English

• Porter等在1945年发现了内质网, 其作为细胞重要的细胞器, 是细胞质中由膜组成的一系列片状的囊腔和管状的腔, 由粗面内质网和滑面内质网两部分组成.内质网在细胞中将细胞核、细胞质、细胞膜有机地连接成一个整体, 负责物质在细胞中的转运, 同时也是蛋白质、脂类、糖类等的合成基地.膜分泌性蛋白、磷脂、氨基多糖、胆固醇、钙信号等的代谢均和细胞内质网的功能直接相关^[1].此外, 病毒感染、氨基酸剥夺、蛋白表达异常, 氧化剂、还原剂、钙调节异常等应激都可导致未折叠蛋白质在内质网中积累, 进而诱发神经退行性疾病、心脏病、糖尿病和癌症等疾病^[2].因此, 实时跟踪内质网构型变化, 以及其中各类活性生物小分子水平, 对于掌握内质网复杂生理功能过程及与内质网相关疾病的病理机制具有重要意义^[3~6].

  随着荧光标记和分子探针的高速发展, 荧光探针已成为研究亚细胞结构的重要方法, 国内有很多的研究团队, 如彭孝军^[7~9]、田禾^[10~12]、徐玉芳^[13~15], 陈小强^[16~18]、马会民^[19~21]、唐波^[22~24]等都取得了很好的成果.其中靶向内质网荧光探针更是受到了广泛关注.荧光探针通常由荧光信号基团和识别基团组成, 在荧光信号基团上引入靶向内质网定位基团, 就可将探针设计成为靶向内质网荧光探针^[25].基于上述策略, 研究人员已设计合成了许多靶向内质网的小分子荧光探针, 用于细胞和生物体内质网中生物活性小分子的成像研究.本文总结了近10年来内质网靶向荧光探针的设计与合成, 并阐释了其在生物成像、生理变化及医学诊断中的应用.

  1.   单功能内质网成像探针

  荧光探针定位在内质网中, 可使内质网荧光成像, 进而可实时追踪内质网位置和形态的变化, 观察其生理过程.

  2013年, Diniz等^[26]首次将离子型配体1-甲基-3-羧甲基咪唑鎓氯化物链接到镧系元素金属Eu³⁺和Tb³⁺上, 制备了亮绿色的荧光探针2a和2b.该探针有着高度水溶性、稳定性、荧光强度大等优点, 实现了MDA-MB- 231细胞内质网的染色.

  同年, Zhang等^[27]以芴为荧光团, 以氯为定位基团, 设计合成了一种内质网靶向的双光子荧光探针3.该探针具有特异性高、灵敏度高、光稳定性强、毒性低的特点, 可用于监测癌细胞凋亡过程内质网的动态变化.

  D'Amore等^[28]基于Norbormide的亚硝基苯并噁二唑衍生物(NRB-AF12)的荧光探针4.其对内质网有高度的选择性, 可用于标记活细胞内质网、高尔基体、线粒体、溶酶体和内体, 并有着高度的重现性.此外, 由于亚硝基苯并噁二唑是一种独特的血管活性化合物, 因此, 该探针没有明显的毒性.

  Collot等^[29]在方酸菁的相对侧分别引入烃链和两性离子基团, 合成了红色的荧光探针5a; 在方酸菁同侧引入烃链和两性离子, 合成了蓝色的荧光探针5b; 在方酸菁的相对侧同时引入烃链和两性离子基团, 合成了绿色的荧光探针5c.此类探针可在远红/近红外下进行内质网成像, 1 nmol·L^-1的5a和5b在633 nm处荧光强度增强分别增加了20和24倍, 而5c荧光强度增强了110倍.

  Kamkaew等^[30]以氮杂氟硼二吡咯为骨架, 在骨架中引入寡聚乙二醇, 增强其水溶性, 合成了4种荧光探针6a、6b、6c、6d.四种探针有着非常相似的吸收和荧光最大值, 量子产率均在0.26~0.29, 可用于近红外成纤维细胞系、人胰腺癌细胞系、人肝癌细胞系的内质网染色.

  Phaniraj等^[31]在荧光团试卤灵上引入氨基类基团, 设计合成了红色荧光探针7 (Ex. 565 nm, Em. 614 nm).该探针分子疏水性较好, cLogD (pH 7.4)为3.8, 在有机溶剂中的量子产率可达0.7, 可定位于人宫颈癌细胞系HeLa的内质网, 浓度低至100 nmol·L^-1时仍可成像.

  Zheng等^[32]报道了一种基于聚集诱导发射的疏水性荧光探针8, 即1, 2, 3, 6-四氢-2-(萘-1-基)-1, 3-二甲苯基嘧啶-4, 5-二羧酸二甲酯.该探针有着非常规的聚集诱导发光效应, 在405 nm激发下显蓝色.探针具有光稳定性好、信噪比高和与癌症、正常细胞生物相容性好的优点, 内质网荧光成像以浓度20 μmol·L^-1为宜.

  Meinig^[33]等对罗丹明结构进行了修饰, 通过在2'和7'上引入氟取代基增加其光学性能, 以及氨取代基部分的修饰, 合成了定位于内质网的荧光探针9. 该荧光团荧光强度高, 量子产量可达0.85 (Ex. 512 nm, Em 532 nm), 能够特异性地定位于活HeLa细胞的内质网中.

  2.   检测内质网金属离子的荧光探针

  在机体组织细胞、体液中存在着各种金属离子, 他们与人体健康密切相关, 在人体生理、病理变化中发挥重要作用.其中, 铜、锌、钙、镁等负责维持机体核酸、蛋白质等基本结构, 并调节机体功能, 调控生物体的新陈代谢.其他镉、汞、铅等重金属则对机体有着潜在的色Zn²⁺荧光探毒副作用, 因此需控制在特定范围内, 否则将诱发人体的疾病.随着荧光显微技术的发展, 内质网中金属离子的识别和成像备受关注, 各种内质网金属离子探针被相继报道.

  2.1   Ca²⁺荧光探针

  Ca²⁺是细胞中重要的第二信使, 参与细胞生命周期的每个阶段.内质网是细胞重要的Ca²⁺储存代表, Ca²⁺浓度可达到1 mmol·L^-1, 而且内质网是细胞代谢和Ca²⁺信号转导的关键枢纽.靶向内质网Ca²⁺探针, 不仅能实现探针内质网的定位, 还可以监测内质网中的Ca²⁺.

  Lew等^[34]用氯四环素作为荧光探针10, 监测到了Ca²⁺从西葫芦下胚轴向内质网囊泡的移动.其原理是10在非极性环境中可与Ca²⁺选择性地结合, 10荧光的增加速率与Ca²⁺的摄取速率呈正相关性, 可用于植物Ca²⁺摄入囊泡的实时监测.随后, 该小组又将10用于Ca²⁺由红甜菜储存组织转移到内质网膜囊泡的检测, 也取得了不错的结果^[35].

  2.2   Cu²⁺荧光探针

  Cu²⁺不仅是细胞中许多蛋白质的重要组成部分, 还可参与细胞的氧化应激过程, 与许多疾病的发生密切相关.因此, 内质网中Cu²⁺的监测也具有非常重要的研究意义.

  Lee等^[36]以萘二甲酰亚胺为荧光团, 以二苯胺(DPA)作为Cu²⁺受体, 设计合成了一种荧光探针11. 11可选择性定位于内质网, 荧光峰位于485 nm, 在pH 6~8条件下, 荧光信号可被Cu²⁺猝灭, 进而可监测活细胞中的Cu²⁺, 并证实过量的Cu²⁺主要蓄积在内质网中.

  Park等^[37]将酰肼与萘二甲酰亚胺连接, 设计了1种比率型Cu²⁺荧光探针12.在Cu²⁺的催化下, 12的酰肼部分发生水解转化为氨基, 使其荧光在480与545 nm间发生比率变化.该探针在pH 5.0~7.5范围内对Cu²⁺有很好的选择性, 加之优良的生物相容性, 使其可用于监测HeLa细胞中的Cu²⁺.

  2.3   Zn²⁺荧光探针

  Zn²⁺是人类大脑中最重要的阳离子之一, 也是生物生长、繁殖必须的活性成分.同时, Zn²⁺在细胞凋亡、基因表达、神经信号传导、酶调节等环节也发挥着关键作用.因此, 靶向内质网Zn²⁺荧光探针的开发也受到了广泛关注.

  Lin等^[38]基于光致电子转(PET)机制设计了系列红针13a、13b和13c.此类分子以苯并试卤灵作为荧光团, 二甲基吡啶胺或其类似物作为受体, 通过二甲基吡啶胺或其类似物和苯并试卤灵上的氧原子共同与Zn²⁺结合, 使得探针的最大发射波长发生明显红移.

  Zhou等^[39]报道了一种高敏感、响应快速的“OFF- ON”型Zn²⁺荧光探针14. 14由荧光团苯并噻唑、受体二乙基胺水杨醛经键桥苯胺缩合而成. 14与Zn²⁺结合后, 406 nm激发可在490 nm处显示亮绿色的荧光, 荧光强度增大了65倍, 并伴有轻微红移.该探针检测下限为5.8 nmol·L^-1, 体外反应时间10 s, 体内5 min, 实现了细胞内源Zn²⁺的可视化监测, 并可用做植物组织中Zn²⁺的显影剂.

  2.4   Fe³⁺荧光探针

  铁是人体必不可少的微量元素, 同时也是内质网电子传递链蛋白质的关键辅助因子.含铁蛋白释放的Fe³⁺会诱导铁(Fe³⁺)介导的细胞毒, 导致阿尔茨海默病、帕金森病等.因此, 监测活细胞内质网Fe³⁺对于了解其毒性及与人类疾病的关系至关重要.

  Lee等^[40]报道了一种HepG2细胞内质网成像的Fe³⁺探针15a~15f.此类化合物是罗丹明的席夫碱衍生物.在Fe³⁺存在下, 探针于551 nm处出现新的发射峰. Fe³⁺诱导罗丹明中螺内酰胺开环, 引起探针荧光(OFF-ON)变化, 因此HepG2细胞Fe³⁺超载时荧光显著增强.此外, 该探针还具有细胞毒性非常小, 且不受其他竞争性金属离子的干扰的优点.

  3.   检测内质网小分子物质的荧光探针

  在机体的正常发育过程中, 很多小分子物质也发挥着重要的作用, 活性氧、次氯酸根、HNO、H₂S、甲醛等都与多种疾病密切相关.识别小分子物质的荧光具有重要意义, 当前也开发了一些很好的荧光探针来监测组织中小分子物质的变化.

  3.1   H₂O₂荧光探针

  H₂O₂是人体关键的活性氧物质之一, 参与机体各种生理和病理过程, 同时也是细胞代谢中不可避免的副产物. H₂O₂的积累可导致细胞蛋白质的氧化损伤, 引起细胞凋亡, 诱发神经退行性疾病、心血管疾病、代谢性疾病.因此, 开发内质网中H₂O₂有效的分析方法非常重要.

  Xiao等^[41]基于分子内电荷转移(ICT)机理设计了一种内质网H₂O₂荧光探针16.该探针由1, 8-萘酰亚胺荧光团和硼酸酯识别基团组成, 加入H₂O₂后, 颜色由无色变为黄色, 最大吸收由360 nm红移至460 nm, 使其可作为“肉眼可见”的H₂O₂探针, 可对内质网凋亡中的H₂O₂进行监测.

  Gao等^[42]开发了一种比率型H₂O₂荧光探针17, 荧光团为萘二甲酰亚胺, 识别基团为α-酮酰胺.在无H₂O₂存在下, 探针17在365 nm有主要的吸收峰, 而引入H₂O₂后, 探针17在458 nm处出现了一个新的吸收峰, 这是因为H₂O₂存在可使17结构中α-酮酰胺的酰胺键水解, 此时395 nm波长激发可在540 nm获得荧光峰.此外17对H₂O₂具有灵敏度高、选择性高的优点, H₂O₂的检出限低至38 nmol·L^-1, 使得17可用于测定细胞内质网应激时的H₂O₂水平.

  3.2   O₂^·-荧光探针

  活性氧的产生与人体疾病的发生、发展密切相关, 因此, 追踪内质网中超氧化物阴离子(O₂^·-)的水平, 对于揭示疾病的机制和寻找潜在的治疗靶点非常重要.

  Xiao等^[43]报道了一种双光子O₂^·-荧光探针18, 18由双光子荧光团(1, 8-萘酰亚胺)、O₂^·-识别单元(苯并噻唑啉)、内质网/靶向部分(甲基磺酰胺)组成.探针18的荧光通过光致电子转移(PET)机制淬灭, 当苯并噻唑啉与O₂^·-发生脱氢反应后, PET过程被抑制, 进而使得荧光得到恢复.探针18有着灵敏度高、选择性好、内质网靶向能力强和细胞毒性低的特点, 已被用于研究糖尿病小鼠治疗中内源性O₂^·-的变化.

  3.3   ClO^-荧光探针

  次氯酸根离子(ClO^-)是一种活性氧, 在细胞防御微生物、杀死病原体、抗炎症等生物过程中起着至关重要的作用, 内质网中ClO^-的异常是机体多种疾病、损害的基础.因此, 急需开发实时监测和内质网原位成像的ClO^-探针.

  Li等^[44]设计了一种新型荧光探针19, 该化合物由丙二腈、6-(甲基氨基)-2-萘甲醛和N-苯基乙酰胺组成, 有着较高的信噪比.探针19的独特之处在于:当ClO^-、OH^-、H₂O单一存在或两两存在时, 探针的颜色不会出现变化; 而当ClO^-、OH^-、H₂O同时存在时, 探针19在499 nm出现新的荧光峰, 其强度与ClO^-在25.7~385 μmol·L^-1范围内呈线性关系.

  3.4   HNO荧光探针

  硝酰基(HNO)是NO的单电子还原产物, 不仅在心绞痛、心力衰竭等心血管疾病治疗中显示出独特的生物学作用, 还可抑制肿瘤增殖和癌细胞凋亡的关键糖酵解酶GAPDH.此外, NO的异常升高可诱导内质网应激和激活细胞应激反应.因此, 检测内质网中HNO和NO的浓度具有重要的医学价值.

  Liu等^[45]报道了一种近红外HNO荧光探针20, 探针20中四芳基BODIPY作为荧光团, 二苯基膦苯甲酰基作为HNO识别基团.当检测到HNO时, 探针的量子产率从0.01增加到0.35, 检测限为0.03 μmol·L^-1, 可定性、定量的测定水溶液、活细胞和内质网中的HNO浓度.

  Ali等^[46]设计了一种“OFF-ON”型HNO荧光探针21.该化合物同样适用氟化硼络合二吡咯甲川(BODIPY)作为荧光团, 可使其在近红外荧光成像, 识别基团二苯基膦苯甲酰基与HNO结合后, 发生脱羧反应, 使得荧光量子产率增大52.5倍. 21有着高的选择性、优异的灵敏度和低的细胞毒性, 还可用于结构光显微镜下的荧光成像.

  3.5   甲醛荧光探针

  甲醛在化妆品、塑料、药物等领域有着广泛的应用, 是第三大室内化学污染物.而且, 甲醛还可与DNA结合, 诱发记忆力减退、癌症、自然流产等疾病.尽管甲醛有着各种危害, 但其却存在于细胞中, 并在细胞代谢中发挥重要作用.因此, 开发内质网甲醛检测方法非常重要.

  Tang等^[47]设计了一种新型甲醛荧光探针22, 22由荧光团萘酰亚胺、靶向内质网定位基团对甲苯磺酰胺和识别基团肼基构成, 可在PET机制下发生荧光淬灭.该探针已成功应用于可视化监测活细胞内质网内的内源性甲醛.具体机理为, 在甲醛的存在下, 22中的肼基与其发生缩合反应, 造成荧光强度的增加, 从而用于甲醛的检测.

  3.6   H₂S荧光探针

  H₂S是一种有毒有害气体, 长期接触可能导致唐氏综合征、阿尔茨海默病、糖尿病、肝硬化等恶性疾病.同时, H₂S也是一种气体信号分子, 在生物体中起着重要生理功能, 内源性H₂S参与调控心血管系统调控、细胞增殖和凋亡、稳定神经和免疫系统等生理活动.但H₂S的大部分生理功能仍未知, 因此开发高灵敏度、高选择性的H₂S检测方法对于复杂生物系统中相关生物学过程的理解具有非常重要的意义.

  Tang等^[48]设计了首个内质网靶向的H₂S双光子荧光探针23.该化合物以1, 8-萘酰亚胺为荧光基团, 对甲苯磺酰胺为定位机体, 叠氮为响应机体.当H₂S作用于探针23时, 叠氮被H₂S还原为胺, 使得其545 nm处荧光强度增大45倍.探针23有着较高的灵敏度和选择性, 可用于活细胞内质网H₂S的动态监测.

  4.   检测内质网大分子物质的荧光探针

  细胞组织中存在着很多的大分子物质, 如Cys、羧酸酯酶、半胱天冬酶、氨肽酶等, 这些大分子物质在机体发育中起重要作用, 并与癌症、糖尿病、牛皮癣、艾滋病等密切相关, 因此有效监测组织中大分子物质的变化, 可充分地评估疾病的发生和发展, 为靶向疾病的治疗提供支持.荧光探针实现了细胞中大分子物质的简便、快捷、灵敏的实时监测.

  4.1   Cys荧光探针

  细胞Cys水平的变化与神经毒性有关, Cys的缺乏可导致血功能减退、生长缓慢、毛发脱色、白细胞丢失、牛皮癣等多种综合征.内质网发生应激时, Cys可通过捕获自由基和活性氧来维持内质网环境的氧化还原状态.因此, 监测内质网中的Cys对于更好地理解Cys的生物学功能非常重要, 有助于相关疾病的早期诊断.

  Meng等^[49]报道了一种由香豆素配体与铜离子络合的“ON-OFF-ON”型可逆Cys荧光探针24.该探针的作用机制为, 荧光团香豆素配体与Cu²⁺络合后, 98.4%的荧光强度淬灭, 而加入Cys后, 香豆素配体与铜离子的络合物发生解络, 使得香豆素配体荧光得到恢复, 根据这一变化过程来检测Cys.此外, 香豆素配体可通过被动扩散途径进入活细胞内, 并定位于脂质致密的内质网中.探针24有着较高的选择性和灵敏度, 检测限为7.2×10^-7 mol·L^-1, 可应用于活细胞内质网中Cys的定量荧光检测及真实尿液样品中的Cys检测.

  4.2   羧酸酯酶荧光探针

  羧酸酯酶属丝氨酸水解酶家族, 可催化含酯键、酰胺键、硫酯键的内源性和外源性物质水解, 同时参与脂质的运输和代谢, 并与多种药物、环境毒物、致癌物的解毒和代谢有关.羧酸酯酶主要定位于内质网中, 能够将多种含酯前体药物水解成活化形式.

  Hakamata等^[50]开发了系列羧酸酯酶探针25a~25c, 三者的的荧光基团分别为试卤灵、香豆素和罗丹明, 在细胞中可发生不可逆的酯水解和醌甲基化物裂解, 释放荧光团, 进而可特异性地对内质网中羧酸酯酶进行定位.

  4.3   半胱天冬酶荧光探针

  半胱天冬酶是一类在进化上非常保守的蛋白酶, 属半胱氨酸蛋白酶家族, 是细胞凋亡的关键调控因子, 可用作判断细胞死亡特殊标记物.

  Shaulov-Rotem等^[51]开发了一种高分辨率、选择性荧光淬灭的半胱天冬酶-3荧光探针26. 26由半胱天冬酶的选择性抑制剂和荧光团组成, 可用于研究细胞凋亡.

  4.4   内质网氨肽酶1荧光探针

  内质网氨肽酶1是M1肽酶家族的金属肽酶, 在体内抗原生成中发挥重要作用.研究发现机体很多疾病都由内质网氨肽酶1异常引起.因此, 有效监测内质网氨肽酶1对于疾病的诊治非常重要.

  Xu等^[52]报道了一种内质网靶向双光子荧光探针27用于监测内质网氨肽酶1. 27含有1, 8-萘二甲酰亚胺(双光子荧光团)、甲基磺酰胺(内质网靶向基团)、L-亮氨酸(触发部分), 该探针对内质网氨肽酶1有着高度的选择性, 当二者作用时, 探针550 nm处荧光强度增大约95倍, 进而可监测不同氧化还原条件下活细胞和组织中氨肽酶的活性.

  5.   检测内质网微环境的荧光探针

  众所周知, 细胞的生长与其所处的微环境密切相关, 当pH、温度、粘度、极性、膜流动性等微环境发生变化后, 细胞异常可诱发机体发生各种代谢性疾病.因此, 时时监测细胞微环境的变化, 对于疾病的防治意义深远.

  5.1   pH荧光探针

  细胞内pH值的细微变化与细胞凋亡、细胞增殖、细胞生长、钙调节、趋化性、细胞功能等生物学过程息息相关.监测活细胞中pH值的变化有助于理解pH值与细胞过程间的关系.因此, 可应用于活细胞、高灵敏性、高稳定性、高荧光强度的pH荧光探针受到了关注.

  McMahon等^[53]开发了一种高量子产率的pH荧光探针28.该化合物由Eu(Ⅲ)首先与含对位的芳基炔基的三氮杂环络合, 接着与磺酰胺进一步络合制备而成. 28可选择性地定位于活细胞内质网中, 荧光强度随pH的增加而增大, 因而可用于测定内质网的pH值变化.

  Ghule等^[54]基于氨基核取代萘二酰亚胺设计合成了一种斯托克斯位移较大的内质网pH荧光探针29.随着pH的变化, 萘二酰亚胺衍生物的二胺部分可发生可逆的质子化-去质子化过程, 使29的光谱强度发生变化, 进而反映出体系的pH值.探针29有着优良的光稳定性、选择性、高灵敏度、低细胞毒性特性, 可用于评估内质网pH值.

  Upendar等^[55]基于荧光共振能量转移(FRET)机制设计合成了一种pH荧光探针30. 400 nm激发波长下, 探针30在493 nm的荧光强度随pH (3.5~8.0)的升高而增大, 同时525 nm处的发射峰随pH (3.5~8.0)的升高而降低. 30为罗丹明的衍生物, 有着165 nm的伪斯托克斯位移, 加之无毒特性, 应用于监测内质网中地塞米松诱导的内源性pH的变化.

  5.2   温度荧光探针

  维持体温对恒温动物是非常重要的, 在亚细胞水平上, 线粒体、内质网是产热细胞器, 备受关注.但在亚细胞水平上, 细胞热量产生、传播的动力学仍然难以捉摸.

  Arai等^[56]报道了首个靶向内质网的小分子荧光温度计31, 是迄今为止最高灵敏度(3.9%/℃)的温度荧光探针. 31将内质网染色后, 其荧光强度随温度的升高而降低, 当温度降回初始温度时, 其荧光强度恢复到初始强度. 31可用于监测外部热源引起的细胞内温度梯度, 实时显示产生热量的动态.

  5.3   粘度、极性荧光探针

  内质网中部分未折叠或糖基化蛋白质的积累会造成内质网粘度、极性的改变, 诱发机体代谢性疾病.因此, 在内质网应激期预测内质网粘度、极性的变化非常重要.

  Yang等^[57]合成了一种基于氟硼二吡咯和尼罗红的荧光探针32.该化合物通过(CH₂)₆片段将2个荧光团连接起来, 氟硼二吡咯BODIPY部分通过键能转移的荧光变化检测粘度, 尼罗红以ICT机理测定极性. 32可通过575和625 nm处荧光强度比值, 和516 nm处荧光寿命比率来监测内质网局部粘度和极性的变化.

  Hoyeon等^[58]开发了一种BODIPY、香豆素经长烷基链(n-C₁₈)连接构成的内质网膜选择性荧光探针33.随着溶剂粘度的增加, 33在439 nm处的荧光强度增强了5倍, 在518 nm处的荧光强度增强了7倍. 33的发射峰比值I₅₁₈/I₄₃₉与溶剂的粘度成线性关系, 而与溶剂的极性关系不大.

  Xiao等^[59]设计了一种荧光和光声双模式的探针34.该探针受到633 nm激光光激发后, 在800 nm出现荧光峰, 荧光强度随周围环境的极性下降而增大. 34基于ICT设计, 在不同极性环境下, 其700和800 nm处吸光度强度变化不同, 因此700和800 nm间的光声强度比可实现极性的量化.基于34对环境极性的高度敏感和选择性, 其已被用于检测小鼠肝组织内质网的极性.

  Takakura等^[60]基于膜透性硅-罗丹明染料的高密度特性, 设计合成了环境敏感型内质网探针35.环境极性的变化可引起35分子内螺环化的可逆闭合, 进而造成荧光的改变. 35有着荧光强度大、光稳定性高、通用性强、无毒等的优点, 可用于监测活细胞内质网的二维和三维动态.能够以50 nm的空间分辨率实现活细胞2D、3D成像15 min以上.

  5.4   膜流动性荧光探针

  细胞膜流动性通过调控其扩散和旋转运动来影响转运蛋白、受体等膜蛋白的功能.细胞膜流动性异常与肥胖、动脉粥样硬化、癌症、糖尿病、高胆固醇血症、阿尔茨海默病等疾病密切相关.因此, 细胞膜流动性探针的开发同样是当前研究的热点.

  Kaplfán等^[61]以荧光探针36分析了氧自由基生成系统、H₂O₂等所引起内质网膜流动性的变化, 同时也发现药物Stobadine可防止自由基诱导的内质网膜流动性的变化.

  Yang等^[62]基于FRET机理设计了一种BODIPY/尼罗红杂交探针37, 可优先定位于内质网.从BODIPY到尼罗红的强能量转移可使37在非水环境中发光, 进而了用于检测内质网膜流动性.将37应用于HepG2细胞, 发现:代谢综合征模型细胞中, 细胞内质网流动性显著降低.

  6.   总结与展望

  近年来, 荧光检测技术得到了长足的发展, 准确性和灵敏度都有了很大的提升, 可以检测生物体内的多种活性物种.定位于内质网的有机小分子荧光探针, 以其特异的内质网靶向性, 识别和提供内质网中客体信息, 成为研究的热点之一.当前, 已报道的内质网荧光探针, 多数针对单纯内质网成像、金属离子(Ca²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺)、小分子物质(H₂O₂、O₂^·-、ClO^-、HNO、HCHO、H₂S)、大分子物质(Cys、羧酸酯酶、半胱天冬酶、内质网氨肽酶1)、微环境(pH、温度、粘度、极性、膜流动性)等.

  在荧光探针的设计中, 针对萘酰亚胺、氟硼吡咯、罗丹明等常见荧光团进行结构修饰, 连接上特异性的响应基团和内质网定位基团, 获得较高量子产量、较大斯托克斯位移、较好光稳定性的探针, 是当前内质网荧光探针发展的方向.此外, 针对内质网中粘度、极性、膜流动性等微环境的小分子荧光探针的灵敏度普遍不高, 这极大的限制了该类探针的发展, 是当前生物医学、诊断领域的薄弱环节, 因此提高该类探针的灵敏度是后续研究努力的方向之一.

• 1. [1]

     Vance, J. E. Traffic 2015, 16, 1. doi: 10.1111/tra.2015.16.issue-1

  2. [2]

     Sovolyova, N.; Healy, S.; Samali, A.; Logue, S. E. Biol. Chem. 2014, 395, 1. doi: 10.1515/hsz-2013-0174

  3. [3]

     Zhang, H.; Hu, J. Trends Cell Biol. 2016, 26, 934. doi: 10.1016/j.tcb.2016.06.002

  4. [4]

     Brodsky, J. L.; Skach, W. R. Curr. Opin. Cell Biol. 2011, 23, 464. doi: 10.1016/j.ceb.2011.05.004

  5. [5]

     Borgese, N.; Francolini, M.; Snapp, E. Curr. Opin. Cell Biol. 2006, 18, 358. doi: 10.1016/j.ceb.2006.06.008

  6. [6]

     Westrate, L. M.; Lee, J. E.; Prinz, W. A.; Voeltz, G. K. Annu. Rev. Biochem. 2015, 84, 791. doi: 10.1146/annurev-biochem-072711-163501

  7. [7]

     Li, M.; Fan, J. L.; Li, H. D.; Du, J. J.; Long, S. R.; Peng, X. J. Biomaterials 2018, 164, 98. doi: 10.1016/j.biomaterials.2018.02.044

  8. [8]

     Liu, S. Y.; Ge, G. B.; Dong, W. B.; Peng, X. J.; Liu, F. Y.; Chen, S. S.; Sun, S. G. Sens. Actuators, A 2017, 253, 1145.

  9. [9]

     Li, H. D.; Yao, Q. C.; Fan, J. L.; Du, J. J.; Wang, J. Y.; Peng, X. J. Biosens. Bioelecton. 2017, 94, 536. doi: 10.1016/j.bios.2017.03.039

  10. [10]

      Xu, G.; Yan, Q. L.; Lv, X. G.; Zhu, Y.; Xin, K.; Shi, B.; Wang, R. C.; Chen, J.; Gao, W.; Shi, P.; Fan, C. H.; Zhao, C. C.; Tian, H. Angew. Chem., Int. Ed. 2018, 57, 3626. doi: 10.1002/anie.201712528

  11. [11]

      Han, H. H.; Qiu, Y. J.; Shi, Y. Y.; Wen, W.; He, X. P.; Dong, L. W.; Tan, Y. X.; Long, Y. T.; Tian, H.; Wang, H. Y. Theranostics 2017, 8, 3268.

  12. [12]

      Zhang, J. J.; Fu, Y. X.; Han, H. H.; Zang, Y.; Li, J.; He, X. P.; Feringa, B. L.; Tian, H. Nat. Commun. 2017, 8, 987. doi: 10.1038/s41467-017-01137-8

  13. [13]

      Wu, H. J.; Jia, J. H.; Xu, Y. F.; Qian, X. H.; Zhu, W. P. Sens. Actuator, B 2018, 265, 59. https://www.researchgate.net/publication/322894567_A_reusable_bifunctional_fluorescent_sensor_for_the_detection_and_removal_of_silver_ions_in_aqueous_solutions

  14. [14]

      Ti, Y. Z.; Yu, L.; Tang, Y. Jin, T. X.; Yang, M.; Wang, R.; Xu, Y. F.; Zhu, W. P. Sens. Actuator, B 2018, 265, 582.

  15. [15]

      Li, D. D.; Xu, Y. Q.; Zhou, N. N.; Liu, J. X.; Wang, R.; Cheng, T.; Tang, Y.; Zhu, W. P.; Xu, Y. F.; Qian, X. H. Dyes Pigm. 2017, 136, 627. doi: 10.1016/j.dyepig.2016.09.014

  16. [16]

      Li, J.; Chen, Y. H.; Chen, T. T.; Qiang, J.; Zhang, Z. J.; Wei, T. W.; Zhang, W.; Wang, F.; Chen, X. Q. Sens. Actuator, B 2018, 268, 446.

  17. [17]

      Lee, D.; Jeong, K.; Luo, X.; Kim, G.; Yang, Y. J.; Chen, X. Q.; Kim, S.; Yoon, J. J. Mater. Chem. B 2018, 6, 2541. doi: 10.1039/C7TB01560G

  18. [18]

      Zhang, Z. J.; Wei, T. W.; Chen, Y. H.; Chen, T. T.; Chi, B.; Wang, F.; Chen, X. Q. Sens. Actuator, B 2018, 255, 2211.

  19. [19]

      Wu, X. F.; Shi, W.; Li, X. H.; Ma, H. M. Angew. Chem., Int. Ed. 2017, 56, 15319. doi: 10.1002/anie.201708428

  20. [20]

      Xu, Y. H.; Shi, W.; He, X. Y.; Wu, X. F.; Li, X. H.; Ma, H. M. Anal. Chem. 2017, 89, 10980. doi: 10.1021/acs.analchem.7b02815

  21. [21]

      Fang, Y.; Chen, W.; Shi, W.; Li, H. Y.; Xian, M.; Ma, H. M. Chem. Commun. 2017, 53, 8759. doi: 10.1039/C7CC04093H

  22. [22]

      Wang, H.; Xue, K.; Li, P.; Yang, Y. Y.; He, Z. X.; Zhang, W.; Zhang, W.; Tang, B. Anal. Chem. 2018, 90, 6020. doi: 10.1021/acs.analchem.7b04885

  23. [23]

      Yang, L. M.; Li, J.; Pan, W.; Wang, H. Y.; Li, N.; Tang, B. Chem. Commun. 2018, 54, 3656. doi: 10.1039/C8CC01335G

  24. [24]

      Gao, X. N.; Jiang, L. L.; Hu, B.; Kong, F. P.; Liu, X. J.; Xu, K. H.; Tang, B. Anal. Chem. 2018, 90, 4719. doi: 10.1021/acs.analchem.7b05343

  25. [25]

      Jones, V. C.; McKeown, L.; Verkhratsky, A.; Jones, O. T. BMC Neurosci. 2008, 9, 10. doi: 10.1186/1471-2202-9-10

  26. [26]

      Diniz, J. R.; Correa, J. R.; Moreira, D.; Fontenele, R. S.; Oliveira, A. L.; Abdelnur, P. V.; Dutra, J. D. L.; Freire, R. O.; Rodrigues, M. O.; Neto, B. A. D. Inorg. Chem. 2013, 52, 10199. doi: 10.1021/ic4017678

  27. [27]

      Zhang, H; Fan, J. L.; Dong, H. J.; Zhang, S. Z.; Xu, W. Y.; Wang, J. Y.; Gao, P.; Peng, X. J. J. Mater. Chem. B 2013, 1, 5450. doi: 10.1039/c3tb20646g

  28. [28]

      D'Amore, C.; Orso, G.; Fusi, F.; Pagano, M. A.; Miotto, G.; Forgiarini, A.; Martin, S. D.; Castellani, G.; Ribaudo, G.; Rennison, D.; Brimble, M. A.; Hopkins, B.; Ferrarese, A.; Bova, S. Front Pharmacol. 2016, 7, 315.

  29. [29]

      Collot, M.; Kreder, R.; Tatarets, A. L., Patsenker, L. D.; Mely, Y.; Klymchenko, A. Chem. Commun. 2015, 51, 17136. doi: 10.1039/C5CC06094J

  30. [30]

      Kamkaew, A.; Thavornpradit, S.; Puangsamlee, T.; Xin, D.; Wanichachev, N.; Burgess, K. Org. Biomol. Chem. 2015, 13, 8271. doi: 10.1039/C5OB01104C

  31. [31]

      Phaniraj, S.; Gao, Z.; Rane, D.; Peterson, B. R. Dyes Pigm. 2016, 135, 127. doi: 10.1016/j.dyepig.2016.05.007

  32. [32]

      Zheng, S.; Huang, C.; Zhao, X.; Zhang, Y.; Liu, S.; Zhu, Q. Spectrochem. Acta A 2017, 189, 231.

  33. [33]

      Meinig, J. M.; Fu, L.; Peterson, B. R. Angew. Chem., Int. Ed. 2015, 54, 9696. doi: 10.1002/anie.v54.33

  34. [34]

      Lew, R. L.; Briskin, D. P.; Wyse, R. E. Plant Physiol. 1986, 82, 47. doi: 10.1104/pp.82.1.47

  35. [35]

      Giannini, J. L.; Gildensoph, L. H.; Reynolds-niesman, I.; Briskin, D. P. Plant Physiol. 1987, 85, 1129-1136. doi: 10.1104/pp.85.4.1129

  36. [36]

      Lee, Y. H.; Park, N.; Park, Y. B.; Hwang, Y. J.; kang, C.; Kim, J. S. Chem. Commun. 2014, 50, 3197. doi: 10.1039/C4CC00091A

  37. [37]

      Park, S. Y.; Kim, W.; Park, S. H.; Han, J. Y.; Lee, J.; Kang, C.; Lee, M. H. Chem. Commun. 2017, 53, 32.

  38. [38]

      Lin, W.; Buccella, D.; Lippard, S. J. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 13512. doi: 10.1021/ja4059487

  39. [39]

      Gan, X.; Sun, P.; Li, H.; Tian, X.; Zhang, B.; Wu, J.; Tian, Y.; Zhou, H. Biosens. Bioelectron. 2016, 86, 393. doi: 10.1016/j.bios.2016.06.087

  40. [40]

      Lee, M. H.; Lee, H.; Chang, M. J.; Kim, H. S.; Kang, C.; Kim, J. S. Dyes Pigm. 2016, 130, 245. doi: 10.1016/j.dyepig.2016.03.032

  41. [41]

      Xiao, H.; Li, P.; Hu, X.; Shi, X.; Zhang, W.; Tang, B. Chem. Sci. 2016, 7, 6153. doi: 10.1039/C6SC01793B

  42. [42]

      Gao, C.; Tian, Y.; Zhang, R. B.; Jing, J.; Zhang, X. Anal. Chem. 2017, 89, 12945. doi: 10.1021/acs.analchem.7b03809

  43. [43]

      Xiao, H.; Liu, X.; Wu, C.; Wu, Y.; Li, P.; Guo, X.; Tang, B. Biosens. Bioelectron. 2017, 91, 449. doi: 10.1016/j.bios.2016.12.068

  44. [44]

      Li, J. P.; Xia, S.; Zhang, H.; Qu, G. R.; Guo, H. M. Sens Actuator, B 2018, 255, 622.

  45. [45]

      Liu, P.; Han, X. Y.; Yu, F. B.; Chen, L. X. Chin. J. Anal. Chem. 2015, 43, 1829. doi: 10.1016/S1872-2040(15)60883-0

  46. [46]

      Ali, F.; Sreedharan, S.; Ashoka, A. H.; Saeed, H. K.; Smythe, C. G. W.; Thomas, J. A.; Das, A. Anal. Chem. 2017, 89, 12087. doi: 10.1021/acs.analchem.7b02567

  47. [47]

      Tang, Y.; Ma, Y.; Xu, A.; Xu G.; Lin, W. Methods Appl. Fluoresc. 2017, 5, 024005. doi: 10.1088/2050-6120/aa6773

  48. [48]

      Tang, Y.; Xu, A.; Ma, Y.; Xu, G.; Gao, S.; Lin, W. Sci. Rep. 2017, 7, 12944. doi: 10.1038/s41598-017-13325-z

  49. [49]

      Meng, Q.; Jia, H.; Succar, P.; Zhao, L.; Zhang, R.; Duan, C.; Zhang, Z. Biosens. Bioelectron. 2015, 74, 461. doi: 10.1016/j.bios.2015.06.077

  50. [50]

      Hakamata, W.; Tamura, S.; Hirano, T.; Nishio, T. ACS Med. Chem. Lett. 2014, 5, 321. doi: 10.1021/ml400398t

  51. [51]

      Shaulov-Rotem, Y.; Merquiol, E.; Weiss-Sadan, T.; Moshel, O.; Salpeter, S.; Shabat, D.; Kaschani, F.; Kaiser, M.; Blum, G. Chem. Sci. 2016, 7, 1322. doi: 10.1039/C5SC03207E

  52. [52]

      Xu, S.; Liu, H. W.; Hu, X. X.; Huan, S. Y.; Zhang, Y.; Liu, Y.; Yuan, L.; Qu, F. L.; Zhang, X. B.; Tan, W. Anal. Chem. 2017, 89, 7641. doi: 10.1021/acs.analchem.7b01561

  53. [53]

      McMahon, B. K.; Pal, R.; Parker, D. Chem. Commun. 2013, 49, 5363. doi: 10.1039/c3cc42308e

  54. [54]

      Ghule, N. V.; Bhosale, R. S.; Kharat, K.; Puyad, A. L.; Bhosale, S. V.; Bhosale, S. V. ChemPlusChem 2015, 80, 485. doi: 10.1002/cplu.201402307

  55. [55]

      Upendar, R. G.; Anila, H. A.; Firoj, A.; Nandaraj, T.; Samit, C.; Amitava, D. Org. Lett. 2015, 17, 5532. doi: 10.1021/acs.orglett.5b02568

  56. [56]

      Arai, S.; Lee, S. C.; Zhai, D.; Suzuki, M.; Chang, Y. T. Sci. Rep. 2014, 4, 6701.

  57. [57]

      Yang, Z.; He, Y.; Lee, J. H.; Chae, W. S.; Ren, W. X.; Lee, J. H.; Kang, C.; Kim, J. S. Chem. Commun. 2014, 50, 11672. doi: 10.1039/C4CC04915B

  58. [58]

      Lee, H.; Yang, Z.; Wi, Y.; Kim, T. W.; Verwilst, P.; Lee, Y. H.; Han, G.; Kang, C.; Kim, J. S. Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2474. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.5b00508

  59. [59]

      Xiao, H.; Wu, C.; Li, P.; Gao, W.; Zhang, W.; Zhang, W.; Tong, L.; Tang, B. Chem. Sci. 2017, 8, 7025. doi: 10.1039/C7SC02330H

  60. [60]

      Takakura, H.; Zhang, Y.; Erdmann, R. S.; Thompson, A. D.; Lin, Y.; McNellis, B.; Rivera-Molina, F.; Uno, S.; Kamiya, M.; Urano, Y.; Rothman, J. E.; Bewersdorf, J.; Schepartz, A.; Toomre, D. Nat. Biotechnol. 2017, 35, 773. doi: 10.1038/nbt.3876

  61. [61]

      Kaplfán, P.; Račay, P.; Lehotský, J.; Mézešová, V. Neurochem. Res. 1995, 20, 815. doi: 10.1007/BF00969693

  62. [62]

      Yang, Z.; Wi, Y.; Yoon, Y. M.; Verwilst, P.; Jang, J. H.; Kim, T. H.; Kang, C.; Kim, J. S. Chem. Asian J. 2016, 11, 527. doi: 10.1002/asia.v11.4

•