv.), 探针44的荧光值随GSH或Cys浓度的变化而变化, 检测限分别为0.12和0.13 μmol•L-1.此外, 探针44的细胞应用试验表明, 探针44具有较好的细胞膜穿透性, 能够应用于活细胞中GSH/Cys的检测.

    图 34

    图 34.  探针44与GSH/Cys识别示意图
    Figure 34.  Schematic illustration of reaction of 44 with GSH/Cys
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    5.   其他识别机理

    1953年, Du Vigneaud等[60]首次报道了运用自然化学连接(NCL)法合成了生物活性多肽激素.该方法主要是应用两个多肽链在水溶液中反应形成硫酯键, 在自发重排时, 硫酯键被转变成酰胺键. NCL反应已被广泛应用于许多领域, 如医药化学、生物学、生理学等. 2014年, Lü等[61]报道了一种检测Hcy和Cys的基于NCL反应的荧光探针45(图 35).在探针45的溶液中加入Cys后, 荧光的发射峰会由694 nm蓝移至474 nm处, 并伴随着溶液由红色荧光变为莹绿色荧光.探针45具有较好的选择性和灵敏度, 其余Hcy和Cys的响应时间均在30 min之内.探针45对Cys和Hcy的检测限分别为1.6和1.8 nmol•L-1.此外, 探针45已经成功应用于活体HepG2细胞中Cys的检测.

    图 35

    图 35.  探针45与Cys识别示意图
    Figure 35.  Schematic illustration of reaction of 45 with Cys
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    自1890年Mond首次报道金属配合物以来, 金属配合物被广泛地应用于各个领域. 2016年, He等[62]报道了一种基于香豆素碳酰肼双核铜配合物的硫醇荧光探针46 (图 36).铜离子的加入使得化合物与铜离子形成配合物, 进而使得探针46的荧光被萃灭.在探针46 (10 μmol•L-1)的CH3CN/H2O (V:V=3:2) PBS缓冲溶液中加入不同浓度的GSH (0~2 equiv.), 探针46的荧光值会随着GSH浓度的增加而增加.探针46对生物硫醇类物质具有较好的选择性, 响应时间约为60 min.此外探针46成功地用于活体SiHa细胞的GSH显像.

    图 36

    图 36.  探针46与GSH识别示意图
    Figure 36.  Schematic illustration of reaction of 46 with GSH
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    纳米材料作为一种新型材料, 近年来已成为研究的热点, 并已应用于许多领域[63, 64].目前, 已经报道了各种基于纳米粒子的荧光探针, 如量子点和金纳米团簇(AuCuS)(图 37)[65]. 2015年, Xu等[66]报道了一种基于金纳米团簇(AUNCS)和聚合物保护金纳米粒子(AUNPS)的荧光探针47, 用于对Cys进行检测(图 37). AuNCS具有较强的荧光特性, 能通过福斯特共振能量转移(FRET)抑制AUNC的荧光. Cys可诱导聚N, N-二甲基丙烯酰胺金纳米颗粒(PDMAM AuNPS)聚集, 并恢复牛血清白蛋白金纳米簇(BSA AuNCS)的一半荧光强度, 而其它浓度较高的氨基酸难以提高其荧光强度.探针47对Cys的检测限为3.6 μmol•L-1, 此外探针47已经被成功地应用于人体尿液中Cys的检测.

    图 37

    图 37.  探针47与Cys识别示意图
    Figure 37.  Schematic illustration of reaction of 47 with Cys
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    2018年, Zhang等[67]报道了一种新型的检测硒代半管氨酸的半花菁类荧光探针48(图 38).半花菁类分子的席夫碱形式(SB)无荧光, 而质子化形式(PSB)都具有较强的荧光信号, 根据这一特性利用硒醇调节水溶液中PSB/SB平衡, 进而实现对光学信号的调控.探针48对硒代半胱氨酸的检测具有较高的选择性和灵敏度.探针48对半胱氨酸的检测具有较高的选择性和灵敏度, 其次探针48对细胞中内源性和外源性硒醇的检测都表现出较好的成像效果.

    图 38

    图 38.  探针48结构示意图
    Figure 38.  Chemical structures of probe 48
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    6.   结语

    近年来, 巯基荧光探针的研究进展非常迅速, 一些较为新颖的方法不断地被报道.然而, 对这些荧光探针的研究仍然面临许多的挑战, 如探针的水溶性问题、探针的生理毒性、生物细胞自身荧光干扰性问题, 以及对三种结构相似的氨基酸(半胱氨酸、HCY和GSH)区分检测的问题等.因此, 预测未来的研究重点如下: (a)提高探针的水溶性; (b)消除自动荧光在生物系统中的固有生物分子中的干扰; (c)有效区分三种类似氨基酸; (d)发展低生理毒性的体内光学成像的方法.

    本文综述了近年来硫醇类荧光探针的研究进展, 重点讨论了巯基氨基酸Cys、Hcy和GSH的研究进展.从硫醇的迈克尔加成、醛的环化、裂解、取代、自然化学连接、纳米材料等方面, 综述了一些具有代表性荧光探针的传感机制、选择性、灵敏度、响应时间等.

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  • 图式 1  探针1与生物硫醇识别示意图

    Scheme 1  Schematic illustration of reaction of 1 with thiols

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    图 2  探针2与半胱氨酸识别示意图

    Figure 2  Schematic illustration of reaction of 2 with Cys

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    图 3  探针3与半胱氨酸识别示意图

    Figure 3  Schematic illustration of reaction of 3 with Cys

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    图 4  探针4与硫醇类物质识别示意图

    Figure 4  Schematic illustration of reaction of 4 with thiols

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    图 5  探针5与生物硫醇类物质识别示意图

    Figure 5  Schematic illustration of reaction of 5 with bio-thiols

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    图 6  探针6与半胱氨酸类物质识别示意图

    Figure 6  Schematic illustration of reaction of 6 with Cys

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    图 7  探针7与生物硫醇类物质识别示意图

    Figure 7  Schematic illustration of reaction of 7 with thiols

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    图 8  探针8与半胱氨酸识别示意图

    Figure 8  Schematic illustration of reaction of 8 with Cys.

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    图 9  探针9与半胱氨酸和SO2识别示意图

    Figure 9  Schematic illustration of reaction of 9 with Cys and SO2

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    图 10  探针10和探针11与谷胱甘肽识别示意图

    Figure 10  Schematic illustration of reaction of 10 and 11 with GSH.

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    图 11  探针12与生物硫醇类物质识别示意图

    Figure 11  Schematic illustration of reaction of 12 with thiols

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    图 12  探针13~22的结构示意图

    Figure 12  Chemical Structures of Two Kinds of Probes, 13~22

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    图 13  探针23与谷胱甘肽识别示意图

    Figure 13  Schematic illustration of reaction of 23 with thiols

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    图 14  探针24与Cys/Hcy识别示意图

    Figure 14  Schematic illustration of reaction of 24 with Cys/ Hcy

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    图 15  探针25与Cys/Hcy识别示意图

    Figure 15  Schematic illustration of reaction of 25 with Cys/ Hcy

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    图 16  探针26与Cys/Hcy识别示意图

    Figure 16  Schematic illustration of reaction of 26 with Cys/ Hcy

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    图 17  探针27与半胱氨酸识别示意图

    Figure 17  Schematic illustration of reaction of 27 with Cys

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    图 18  探针28与半胱氨酸识别示意图

    Figure 18  Schematic illustration of reaction of 28 with Cys

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    图 19  探针29与半胱氨酸识别示意图

    Figure 19  Schematic illustration of reaction of 29 with Hcy

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    图 20  探针30与半胱氨酸识别示意图

    Figure 20  Schematic illustration of reaction of 30 with Cys

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    图 21  探针31与生物硫醇类物质识别示意图

    Figure 21  Schematic illustration of reaction of 31 with bio-thiols

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    图 22  探针32与生物硫醇类物质识别示意图

    Figure 22  Schematic illustration of reaction of 32 with bio-thiols

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    图 23  探针33与生物硫醇类物质识别示意图

    Figure 23  Schematic illustration of reaction of 33 with thiols

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    图 24  探针34与生物硫醇类物质识别示意图

    Figure 24  Schematic illustration of reaction of 34 with bio-thiols

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    图 25  探针35与生物硫醇类物质识别示意图

    Figure 25  Schematic illustration of reaction of 35 with bio-thiols

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    图 26  探针36与生物硫醇类物质识别示意图

    Figure 26  Schematic illustration of reaction of 36 with bio-thiols

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    图 27  探针37与生物硫醇类物质识别示意图

    Figure 27  Schematic illustration of reaction of 37 with bio-thiols

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    图 28  探针38与谷胱甘肽识别示意图

    Figure 28  Schematic illustration of reaction of 38 with GSH

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    图 29  探针39与生物硫醇类物质识别示意图

    Figure 29  Schematic illustration of reaction of 39 with bio-thiols

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    图 30  探针40与谷胱甘肽识别示意图

    Figure 30  Schematic illustration of reaction of 40 with GSH

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    图 31  探针41与谷胱甘肽识别示意图

    Figure 31  Schematic diagram of the response mechanism of 41 and GSH

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    图 32  探针42与生物硫醇识别示意图

    Figure 32  Schematic illustration of reaction of 42 with bio-thiols

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    图 33  探针43与生物硫醇识别示意图

    Figure 33  Schematic illustration of reaction of 43 with bio-thiols

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    图 34  探针44与GSH/Cys识别示意图

    Figure 34  Schematic illustration of reaction of 44 with GSH/Cys

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    图 35  探针45与Cys识别示意图

    Figure 35  Schematic illustration of reaction of 45 with Cys

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    图 36  探针46与GSH识别示意图

    Figure 36  Schematic illustration of reaction of 46 with GSH

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    图 37  探针47与Cys识别示意图

    Figure 37  Schematic illustration of reaction of 47 with Cys

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    图 38  探针48结构示意图

    Figure 38  Chemical structures of probe 48

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  • 发布日期:  2019-04-01
  • 收稿日期:  2018-07-31
  • 修回日期:  2018-10-11
  • 网络出版日期:  2018-04-28
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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