天然化合物在保护人类健康和治疗人类疾病等方面起着十分重要的作用[1], 许多药物直接来源于天然化合物或者受天然化合物的启发[2].从20世纪40年代到2010年, 65%的抗菌小分子药物和41%的抗癌小分子药物均来自天然化合物及其衍生物, 因此, 天然化合物仍然是药物开发的宝库, 是现代药物开发过程中的支柱[3].从20世纪到21世纪的100多年内, 合成化学得到了长足的发展, 化学合成技术通过设计相关反应步骤, 从头全合成或半合成了一系列天然化合物.在理论上, 合成化学可以通过设计合成路线从头全合成或半合成天然化合物, 但针对结构复杂的天然药物, 化学合成存在着合成路线长、总产率低和经济性差等问题[3, 4], 而且化学合成路线中一般会使用大量“保护”和“脱保护”的步骤, 各步中间体也需要分离和纯化, 除了大量的有机试剂, 一些合成反应还需要使用昂贵的重金属催化剂(图 1B).因此, 对大部分植物来源的天然产物而言, 由于结构复杂而无法通过从头化学合成实现产业化, 它们的获取还依赖于药用植物的生长、化合物抽提与纯化这一传统的天然化合物制备方法(图 1A).
(A) Plant extraction, (B) synthetic biology approaches, (C) chemical synthesis, (D) combined synthetic biology and chemical synthesis
然而, 传统的依赖于植物提取的天然化合物制备方法具有很大局限性.首先对大多数植物天然产物而言, 它们的共同特点是在宿主中含量非常低.例如, 生长100年的太平洋紫杉的树皮大约为3 kg, 其中仅含300 mg紫杉醇, 含量只占树皮干重的万分之一左右[5]. 5~7年生的人参中活性成份人参皂苷含量仅占根部干重的2%左右, 而一些具有重要药用活性的稀有皂苷的含量更是低于十万分之一[6].传统方法需要从大量的植物资源中获得微量的活性成份, 它不仅造成了植物资源的极大浪费, 也给野生植物资源带来了严重的破坏, 甚至会威胁到部分濒危的植物物种.其次, 由于野生药用植物资源的匮乏, 目前植物天然化合物的提取主要依赖于药用植物的栽培, 药用植物的产量及活性成份的含量常受诸如地域气候等诸多地理条件的影响, 而高密度种植药用植物时, 施肥和病虫害控制所带来的化肥和农药等残留物会影响提取物的品质.此外, 由于植物来源的提取物成份复杂且杂质较多, 需要通过多步化学提取与纯化, 以获得其中的活性成分, 因此抽提物的品质及提取过程的成本都较难控制.正是由于大多数植物天然化合物具有成分多样、结构复杂、含量稀少这些共同特性, 传统的天然产物分离提取获得其中某种单一成分以用于活性筛选和功能鉴定是一项繁琐的系统工程.这不仅限制了植物天然活性化合物的活性筛选与功能鉴定, 更限制了有良好应用前景的天然化合物的规模化制备与应用(图 1A).
合成生物学是近年来兴起的对生命系统和过程进行重新设计和工程化构建与应用的科学[7], 被预测为未来改变世界的十大颠覆性技术之一, 也将为天然化合物的规模化生产及新结构的小分子化合物的设计与合成提供全新的策略[2].随着DNA测序效率的快速提高与测序成本的大幅度下降, 以及系统生物学分析水平的提高, 越来越多的药用植物的基因组及转录组得到分析, 一些重要天然化合物的生物合成途径也在逐步得到解析.在此基础上, 新兴的合成生物学技术, 可以通过在微生物底盘细胞中重构天然化合物的异源合成途径, 较便捷地获得足够量的天然产物样品用于活性筛选与功能鉴定, 为植物活性化合物的开发与应用提供了新途径.该技术已在青蒿酸等植物天然化合物的制备中取得了成功[8], 近年来也不断有利用合成生物学方法制备其他活性植物天然产物的报道, 涉及的天然产物包括萜类[9]、黄酮类[10]、多酚类[11]、生物碱[12]等, 这些新技术形成的绿色、高效的生产链正在被科学及工业界认可.因此, 植物天然活性化合物的这一新型制备模式, 不仅可以快速获得足够量的活性化合物单体用于它们的活性筛选, 也将为成药的天然化合物提供低成本的生产与纯化工艺, 同时为保护和开发珍稀植物资源、开展新药创制提供新的途径.合成生物学技术在植物活性天然化合物制备方面的应用, 也将有效地提升我国中草药等天然资源的开发利用能力, 并推动中药现代化进程(图 1C, 1D).
本综述中, 我们将以青蒿素、人参皂苷、丹参酮、丹参素、红景天苷、天麻素、吗啡类生物碱、紫杉醇、长春花碱等天然化合物的人工合成为例, 介绍合成生物学在从头合成植物天然化合物方面的应用及特点, 及与合成化学的结合.另外, 我们也将讨论从头合成植物天然化合物研究的新发展趋势.
疟疾是由疟原虫引发的一种疾病, 每年大约有100万人因为感染疟疾而死亡, 并且每年有2亿的新感染病例[13].青蒿素是我国科学家屠呦呦等[14]参与的全国大协作团队在20世纪70年代, 从传统中草药植物黄花蒿中提取并鉴定出的高效抗疟疾药物. 2002年青蒿素的衍生物被世界卫生组织(WHO)认定为抗击疟疾的一线用药, 为了能够获得青蒿素的持续稳定供应, 降低发展中国家患者的医疗负担, 挽救更多的患者, Keasling课题组开始探索青蒿素的生物异源合成技术.
他们[15]首先评估了来自不同植物的三个编码倍半萜环化酶的合成效率, 确定了环化酶的活性是大肠杆菌合成倍半萜的限制步骤, 并优化了紫穗槐二烯合成酶(ADS)的密码子, 同时过表达了前体合成的1-脱氧木酮糖-5磷酸途径(DXP途径)上的三个限速酶[1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)、异戊烯基焦磷酸异构酶(IPPHp)和法尼基焦磷酸合酶(IspA)].为了进一步增加前体的供给, 他们[16]还将酵母的甲羟戊酸途径(Mevalonate pathway, MVA途径)构建在大肠杆菌DH10B中, 最终使紫穗槐二烯(青蒿素的前体)的产量提高了36倍. 2006年他们[17]将来源于黄花蒿的紫穗槐二烯合酶(ADS)基因、细胞色素P450单加氧酶(CYP71AV1)基因和NADPH-P450还原酶(CPR)基因导入酵母中, 经过途径的优化, 酵母细胞工厂中青蒿酸的产量达到153 mg/L.在以上研究的基础上, Keasling研究团队[18]决定比较大肠杆菌和酵母两个底盘细胞异源合成青蒿酸的潜力, 所以, 2007年他们[18]又在大肠杆菌中成功构建了青蒿酸的合成途径, 并通过利用黄花蒿来源的P450还原酶替代之前的热带假丝酵母P450还原酶.尽管重构的大肠杆菌细胞工厂的青蒿酸产量增加到100 mg/L以上, 但由于大肠杆菌缺乏真核生物的内膜系统, 表达黄花蒿来源的P450及其还原酶的效率受限.他们还考虑了通过不同底盘细胞(酵母和大肠杆菌)的共培养来合成青蒿酸, 但是由于成本太高而没有可行性[2], 因此他们最终选择了酵母底盘细胞用于后续的研究.
随着青蒿酸合成途径的解析, 将酵母细胞工厂中青蒿酸合成途径中的关键酶都置换成植物来源的生物元件, 从而进一步提高了酵母细胞工厂青蒿酸的产量.这些酶包括了:由紫穗槐二烯合成青蒿酸所需的P450 (CYP71AV1)及其还原酶[17]、氧化青蒿醇所需的脱氢酶(ADH1)[10]、从青蒿醛到二氢青蒿醛所需要的还原酶(Dbr2)[19]以及将青蒿醛氧化为青蒿酸所需要的脱氢酶(ALDH1)[20]等.这些生物元件的发现与鉴定, 特别是青蒿醇脱氢酶和青蒿醛脱氢酶的导入, 是解除中间产物积累, 从而实现青蒿酸高产的关键(图 2).
将更多的代谢流引入到目标产物的合成途径中, 也是提高细胞工厂产量的关键.酿酒酵母的MVA途径为萜类化合物提供前体, 有研究者尝试着将大肠杆菌的DXP途径导入到酿酒酵母, 但是结果却发现外源的DXP途径在酿酒酵母中并不能获得有功能的表达[21]. Keasling团队[13]采用了别的策略, 他们在酵母底盘菌株CEN.PK2中将MVA途径上的从乙酰辅酶A到法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate, FPP)合成中每一基因都置于GAL系列的强启动子之下进行表达强化.同时, 由于酵母生长所必需的甾醇合成途径会跟萜类化合物的合成途径竞争前体物质FPP, 为了让更多前体进入到倍半萜青蒿酸的合成途径中, 他们同时将甾醇合成途径进行了弱化.具体的方案, 是将角鲨烯合成酶基因(ERG9)置于受铜离子抑制的CTR3启动子的下游, 并通过控制铜离子的浓度来抑制ERG9的表达[8], 从而保证了更多的FPP进入到青蒿酸合成途径.这些改造显著提高了酵母细胞工厂中青蒿酸的产量.而通过优化发酵条件, 在发酵罐青蒿酸的产量比摇瓶提高约40倍, 最终达到25 g/L[2, 8](图 2).
由于从青蒿酸到青蒿素的生物合成途径尚未得到完整解析, 所以目前还无法实现青蒿酸到青蒿素的生物合成, 而国内外已经在青蒿酸到青蒿素的化学合成方面取得了长足的进展.早在1983年, 周维善课题组[22]首次实现从青蒿酸到青蒿素的化学半合成, 总产率为5.6%. 1990年, 吴毓林课题组[23a]改良周维善课题组[23b]原有方法, 将二氢青蒿酸甲酯还原为醇后, 经三次氧化最终获得青蒿素, 总收率为39.57%. 2012年, Seeberger小组[24]设计连续流动型化学合成工艺, 利用特定设备由青蒿酸合成青蒿素, 收率达39%.同年, 张万斌小组[25]以过渡金属催化剂实现室温下无光照的青蒿素合成工艺, 总收率超过60%. 2013年, 伍贻康小组[26]以钼酸钠作为催化剂, 同样实现了室温下无光照的青蒿素合成, 总收率为41%. Keasling团队[8]也在同年以酵母合成的青蒿酸为原料, 通过Wilkinson催化还原双键、羧酸甲酯化得到11R-二氢青蒿酸甲酯, 再以钼酸盐作为催化剂, 在无光照的室温条件下经一锅多步反应合成青蒿素, 总产率为40%~45%.值得一提的是, 该路径首次实现了合成生物学与合成化学相结合规模化制备复杂天然产物. 2014年Sanofi公司[27]以手性双膦配体催化剂RuCl2[(R)-DTBM-Segphos](DMF)2催化青蒿酸还原为二氢青蒿酸, 该化合物经酸酐修饰, 再以四苯基卟啉作为光敏剂, 以汞灯为光源, 低温条件下实现了单线态氧偶联, 最终以55%的总收率获得青蒿素(图 2).
虽然合成生物学非常强调微生物系统的理性设计, 但是具体实施过程中, 由于生物系统的复杂性, 往往很难进行准确的预测和控制. Keasling团队[8]在青蒿素项目的研发过程中采用“设计-构建-测试-分析”(DBTA)循环的研究策略来解决以上问题.他们进行了不同的设计, 在此基础上构建不同菌株并对它们进行系统测试, 这些测试不仅包括菌株生长状况、活力、目标产物及中间代谢物的测定, 还包括对菌株的代谢组与转录组的分析.基于测试数据, 再进行下一轮的“设计-构建-测试-分析”循环, 最终获得了高效合成青蒿酸的酵母细胞工厂.
我国传统中药在维护世代中华民族的健康中起到了关键作用, 但借鉴国际认可的医药标准和规范, 研究、开发、管理与生产出以现代化和高科技为特征的“安全、高效、稳定、可控”的现代中药产品, 是中医药现代化的重要目标之一.对传统中药中的有效成分的高纯度制备与功能分析, 是中药现代化的第一步.
人参号称“百草之王”.在中国、韩国和日本被用于强身、保健、防病以及抗衰老已有上千年的历史.人参皂苷是人参中的主要有效成分, 属于三萜类化合物, 目前已经从人参中分离出了100多种人参皂苷, 其中大部分属于达玛烷型皂苷.人参皂苷Compound K (CK)被证实具有抗癌、保肝、抗炎症和治疗糖尿病等多种药用价值[28], 它在防治关节炎方面也有比较显著的效果, 已经获得国家食品药品监督管理总局临床实验的批号.但是CK却没有在人参总皂苷中检测到, 目前主要是通过对原人参二醇型皂苷进行糖基水解来获取它.这类制备方法依赖于人参总皂苷资源的供给.同样, 制备Rg3, Rh2, Rh1和F1等其他具有重要活性的稀有人参皂苷也依赖于总皂苷资源.由于野生的人参资源已基本耗竭, 而人参的人工栽培又面临生长周期长、病虫害和连作障碍等问题, 人参总皂苷资源的供给、品质及安全性都面临挑战.
利用合成生物学合成人参皂苷近年来受到极大的关注, 2011年Han等[29]在克隆与鉴定原人参二醇(PPD)合成途径关键酶CYP716A47的基础上, 构建了可以生产原人参二醇(PPD)的酵母细胞, 次年他们[30]又鉴定了催化原人参二醇产生原人参三醇(PPT)的细胞色素P450 (CYP716A53v2).在我国, 张学礼课题组和黄璐琦课题组[31]构建了同时合成齐墩果酸、原人参二醇和原人参三醇的“人参酵母”细胞工厂.但是这些工作目前还仅限于皂苷元的合成, 尚未真正意义上实现合成人参皂苷. 2014年以来, 作者课题组和岳建民课题组[9, 32]合作, 基于13个人参属植物的公共cDNA数据库, 建立了人参皂苷等萜类天然产物合成相关元件的发掘及功能鉴定方法, 从人参中克隆并成功表达了80多个新UDP-糖基转移酶(UGT), 功能表征分析确认其中5个UGT参与稀有人参皂苷CK、Rh2、Rg3、Rh1和F1的合成.同时还鉴定了两个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶PgCPR1和PgCPR2[9], 功能鉴定表明, 这两个细胞色素P450还原酶与CYP716A47或/和CYP716A53v2可以高效地催化达玛烯烃二醇(DM)或/和PPD的羟基化反应.基于这些元件的发现, 分别在酵母底盘细胞中构建了稀有人参皂苷CK、F1、Rh1、Rh2和Rg3单体的合成途径[9, 32](图 3), 首次实现了从葡萄糖到这些稀有人参皂苷单体的一步法从头合成.在稀有人参皂苷CK的酵母细胞工厂中, 基于重组酵母细胞中一种新化合物(20S-O-β-(D-glucosyl)-dammarenediol Ⅱ)的发现与鉴定, 证实了在重组酵母细胞中存在着二条合成CK的代谢途径, 这暗示着人参中也存在着类似的二条平行的人参皂苷合成途径.而基于构建与优化的原人参二醇和原人参三醇酵母底盘细胞及新挖掘的糖基转移酶元件, 原则上可以快速构建更多人参皂苷或三七皂苷的酵母细胞工厂, 实现它们的从头合成.
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎, 具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦和凉血消痈的功效.其有效成分有丹参酮(tanshinone)和丹参素(salvianic acid A)等.其中, 丹参酮是一类二萜化合物, 具有抗菌、抗炎、抗氧化、神经保护等作用[33]. 2012年赵宗保课题组与黄璐琦课题组[34]合作通过对丹参酮二烯合成的两个关键酶SmKSL和SmCPS进行结构分析并通过不同方式融合这两个酶, 并在此基础上对MVA途径进行模块化的改造, 包括强化tHMG1的表达及融合BST1和ERG20基因, 最终使丹参酮二烯的产量达到365 mg/L.与此同时, 张学礼课题组与黄璐琦课题组[35]合作通过将丹参来源的SmKSL和SmCPS基因整合到酵母染色体上, 并过表达UPC2.1、tHMG1强化MVA途径, 过表达丹参来源的香叶基香叶焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)合成酶(GGPP synthase)强化GGPP合成, 最后通过替换营养缺陷性标记使其在高密度发酵时丹参酮的前体丹参酮二烯(miltiradiene)的产量达到488 mg/L.随后, 赵宗保课题组与黄璐琦课题组[36]继续合作, 从丹参中克隆了催化丹参酮二烯生成铁锈罗汉柏醇(ferruginol)的P450 CYP76AH1基因和两个相应的还原酶smCPR1和smCPR2基因, 将其导入产丹参酮二烯的酵母中实现了铁锈罗汉柏醇的合成.
丹参素(salvianic acid A)是多酚芳香酸类化合物, 具有抗氧化、抗炎、抗癌、提高大脑血流、抑制血小板活化和动脉血栓形成等药理活性, 是治疗心脑血管疾病的药物.目前, 丹参素的获取主要依靠中药材丹参的活性成份提取, 但存在植物提取收率不高、产品质量不稳定等问题. 2013年赵广荣研究组[37]在丹参素生物合成途径不清晰的条件下, 他们利用乳酸菌来源的乳酸脱氢酶基因(d-ldh)和大肠杆菌来源的羟化酶复合体(hpaBC)在大肠杆菌中成功构建了一条人工丹参素从头生物合成的途径.通过模块化设计确定了能提高前体4HPP合成代谢流的模块(ppsA, tktA和glk模块), 进一步通过失活转录调节基因(tyrR)和竞争性途径基因(ptsG, pykA, pykF和pheA)使前体流量的供给提高了70多倍, 最终实现了丹参素细胞工厂在发酵罐中达到7.1 g/L的产量(图 4).
红景天苷(salidroside)属于多酚类化合物, 是中药红景天中的主要活性物质, 具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基等多种药理作用. 2014年刘涛课题组[38]利用合成生物学技术在大肠杆菌中合成了红景天苷.红景天苷是一种具有糖基化修饰的天然产物, 以酪醇tyrosol为前体, 通过糖基转移酶UGT73B6催化糖基化合成.首先他们利用了酿酒酵母来源的ARO10酶将4-羟基苯丙酮酸转化为酪醇的前体化合物4-羟基苯乙醛, 并敲除了分流途径的关键酶FeaB和pheA的编码基因, 在大肠杆菌中构建了酪醇的合成途径, 该菌株在摇瓶发酵条件下酪醇的产量为128.3 mg/L.随后他们又强化了涉及磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸合成4-羟基苯丙酮酸全部基因的表达, 提高前体化合物供应, 使酪醇的产量又提高了7倍, 达到了926.9 mg/L.在酪醇高产的菌株中继续导入密码子优化的糖基转移酶UGT73B6基因, 最终实现了红景天苷的从头合成, 产量为56.9 mg/L.同时, 该研究组还发现UGT73B6同时能催化酪醇的酚羟基糖基化, 生成淫羊藿次苷icariside D2, 其产量为63.2 mg/L(图 4).
天麻素(gastrodin)同样属于多酚芳香酸类化合物, 是中药天麻的主要活性成分, 具有镇静、催眠、抗惊厥和神经保护等生理功能. 2016年刘涛课题组[39]在大肠杆菌从头合成红景天苷的工作基础上, 利用诺卡氏菌来源的羧酸还原酶, 红景天来源的糖基转移酶UGT73B6和大肠杆菌自身的乙醇脱氢酶搭建出一条人工设计的天麻素合成途径, 可以以泛醌生物合成途径的中间体4-羟基苯甲酸为前体合成天麻素.最后, 通过糖基转移酶UGT73B6的定向进化改造和前体合成途径的优化, 使得天麻素的发酵产量达到了545 mg/L(图 4).
生物碱是存在于自然界(主要为植物, 但有的也存在于动物)中的一类含氮的碱性有机化合物.其中, 苄基异喹啉类生物碱(BIAs)因其独特的化学结构而通常具有良好的生物活性.除了阿片类生物碱吗啡、蒂巴因和可待因, 镇咳药诺司卡品(noscapine)和抗肿瘤药物血根碱(sanguinarine)都属于BIA化合物.当前这些BIA化合物主要从罂粟科植物中提取.以阿片类药物为例, 为满足每年约800吨的市场需求, 全世界罂粟的种植面积大约为每年10万公顷[12].同时由于众所周知的原因, 罂粟的种植往往伴随着暴力与犯罪.因此科学家一直寻求一种新的可替代的方法来制备这类化合物.相比于青蒿素, BIA化合物合成途径更加复杂、更具挑战性.
S-reticuline是阿片类生物碱及其他许多异喹啉类生物碱(BIAs)的共同前体. 2008年Smolke课题组[40]通过在酿酒酵母中过表达6-OMT, CNMT和4-OMT, 并通过在培养基中添加去甲基罂粟碱(norlaudanosoline), 实现了(R, S)-reticuline的生物合成.但直至2015年Dueber实验室[41]才真正于酵母中实现了S-reticuline的从头合成.他们发现并鉴定了甜菜来源的P450单加氧酶CYP716AD1具有酪氨酸羟化酶活性, 并通过一种酶联的生物传感器, 建立了该酶高通量定向进化的筛选方法, 获得了酶活提高的突变体, 利用活性提高数倍的酶, 他们于酵母中组装了一条将酪氨酸合成S-reticuline的生物合成途径.
由S-reticuline向R-reticuline的转化是阿片类化合物合成最为关键的步骤. 2015年三个课题组[12, 42]分别独立地从罂粟中发现了一种独特的P450-氧化还原酶融合蛋白(STORR), 正是这个蛋白催化了吗啡合成中极为关键的S-reticuline到R-reticuline的转化.通过代谢组分析和异源表达检测发现STORR的P450功能域负责催化S-reticuline到1, 2-Dehydroreticuline, 而氧化还原的功能域催化1, 2-Dehydroreticuline到R-reticuline.在此基础上, 2015年Smolke研究组[12]报道了她们在酵母中实现从葡萄糖到阿片化合物(蒂巴茵和氢可酮)生物合成里程碑的工作.通过在酵母中过表达来自于多个物种(三种罂粟、黄连、小鼠、假单胞菌)的共计21个酶, 实现了从葡萄糖到蒂巴茵的合成, 而合成氢可酮则需要23个酶(图 5).
诺司卡品又名那可丁(narcotine), 最早于1804年从罂粟属植物鸦片中获得, 作为镇咳药已具有上百年的临床历史.诺司卡品与可待因同为从鸦片中获得的药物, 两者均具有镇咳作用, 但诺司卡品不具有依赖性和成瘾性, 是一种安全药物.诺司卡品和阿片类化合物的生物合成需要通用的前体S-reticuline, 与阿片类化合物需要将S-reticuline转化为R-reticulin不同, 诺司卡品生物合成途径中是将S-reticuline转化为(S)-scoulerine, 后经过10步植物来源的基因转化为诺司卡品. 2018年Smolke课题组[43]于高效合成S-reticuline的底盘细胞中, 组合导入了30多个来源于不同植物、动物、细菌和酵母自身基因, 在酵母中实现了诺司卡品的从头生物合成.通过对限速步骤norcoclaurine合酶和酪氨酸羟化酶分别进行改造和优化, 再结合辅因子NADPH再生的强化和发酵条件优化, 使诺司卡品的产量提高了18000多倍, 达到了2.2 mg/L(图 5).
近年来, 其它重要的BIA化合物, 如人血草中活性化合物人血草碱(stylopine)[44]、白屈菜中抗肿瘤成分二氢血根碱(dihydrosanguinarine)[45]等生物碱的生物合成也已经基本实现.这些突破性成果表明, 复杂天然产物合成生物学不仅可以利用天然生物合成途径实现复杂天然产物的全合成, 而且还可以从头创制复杂天然产物生物合成途径.这些研究成果充分展现了合成生物学在复杂天然产物全合成的巨大优势和潜力, 有望成为复杂天然产物和药物合成的重要工具和策略.
紫杉醇是具有二萜环状结构的复杂天然产物, 最初是从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中分离获得的.紫杉醇(paclitaxel, 商品名taxol)及其类似物多西他赛(docetaxel)和卡巴他赛(cabazitaxel)都显示了非常好的抗癌活性, 目前被广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等癌症, 成为重要的肿瘤治疗药物.从植物中提取紫杉醇难以满足紫杉醇的市场需求, 因为紫杉醇在红豆杉树皮中的含量仅占万分之一左右[5].因此, 紫杉醇的人工合成一直备受关注.尽管已有多条化学从头合成的路线, 但由于紫杉醇结构复杂, 它们都面临因合成路线过长而产率过低的问题, 尚无法实现产业化.而生物合成方面也因为合成途径尚未解析而无法推进.
目前紫杉醇及其类似物的制备工艺主要采用化学半合成法.由于红豆杉的枝叶中含有较丰富的紫杉醇前体化合物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ(约千分之一), 这两种化合物具备了紫杉醇的母核结构与多个手性中心, 百时施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)的研发人员与Holton教授[46]合作于1992年成功研发了以10-去乙酰巴卡亭Ⅲ为原料合成紫杉醇的半合成路线:经过三乙基硅醇对C(7)位上的羟基进行保护后, 然后经四元环侧链供体与母核C(13)位羟基对接后, 再经脱去保护基团获得紫杉醇, 并以此实现紫杉醇的商业化.这一开创性的半合成路径设计确立了“对接式”的合成思路, 此后紫杉醇衍生物的半合成依然延续这条思路.
此外, 通过不同方法对紫杉醇的侧链进行修饰, 可以获得活性或成药性更优于紫杉醇的类似物, 例如, 将紫杉醇C(13)侧链中的苯基用叔丁氧基取代可以获得新的抗肿瘤药物多西他赛.多西他赛的抗肿瘤活性强于紫杉醇, 并在治疗前列腺癌、胰腺癌、胃癌和黑素瘤等方面取得了更好的临床效果[47].而且与紫杉醇相比, 侧链的取代降低了空间位阻的同时, 也暴露极性基团, 从而多西他赛的亲水性得以显著提高.由于多西他赛具有复杂的多手性中心结构且全化学合成的产率低于2%, 因此目前的主要生产工艺还是植物抽提产物10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ作为原料, 通过半合成实现多西他赛的制备[48].自1992年Commercon等[49]由半合成途径获得多西他赛以来, 不同研究者针对半合成的核心——“对接母核与侧链”+“保护与去保护”, 在侧链的设计、修饰方法与转化效率上进行了不断的优化, 目前从10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ到多西他赛的产率已经超过了70%[50](图 6).
随着近年来合成生物学在植物天然化合物的从头合成方面的成功应用, 紫杉醇的合成生物学研究也受到了普遍关注, 这方面的工作目前主要聚焦于紫杉醇的生物合成途径的解析与紫杉醇前体的细胞工厂构建与优化方面的研究.
紫杉醇生物合成途径的基本框架已经确定, 参与的大部分酶也已经获得并功能鉴定.目前普遍认为从GGPP开始, 紫杉醇的合成途径需要经过19步酶催化反应.首先, GGPP在二萜合酶催化下形成紫杉二烯[51], 然后紫杉二烯的C-1, C-2, C-5, C-7, C-9, C-10和C-13位点经过羟基化(7个P450), 接下来部分羟基会被乙酰化、苯甲酰化、环氧化、氧化等修饰形成巴卡亭Ⅲ.其中, 负责催化C-2, C-5, C-7, C-10和C-13位点羟基化的5个P450已基本完成克隆与鉴定[52], C-9位的P450已经克隆, 但是其功能鉴定的工作还没有全部完成[53].并已克隆与功能鉴定了催化C-5和C-10位点的羟基乙酰化修饰和C-2位苯甲酰修饰的3个酰基化酶[53b, 54].除了上述修饰步骤之外, 巴卡亭Ⅲ的合成还需要环氧化物酶(epoxidase)和氧变位酶(oxomutase)的参与, 形成D环的氧杂环丁烷结构, 以及需要脱氢酶将C-9位羟基进一步氧化形成羰基, 目前还没有找到催化上述反应的生物元件[53b].随后还需要在供体(3R)-3-氨基-3-苯丙酰-CoA存在的条件下, 在3-氨基-3-苯丙酰基转移酶(BAPT)的催化下于巴卡亭Ⅲ的C-13羟基处引入侧链, 生成N-去苯甲酰基-2'-脱氧紫杉醇[55].最后, N-去苯甲酰基-2'-脱氧紫杉醇的C-13位侧链需要先后经过C-2'位的羟基化修饰和亚氨基的苯甲酰化修饰后最终生成紫杉醇, 其中, 负责苯甲酰化修饰的酰基化酶已经完成鉴定[56], 而负责C-2'位的羟基化修饰的P450一直还没有找到[46].因此, 到目前为止, 紫杉醇生物合成途径中所需要的19个酶, 已经找到和鉴定了其中的14个酶, 但是其中多数酶特别是P450酶参与催化的顺序大都还不清楚[46, 57](图 6).
Stephanopoulos研究组[50]将紫杉二烯合酶导入到大肠杆菌中, 并将合成途径分成上游模块[MEP合成途径负责前体Isopentenyl pyrophosphate (IPP)和Dimethyl-propylene diphosphate (DMAPP)的合成]和下游模块(负责GGPP和紫杉二烯的合成), 通过平衡下游模块的表达, 使得对大肠杆菌产生抑制的副产物吲哚的含量大幅下降, 而产物紫杉二烯的产量达到1 g/L.因为酵母具有丰富的内膜结构适合P450元件的表达, 所以Stephanopoulos研究组[58]将紫杉醇后续合成所需要的两个P450元件和一个乙酰转移酶元件导入到酵母中, 然后通过将该酵母菌与能够合成紫杉二烯的大肠杆菌共培养, 成功实现了5α-乙酰氧基紫杉二烯-10β-醇的合成. Stephanopoulos研究组[59]通过优化P450元件的表达、P450元件与其还原酶元件的相互作用以及P450元件的N-末端修饰, 为解决P450在大肠杆菌中的表达难题提供了新的策略.他们在合成紫杉二烯的大肠杆菌中优化P450(紫杉二烯5α-羟化酶, T5αOH)的表达, 使得紫杉二烯氧化产物的产量达到570 mg/L, 但是目标产物[紫杉-4(20), 11(12)-二烯-5α-醇]只占紫杉二烯氧化产物的16.29%.由于紫杉醇的合成途径没有完全解析, 所以还不能实现紫杉醇的异源生物合成.如果能尽早找到与鉴定巴卡亭Ⅲ合成过程中催化D环形成和C-9位羰基化的生物元件, 那么通过生物合成10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ, 再通过化学合成多西他赛等紫杉醇类似物, 就有希望缓解紫杉醇及其类似物合成对植物资源的依赖, 实现这些药物的大量合成(图 6).
长春花碱(Vinblastine)是从植物长春花(Catharanthus roseus)中分离得到的一种萜类吲哚生物碱(Terpenoid Indole Alkaloids, TIA)类化合物.长春花碱具有显著的抗肿瘤活性, 可通过抑制微管蛋白的聚合, 妨碍纺锤体微管的形成, 抑制肿瘤细胞分裂, 同时可以作用于细胞膜, 干扰其对氨基酸的运转, 抑制肿瘤细胞蛋白合成[60].长春花碱通常通过静脉注射方式给药, 已经成为霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、脑癌、黑素瘤和睾丸癌等癌症的化疗处方药物, 被世界卫生组织列入人类基本药物清单.然而由于长春花碱在植物长春花中含量极低(仅为干重的0.0005%)、组成复杂(目前已从长春花中分离出130多种TIA化合物), 纯化到可以静脉注射用纯度工艺复杂, 导致其价格昂贵.据报道, 长春花碱一次使用剂量(约10 mg)价格为7.7~31.7美元[61].
长春花碱是一种结构非常复杂的生物碱, 其生物合成途径解析研究已经进行多年, 取得了较大的进展, 目前大部分合成途径都已经被解析.长春花碱(图 7)的生物合成总体可以分为三个阶段. (1)前体的合成:分别通过莽草酸途径合成tryptamine以及萜类合成途径合成secologanin, 然后一分子tryptamine和secologanin合成TIA化合物通用前体strictosidine. (2)单体生物碱的合成:由strictosidine经过多步反应生成两种单体, 生物碱文多灵(vindoline)和长春质碱(catharanthine). (3)双吲哚生物碱的合成:由一分子vindoline和一分子catharanthine连接形成双吲哚生物碱3', 4'-anhydrovinblastine, 随后生成长春花碱[60](图 7).
Strictosidine是所有TIA化合物的通用前体, 该化合物以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸为前体经MEP途径需要18步反应合成secologanin, 再通过Strictosidine synthase (STR)催化与一分子tryptamine结合合成strictosidine. 2000年以来, 随着11个关键基因GES, G8H, GOR, ISY, IO, 7-DLGT, 7-DLH, LAMT, SLS, STR和TDC的相继获得与功能鉴定[62], strictosidine的生物合成途径得到解析, 尤其是2014年Werck-Reichhart研究组[62a]成功鉴定了strictosidine合成关键的最后四步反应的基因LAMT, SLS, STR和TDC, 并将strictosidine合成途径组装于酿酒酵母中成功实现了strictosidine的从头合成. 2015年O'Connor研究小组[63]通过进一步优化strictosidine酵母细胞工厂使其摇瓶发酵产量达到0.53 mg/L.长春花碱的生物合成的第二阶段合成由strictosidine起始, 分别合成单体生物碱vindoline和catharanthine. 2018年, De Luca研究组[64]系统解析了strictosidine到stemmadenine acetate的合成途径, 首先糖苷酶SGD催化去除strictosidine的糖基转化为4, 21-dehydrogeissoschizine, 首先糖苷酶SGD通过水解去除strictosidine的糖基生成4, 21-dehydrogeissoschizine, 继而在GS、GO、Redox 1、Redox 2和SAT五个酶的催化以及一个自发反应的作用下合成stemmadenine acetate.同年O'Connor小组[65]通过对长春花基因组分析、基因共表达和基因沉默等策略, 确定了stemmadenine acetate转化为tabersonine和catharanthine的合成途径: PAS和DPAS酶首先将stemmadenine acetate转化为dihydroprecondylocarpine acetate, 然后分别在TS和CS酶作用下转化为tabersonine和catharanthine.随后tabersonine需要通过7步反应转化为单体生物碱vindoline, 2011~2015年间O'Connor研究组和De Luca研究组[66]通过基因沉默结合异源表达分析, 找到了这7步反应的酶分别为T16H2, 16-OMT, T3O, T3R, NMT, D4H和DAT.此后, 一分子vindoline和一分子catharanthine在anhydrovinblastine合酶(AVLBS)的催化下合成一分子3', 4'-anhydrovinblastine[67], 该化合物最后将被羟基化后转化为长春花碱, 但目前还没有找到催化最后一步羟基化的P450(图 7).
长春花碱是目前所解析的分子结构最复杂的生物碱之一, 其生物合成途径从MEP和莽草酸途径起始总共需要40多步反应.该化合物生物合成途径的逐步解析, 体现了天然产物合成生物学向着更复杂天然产物合成途径解析及人工合成的方向快速发展.
随着20世纪天然化合物抽提技术与化合物分析与鉴定水平的不断提高, 并伴随着人类探究地球上生命系统范围的不断扩展(既包括原始森林中鲜为人知的稀有物种也包括极端环境中的微生物新品种), 天然产物库的数量不断增加.在这些海量的已知分子结构的天然产物中, 却只有少数化合物的生物合成途径得到完全解析.虽然合成生物学的核心在于设计, 但是面对结构多样而复杂的天然化合物, 合成途径的设计还需要向自然界学习, 即需要从其在自然界中的生物合成途径中获得启发.青蒿素项目的研究过程也充分表明, 完整解析天然产物的合成途径对于微生物底盘细胞异源高效合成青蒿素的重要性.例如, 在酵母底盘细胞中表达CYP71AV1及其还原酶可以完成从紫穗槐二烯到青蒿醇、青蒿醇到青蒿醛以及青蒿醛再到青蒿酸的三步催化反应, 但是青蒿酸的产量只有紫穗槐二烯产量的十分之一, 而中间产物青蒿醇和青蒿醛却大量积累.随着黄花蒿中青蒿酸合成途径的全面解析, 在酵母中进一步导入了参与青蒿酸合成所需的青蒿醇脱氢酶和青蒿醛脱氢酶后, 才解除了中间产物的积累, 实现了从头合成青蒿酸的高产.
近十年来, 随着DNA测序技术效率的提高与成本的大幅度下降, 人们对越来越多植物, 包括许多重要药用植物的基因组或转录组进行了测序分析, DNA或cDNA数据的积累为全面解析天然产物的生物合成途径及发掘生物元件奠定了重要基础.例如, 黄璐琦和赵宗保等[36]在2009年基于cDNA芯片的功能基因组学挖掘获得了催化GGPP生成丹参酮前体次丹参酮二烯(miltiradiene)的合成酶SmCPS和SmKSL, 2013年又解析了催化次丹参酮二烯到弥罗松酚(ferruginol)的细胞色素P450 CYP76AH1, 然而, 最终生成丹参酮还涉及到多步未知的酶促反应.我国科学家在解析黄瓜中的三萜化合物葫芦素的合成途径也取得了重大进展[68].结合基因组学和生物化学方法, 他们解析了葫芦素C合成途径中的9个编码基因并鉴定了其中四个酶的功能(包括催化第一步反应的葫芦二烯醇合酶Bi、中间步骤所涉及的两个细胞色素P450以及最后步骤的乙酰基转移酶), 其他基因的功能仍待鉴定.中药鬼臼中分离到的木脂类化合物鬼臼毒素(podophyllotoxin)具有非常显著的抗病毒活性和抗肿瘤活性.相比于其化学合成, 鬼臼毒素生物合成途径研究相对滞后, 目前其生物合成途径绝大部分仍未知[69].随着三代测序技术的进步, 近年来其生物合成途径也已经取得一定进展. Lewis等[70]通过对鬼臼属植物桃儿七(Podophyllum hexandrum)和盾叶鬼臼(Podophyllum peltatum)的转录组测序和分析, 鉴定了鬼臼毒素合成途径中关键的一个P450基因, 至此从松柏醇(coniferyl alcohol)到鬼臼毒素合成重要中间产物(－)-pluviatolide的合成途径得以解析.随着测序深入和技术进步相信未来其下游未知途径的解析也将一步步推进[71].最近长春花碱的生物合成途径的解析也取得了重大进展, 目前合成途径的近40步反应中只有催化最后一步的酶尚没有找到, 而紫杉醇生物合成途径中还需要找到与鉴定至少5个酶[65].
生物元件(bioparts)是指经过功能表征鉴定、编码某种生物学功能的核苷酸序列, 植物天然化合物合成途径的解析过程, 实际上就是发现与功能鉴定参与合成反应的各种酶的编码基因的过程.随着越来越多的合成途径得到解析, 生物元件库中与天然产物合成相关的生物元件及其功能信息也会越来越丰富, 合成生物学就可能利用正向工程, 针对目标天然化合物进行人工模块的设计, 并将天然产物合成所必需的生物元件构建成相应的模块或合成途径, 转入到合适的底盘细胞中进行异源合成.例如, Moses等[72]组合了来源于洋甘草(Glycyrrhiza glabra)的β-香树脂合酶、来源于苜蓿(Medicago truncatula)和柴胡(Bupleurum falcatum)的细胞色素P450以及来源于山芥(Barbarea vulgaris)的UDP-糖基转移酶在酿酒酵母中合成了一种柴胡三萜皂苷.在第1.3节中我们还介绍过的从头合成诺司卡品的例子, Smolke等利用30多个来源于不同植物、动物、细菌和真菌的生物元件设计与构建了诺司卡品的人工合成途径[43].
另外一方面, 利用生物元件库中不同的天然产物合成相关的催化元件进行半理性的组合设计或随机组合, 构建出自然界不存在的“非天然化合物”的合成途径, 再转入到合适的底盘细胞或无细胞体系中则完全有可能合成出全新的化合物, 再结合途径优化和下游的发酵工程, 就有望实现具有商业利益的新化合物的大量合成. Evolva公司利用此策略, 建立了基于合成生物学技术的化合物构建与活性筛选平台[73].其核心是, 利用了酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)的大片段装载、转化、复制和表达能力, 将生物碱、黄酮、萜类和脂肪酸等8类化合物骨架合成途径以及来源于14个物种的cDNA元件库于酿酒酵母底盘中进行随机组装, 构建了一系列酵母细胞工厂.该策略一次性可以合成74种化合物, 其中75%以上的化合物为此前未有报道的新化合物, 20%以上的化合物具有新颖的骨架.同样, 利用部分天然化合物修饰元件的底物广谱性, 对获得非天然骨架做进一步的修饰, 则有望创造出数千种结构多样化的新型化合物.
在异源合成植物天然化合物的细胞工厂中, 异源合成途径所采用的生物元件是否高效, 以及元件间和元件与底盘间的适配性, 都会影响目标化合物的合成效率.综上所述, 天然化合物合成生物学相关生物元件的收集、功能鉴定与元件库的建立, 是植物天然化合物合成生物学长远发展的基础设施, 是实现“自下而上”工程化设计思路的基本保障.目前中国科学院合成生物学重点实验室与中国科学院计算生物学研究所医学大数据中心合作建设相关的天然化合物生物元件与数据库(http://npbiosys.scbit.org/).
因为所有的生物元件与模块都需要在底盘细胞的环境中发挥功能, 所以合适的底盘细胞对于人工构建的生命系统全局性功能的高效发挥至关重要.底盘细胞的选择往往需要综合考虑与元件或模块的适配性、生长与前体供应的效率以及底盘细胞的可操作性、安全性等多种因素: (1)具有清晰的遗传背景, 遗传操作简单、成熟; (2)生长较快, 需要的培养基简单, 目标产物前体供应充足; (3)具有较简单的次级代谢产物背景; (4)必须是GRAS认证的无危害的生物等.具体而言, 还必须对目标产物或其中间产物有较强的耐受性.目前大肠杆菌和酿酒酵母是植物天然化合物最常用的底盘细胞, 它们最大的优势在于具有成熟的遗传操作体系、清晰的遗传背景以及较少的次级代谢产物背景影响.与大肠杆菌相比, 酿酒酵母在表达细胞色素P450等植物来源的膜蛋白时具有优越性, 使其成为首选的植物天然化合物底盘细胞.但对某些结构复杂的天然化合物, 酵母并不一定是合适的底盘细胞, 例如, 对于结构复杂的生物碱等含氮杂环化合物, 也许植物底盘或丝状真菌底盘更适合, 因为它们在这类复杂化合物的前体合成以及对目标产物或中间产物的耐受性方面更具有优势.而近年来发展起来的以CRISPR/Cas9系统为代表的基因组编辑技术, 将为开发新型的优质底盘细胞提供重要的技术支撑.
植物天然产物合成途径的设计与构建仅仅是实现其生物合成的第一步, 还需要对细胞工厂进行系统优化才可能实现目标天然化合物的高效合成, 达到经济可行水平.细胞工厂的系统优化, 包括了对物质能量代谢流的分配和全细胞水平的调控网络、天然产物合成途径的模块化与区域化、目标产物转运系统等方面的设计与改造.对细胞工厂的物质能量代谢流分配的优化, 目标是保证更多的能量流与代谢流进入到目标化合物的合成途径中, 是提高细胞工厂产量的关键.例如, 在青蒿酸细胞工厂构建中, Keasling团队[8]将前体合成途径——MVA途径从乙酰辅酶A到FPP的全部基因强化表达, 吸引到了足够的代谢流用于前体的合成, 而且, 他们将甾醇合成途径(青蒿酸合成途径的竞争途径)进行了弱化, 通过“开源节流”, 保证更多的代谢流用于青蒿酸的合成.此外, 红景天苷[38]、天麻素[39]、人参皂苷[32]、柚皮素[74]等其他重要天然化合物的细胞工厂也都是通过“开源节流”的策略大幅提升了目标产物的产量.天然产物合成模块的区域化设计与改造, 是将相关生物元件或模块定位到内质网膜、液泡、过氧化物酶体、脂质网膜等特定细胞器中, 该策略可以有效地减轻有毒中间产物对酶或者细胞的毒性、提高前体或者中间产物在局部空间内的浓度或改善酶与底物、蛋白与蛋白的空间效应等, 从而提高中间体转化效率或者减少副产物合成. 2014年Smolke研究组[75]在将蒂巴因转化为吗啡的研究中, 通过将COR基因利用细胞膜定位肽将其定位到内质网膜上表达, 极大地降低了副产物neomorphine的合成. 2016年, 周雍进等[76]通过将烷烃(alkane)和烯烃(olefin)的部分合成途径定位于酿酒酵母过氧化物酶体中, 利用该细胞器强大的乙酰辅酶A合成能力与重要辅因子NADPH再生能力, 从而提高了脂肪酸衍生物alkanes的产量.
细胞工厂的系统改造, 需要高效的基因组编辑系统, 包括多重自动化基因组工程技术.多重自动化基因组工程可以同时平行地对基因组中多个基因进行编辑, 包括插入、缺失、点突变等, 从而高效地对微生物的基因组进行系统改造. 2009年Church研究团队[77]建立了多元自动化基因组工程(Multiplex automated genome engineering, MAGE)技术, 有研究者利用此技术以大肠杆菌合成萜类化合物番茄红素为例, 针对其合成途径基因进行多重优化, 经过35个MAGE循环获得了大量的突变体菌株, 并根据菌落颜色筛选获得了的突变菌株, 其产量提升了5倍. 2013年后迅速发展起来的CRISPR/Cas9基因组编辑系统, 通过gRNA序列的设计与引导, 该技术几乎可以实现对基因组任意位点的编辑包括插入、缺失等.基于CRISPR/Cas9技术进行改造还可以用于对目标基因进行精准的激活、抑制等调控.最近Church研究团队[78]基于CRISPR/Cas9技术, 在酵母中实现了数百个基因的同步精确改造, 并能选定特定行为细胞进行基因编辑与修复, 为细胞工厂的系统改造提供了更有效的技术支撑.另外, 实验室适应性进化是一种非理性、高效、快速的细胞工厂的系统改造方式, 在提高基于理性设计而构建的细胞工厂对环境因子的耐受性方面十分有效[79].
理论上, 只要某种天然化合物的生物合成途径得到解析, 就有希望在底盘细胞中导入相应的生物元件或模块, 从而构建目标产物的细胞工厂用于规模化生产.但实际上, 目前许多重要的天然化合物的合成途径仅有部分得到解析, 或者即使可以设计与构建完整的生物合成途径, 但由于反应的步骤多, 需要导入底盘细胞的异源基因多达数十个, 外加上异源来源的催化元件与底盘细胞的适配性问题, 常常引起合成途径中某些步骤的转化效率极低, 而化学合成却有潜力解决某些步骤的转化效率问题.青蒿素的从头合成技术是生物合成与化学合成联姻的成功典范, 利用生物合成的高效性完成了青蒿酸的“一步合成”, 避免了化学方法从头合成青蒿酸的多步骤、低收率等问题, 但却充分利用了化学方法催化青蒿酸合成青蒿素的高效性, 最终实现了青蒿素规模化制备技术的产业化.这种“扬长避短、各取所长”的合成生物学与合成化学相结合的设计理念, 将成为植物天然化合物从头合成技术研发的重要基础.
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图 1 植物天然产物的制备方法
Figure 1 Methods to manufacture plant natural products
(A) Plant extraction, (B) synthetic biology approaches, (C) chemical synthesis, (D) combined synthetic biology and chemical synthesis
图 2 合成生物学和合成化学结合实现青蒿素从头合成的产业化
Figure 2 de novo synthesis and industrialization of artemisinin by combining synthetic biology and synthetic chemistry
图 3 合成生物学技术实现多种稀有人参皂苷在酿酒酵母中从头合成
Figure 3 Synthetic biology enables de novo production of many rare ginsenosides in Saccharomyces cerevisiae
图 4 中药中多酚芳香酸类化合物丹参素、红景天苷和天麻素的生物合成
Figure 4 Biosyntheses of the bioactive polyphenol aromatic acid compounds salvianic acid A, salidroside and gastrodin from traditional Chinese medicines
图 5 阿片类生物碱和诺司卡品的从头生物合成
Figure 5 de novo biosyntheses of opioid alkaloids and noscapine
图 6 紫杉醇的生物合成途径及类似物多西他赛的半合成现状
Figure 6 Biosynthesis pathway of paclitaxel and semi-synthesis of docetaxel
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