新型含2-氨基-4-苯基噻唑结构的c-Met抑制剂设计合成及抗肿瘤活性研究

引用本文: 张志华, 陈羽, 吴红梅, 崔博, 熊武林, 林腾辉, 林荣南, 郭宇. 新型含2-氨基-4-苯基噻唑结构的c-Met抑制剂设计合成及抗肿瘤活性研究[J]. 有机化学, 2018, 38(10): 2648-2656. doi: 10.6023/cjoc201803041 shu

Citation: Zhang Zhihua, Chen Yu, Wu Hongmei, Cui Bo, Xiong Wulin, Lin Tenghui, Lin Rongnan, Yu Guo. Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel 2-Amino-4-phenylthiazole Derivatives as c-Met Inhibitors[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2018, 38(10): 2648-2656. doi: 10.6023/cjoc201803041 shu

新型含2-氨基-4-苯基噻唑结构的c-Met抑制剂设计合成及抗肿瘤活性研究

张志华 ^a, ,
陈羽 ^b, ,
吴红梅 ^a, ,
崔博 ^c, ,
熊武林 ^c, ,
林腾辉 ^c, ,
林荣南 ^c, ,
郭宇 ^{a,
,}

a.
辽宁工业大学化学与环境工程学院锦州 121001
b.
沈阳药科大学生命科学与生物制药学院沈阳 110016
c.
锦州医科大学药学院锦州 121001

通讯作者: 郭宇, guoyulnut@163.com

基金项目:
国家自然科学青年基金（No.201601075）、辽宁省自然科学基金（No.2015020249）和辽宁省教育厅高校基本科研（No.JQL201715410）资助项目

摘要: 基于克唑替尼的结构特征，设计、合成了两个系列未见文献报道的新型2-氨基-4-苯基噻唑类衍生物.采用噻唑蓝（MTT）法测试了目标化合物对A549、HT29、Hela、Karpas299的细胞增殖抑制活性.结果显示，部分化合物具有较好的肿瘤细胞抑制活性，其中N-（3-（2-氨基噻唑-4-基）苯基）-3-氯苯甲酰胺（3d）对HT29细胞的活性最好，IC₅₀值为4.42 μmol/L.采用Western blot考察目标化合物3d在HT29细胞中MET信号通路中相关蛋白表达的影响.另外，利用分子对接方法，对目标化合物进行了初步的构效关系讨论.

关键词:

English

Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel 2-Amino-4-phenylthiazole Derivatives as c-Met Inhibitors

Zhang Zhihua ^a, ,
Chen Yu ^b, ,
Wu Hongmei ^a, ,
Cui Bo ^c, ,
Xiong Wulin ^c, ,
Lin Tenghui ^c, ,
Lin Rongnan ^c, ,
Yu Guo ^{a,
,}

a.
School of Chemical and Environmental Engineering, Liaoning University of Technology, Jinzhou 121001
b.
School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016
c.
College of Pharmacy, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001

Corresponding author: Yu, Guo, E-mail:guoyulnut@163.com

Received Date: 25 March 2018
Revised Date: 06 June 2018
Available Online: 25 October 2018
Fund Project:
Project supported by the National Natural Science Foundation for Young Scientists of China (No. 21601075), the Natural Science Foundation of Liaoning Province (No. 2015020249) and the General Research Projects of Liaoning Provincial Department of Education (No. JQL201715410)

Abstract: Two series of novel 2-amino-4-phenylthiazole derivatives were designed and synthesized based on the structural features of crizotinib. The cell proliferation inhibition efficacy was estimated against A549, HT29, Hela and Karpas299 cell lines. The results revealed that some target compounds exhibited strong or moderate proliferation inhibition efficacy against tumor cells. N-(3-(2-Aminothiazol-4-yl)phenyl)-3-chlorobenzamide (3d) displayed significant activity against HT29 cancer cell with IC₅₀ value of 4.42 μmol/L, and influence of this compound on the expression of related proteins in the MET signaling pathway in HT29 cells was investigated by Western blot. In addition, the preliminary structure-activity relationship (SAR) of the derivatives was rationalized by docking studies.

Key words:

c-Met是一种由原癌基因c-met编码的蛋白产物, 是肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)受体. c-Met突变、扩增、过表达和HGF过表达都可异常激活HGF/c-met信号通路, 并在非小细胞肺癌的发生发展^{[1, 2]}以及表皮生长因子受体抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)的耐药性方面^[3~5]发挥十分重要作用.在人卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌等肿瘤细胞中也存在着c-Met的过表达.因此, 针对c-Met或HGF/c-Met信号转导通路的靶向治疗成为抗肿瘤药物一个重要靶点.

克唑替尼(Crizotinib, 商品名Xalkori, 辉瑞)是一种有效的转移的非小细胞肺癌(NSCLC)和间变型淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)抑制剂, 其主要通过抑制c-Met和ALK的磷酸化, 来控制肿瘤生长、转移.已于2011年8月被美国食品药品管理局(FDA)批准上市, 2014年国家药品监督管理局(CFDA)批准在中国上市.

Crizotinib无论是与c-Met还是与ALK结合表明^{[6, 7]}, 一般取代的苯环和激酶催化结构域的铰链区域通过疏水作用结合, 苯环无取代时活性消失.苄基的亚甲基上是否取代对活性无明显影响, 但甲基取代及其R-构型有利于药物与靶蛋白疏水区结合. 2-氨基吡啶片段的5-位为芳香杂环基团取代时活性较好.根据对Crizotinib与c-Met活性位点结合模式的分析, 寻找高活性的2-氨基噻唑衍生物, 结合哌啶基空间构象柔性较大的特点, 本文以4-苯基噻唑-2-胺结构替代Crizotinib分子中的3-1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-基-吡啶结构部分.保留Crizotinib分子中取代苯环结构, 以酰胺基结构片段代替Crizotinib分子中醚基及其邻位的氨基结构片段, 设计并合成了8个目标化合物(系列Ⅰ).小分子结构的微小变化可能会对活性和结合方式产生显著的影响, 利用TypeII抑制剂的设计原理^[8], 将2-氨基噻唑衍生物的氨基酰基化后, 引出一个侧链, 设计并合成了7个目标化合物(系列Ⅱ), 尝试此侧链部分作用于靶蛋白DFG-out非活化构象的变构位点疏水区域, 来增强所设计化合物与受体的结合力, 使化合物能够充分地占据结合位点区域, 提高化合物的抗肿瘤活性^[9].

分子三维形状相似性评价方法是一种以相似性原理为理论基础的虚拟筛选方法.以已知的活性配体三维结构为模板, 与目标化合物进行比较并对它们的相似性进行评价, 从数据库或虚拟数据库中筛选出那些与模板分子相似度较高的潜在活性分子^{[10, 11]}.从RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org)中下载的复合物晶体结构(PDB code 2WGJ), 以配体Crizotinib(棍状模型)为模板, 与本实验所设计的目标化合物中代表性分子3b (球棍模型)叠合.利用Discovery Studio软件中Minimization模块中的Full minimization对分子3b的能量进行优化, 采用Molecular Overlay模块, 按Guide-Sketch和Align Molecules步骤操作, 将模板Crizotinib和目标化合物分子3b的最低能量构象进行叠合, 参数设定为50%立体场和50%静电场.结果显示, 设计的目标化合物3b和模板Crizotinib的骨架重合较好, 其中化合物中的立体场和静电场差异非常小(图 2).说明二者可能具有相似的药理活性.

图 1

图 1. 目标化合物的设计思想

Figure 1. Design method of the title compounds

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图 2

图 2. Crizotinib(棍状模型)及化合物3b(球棍模型)立体叠合

Figure 2. 3D superimposition of crizotinib (stick) and compounds 3b (ball and stick)

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为了寻找高活性的2-氨基噻唑衍生物, 本文以4-苯基噻唑-2-胺结构为先导化合物, 设计并合成了15个全新的2-氨基-4-苯基噻唑类化合物, 其合成路线如Scheme 1所示, 所有化合物的结构均经¹H NMR, ¹³C NMR, HRMS确证.进一步在体外评价了其对A549(人肺上皮细胞系)、HT29(人结肠癌细胞系)、Hela(人宫颈癌细胞系)、Karpas299(人淋巴瘤细胞系)的细胞增殖抑制活性.

图式 1

图式 1. 目标化合物的合成路线

Scheme 1. Synthetic route of target compounds

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1. 结果与讨论

1.1 化合物的合成

4-(3-硝基苯基)噻唑-2-胺的硝基还原反应采用Fe/NH₄Cl在乙醇/H₂O中还原的方法, 得到对应的氨基化合物, 但产物会有部分生成盐酸盐形式, 所以减蒸后残余的水溶液要用饱和NaHCO₃溶液调pH至碱性(pH＝8~9), 确保对应的氨基化合物都以游离的形式存在.

4-(3-氨基苯基)噻唑-2-胺结构中, 由于环上N原子只有p轨道上一个电子参与芳香大π共轭体系, 另由于N原子的电负性较C原子强, 导致噻唑环上电子云密度较低, 位于环外的氨基N原子上的孤对电子易和噻唑环形成共轭结构, 使得2-氨基噻唑衍生物以氨基(Ⅰ)和亚氨基(Ⅱ)互变异构体的混合形式存在, 但是氨基形式通常是主要的形式^{[12, 13]}, 如Eq. 1所示过程中, 在20 ℃水中互变参数(tautomeric constant)^[14] K_T＝2×l0⁴.这也是环外氨基N原子碱性很弱, 即亲核性很弱, 不易发生亲核反应的原因. 2-氨基噻唑衍生物中环外2位氨基和取代的酰氯发生酰基化反应时, 就必须加热回流, 以缩短反应时间, 提高反应速率.

(1)

1.2 目标化合物对肿瘤细胞的增殖抑制活性

采用噻唑蓝(MTT)比色法, 以Crizotinib作为阳性对照, 对所合成目标化合物进行体外抗对A549、HT29、Hela、Karpas299的细胞增殖抑制活性测试.目标化合物的抑制率如表 1所示.发现目标化合物对HT29细胞株的抑制率高于对其它细胞株的抑制率.目标化合物系列Ⅰ(3a~3k)中, 2-胺-4-苯基噻唑母核中苯环上引入取代苯甲酰胺基后, 苯环(R基团)上不同取代基或不同取代位置导致活性差异较大.其中3, 4-二氯苯甲酰胺基3b、3-氯苯甲酰胺基3d、4-三氟甲基苯甲酰胺基3e、4-三氟甲基苯甲酰胺基3f等吸电子基团取代对四种细胞系的增殖的抑制活性较好, 而3, 4-二甲氧基苯甲酰胺基3i、3, 5-二甲氧基苯甲酰胺基3j则活性较差, R基团为环己基时, 无活性, 说明R为3, 4位合适大小的体积和电性的取代的苯环对肿瘤细胞的增殖抑制活性有利.另外, 将2-氨基噻唑环的2-氨基转化为较大空间位阻的苯甲酰胺取代的目标化合物系列Ⅱ (4a~4h), 无论苯甲酰胺的苯环上取代基的种类或位置如何, 都导致目标化合物对四种细胞系的抑制率明显下降, 说明在2-氨基噻唑环的2-氨基不宜引入位阻较大的取代基.而将2-氨基噻唑环的2-氨基转化2-甲氧基乙酰氨基或丁酰胺基, 对四种细胞系的抑制率也非常低, 可能是非芳香性的侧链缺乏疏水特性, 从而降低了对肿瘤细胞的增殖抑制活性.

表 1

表 1 目标化合物对不同肿瘤细胞的增殖抑制活性

Table 1. Single concentration inhibition of the target compounds (% inhibition)

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Compd.	Inhibition at 50 μmol/L
Compd.	A549	HT29	Hela	Karpas299
3a	23.20	29.60	19.12	14.43
3b	48.26	83.87	40.71	39.90
3c	24.14	46.27	31.91	35.56
3d	52.27	81.76	45.56	49.79
3e	18.47	70.54	30.53	35.29
3f	33.89	75.11	24.31	29.48
3g	30.55	50.28	20.29	21.85
3h	16.06	44.08	17.70	27.49
3i	14.33	26.69	13.51	9.64
3j	8.09	21.50	10.26	5.92
3k	3.54	4.20	3.74	2.56
4a	2.53	8.51	13.81	15.29
4b	10.33	31.66	11.50	17.78
4c	25.65	49.34	33.29	20.75
4d	43.26	60.66	25.88	19.90
4e	45.28	59.29	21.91	15.72
4f	3.21	12.85	11.50	10.81
4g	1.03	5.78	3.04	4.81
4h	0	1.72	0.80	0
Crizotinib	91.68	99.12	99.72	99.82

总体来看, 2-胺-4-苯基噻唑母核中, 2-氨基不宜引入位阻较大的苯甲酰胺取代基或类似2-甲氧基乙酰氨基这样的链状酰胺取代基.而2-胺-4-苯基噻唑母核中4位苯环是一个可以修饰的片段.

目标化合物3b、3d、3e、3f对四种细胞系具有很强的增殖抑制作用, 这些化合物都具有进一步的研究价值.进行了进一步复筛, 测得了其IC₅₀值, 如表 2示.

表 2

表 2 目标化合物的体外抗增殖活性

Table 2. Antiproliferative activity of the target compounds

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Compd.	IC₅₀/(μmol•L^－1)
Compd.	A549	HT29	Hela	Karpas299
3b	30.65	6.81	＞40	＞40
3d	14.46	4.42	24.27	28.68
3e	＞40	12.32	＞40	＞40
3f	＞40	10.54	＞40	＞40
Crizotinib	2.39	1.09	1.10	0.03

1.3 Western blot

为了进一步确定目标化合物在HT29细胞株的MET信号通路中对相关蛋白表达的影响.用10 μmol/L的目标化合物3d, 3e分别处理HT29细胞24 h后, Western blot结果显示(图 3), 在活性较好的目标化合物3d处理后, HT29细胞株MET总蛋白表达变化不明显, 但其下游信号分子p-MET的浓度水平下降明显.这些结果表明, 目标化合物尤其是化合物3d可能与Crizo- tinib作用机制相似, 通过抑制c-Met蛋白磷酸化来阻断肿瘤细胞的生长和繁殖等过程.

图 3

图 3. 检测c-Met蛋白在HT29细胞中的表达

Figure 3. Analysis of expression of c-Met in HT29 cells

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1.4 分子对接

用Discovery Studio软件将复合物晶体结构(PDB code 2WGJ)及配体小分子进行处理, 给受体及小分子配体赋CHARMm力场, 定义好结合位点Sphere, 采用CDOCK模块进行分子对接, 将Crizotinib重新对接回c-Met激酶结合位点(对接参数默认), 将CDOCKER_ ENERGY得分最高的配体构象与配体的真实构象进行对比, 两者重原子(Heavy Atom)的RMSD为0.6807 Å, 小于2 Å, 说明CDOCKER的对接方法可靠.然后将化合物3d与上述激酶结合位点采用相同的方法对接, 得分最高的对接构象很好地结合于Crizotinib的结合位点处, 结果如图 4所示.在蛋白-配体相互作用二维平面图中(图 5), 配体Crizotinib吡唑环和吡啶环都与Tyr1159以及苯环与Tyr1230形成π-π相互作用, 另外吡啶环上的N原子与Met1160、吡啶环上的氨基N原子与Pro1158形成氢键相互作用.在图 6中, 化合物3d结构中的苯环1也与Tyr1159形成π-π相互作用, 但苯环2和Tyr1159之间环面中心距离为7.092 Å, 不存在π-π相互作用.噻唑环面中心与Tyr1230苯环面中心的距离为4.566 Å, Crizotinib结构中对应的苯环与此氨基酸残基苯环面中心的距离为4.164 Å, 影响π-π相互作用的因素较多^[15], 可以认为化合物3d结构中噻唑环在对应位置也与Tyr1230有π-π相互作用.另外, 此噻唑环2位氨基与Asn1209、Arg1208形成两个氢键作用.上述相互作用很好地解释了化合物3d活性较好.化合物3d的2-氨基噻唑部分朝向U型c-Met激酶结合位点的U形深处, 而系列Ⅱ目标化合物在将2-氨基噻唑部分的氨基酰基化后, 引出一个空间体积过大的侧链指向U形深处, 导致系列Ⅱ化合物活性都较低.

图 4

图 4. 化合物3d的分子对接图

Figure 4. Molecular docking of compound 3d

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图 5

图 5. 蛋白-配体Crizotinib间相互作用

Figure 5. Protein-ligand Crizotinib interaction diagrams

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图 6

图 6. 蛋白-化合物3d间相互作用

Figure 6. Protein-compound 3d interaction diagrams

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2. 结论

基于Crizotinib的结构特征, 设计合成了19个未见文献报道的新型2-氨基-4-苯基噻唑类衍生物.利用¹H NMR, ¹³C NMR和HRMS确证了目标化合物的结构.运用MTT比色法测定了目标化合物在体外对人A549、HT29、Hela、Karpas299肿瘤细胞的增殖抑制活性, 部分化合物具有较好的抑制活性.其中化合物3d对HT29细胞的活性最好, IC₅₀值为4.42 μmol/L. Western blot证明化合物3d可能通过抑制c-Met蛋白磷酸化来阻断肿瘤细胞的生长和繁殖等过程.此系列化合物作为可能的新型c-Met抑制剂, 具有进一步临床开发研究的价值.

3. 实验部分

3.1 仪器与试剂

熔点用WRS-1B数字显示显微熔点测定仪测定, 温度计未经校正; ¹H NMR和¹³C NMR使用美国安捷伦公司400/54 Premium Shielded NMR Magnet System测定, TMS为内标; HRMS使用Agilent Technologies LC/MS 1200 series-6130 Quadrupole型液质联用仪测定.本实验所用有机试剂除有特殊说明, 均为分析纯或化学纯, 未经进一步纯化处理.

3.2 实验方法

3.2.1 4-(3-硝基苯基)噻唑-2-胺(1)的合成

按照文献[16]的方法制备, 表征数据与文献一致.

3.2.2 4-(3-氨基苯基)噻唑-2-胺(2)的合成

将硝基取代的噻唑-2-胺衍生物(0.66 g, 3.00 mmol)、NH₄Cl (0.16 g, 3.0 mmol)和铁粉(0.84 g, 15.0 mmol)加入到60%乙醇(90 mL)溶液中.在80 ℃下搅拌3 h, 趁热抽滤, 用热乙醇洗涤滤饼, 减蒸除乙醇.将所得含水浓缩物置于冰浴中, 饱和NaHCO₃溶液调pH至碱性(pH＝8~9), 释出大量固体, 抽滤、水洗、干燥得浅黄色粉末状固体.收率85.6%. m.p. 157.3~159.0 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.02 (t, J＝2.0 Hz, 1H), 7.01~6.96 (m, 3H), 6.93 (dt, J＝7.6, 1.4 Hz, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.46 (ddd, J＝7.7, 2.4, 1.2 Hz, 1H), 5.15 (s, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.19, 151.08, 148.96, 135.89, 129.25, 113.90, 113.47, 111.89, 100.98; HRMS calcd for C₉H₁₀N₃S (M+H)⁺ 192.0595, found 192.0633.

3.2.3 系列Ⅰ目标化合物的合成

将4-(3-氨基苯基)噻唑-2-胺(0.19 g, 1.0 mmol)、三乙胺(0.20 g, 2.0 mmol)和取代的苯甲酰氯(1.5 mmol)加入到CH₂Cl₂ (10 mL)溶液中, 20 ℃反应约12 h.薄层色谱(TLC)监测反应结束后, 将反应混合物加水(10 mL), 用CH₂Cl₂ (10 mL×3)萃取.合并的有机层依次用饱和NaHCO₃溶液和饱和NaCl溶液洗涤, 用无水NaSO₄干燥有机层并减压浓缩.残余物通过柱色谱法纯化.

N-(3-(2-氨基噻唑-4-基)苯基)-3-甲基苯甲酰胺(3a):浅黄色固体, 收率90.5%. m.p. 157.5~159.7 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.25 (s, 1H), 8.24 (t, J＝1.9 Hz, 1H), 7.82~7.79 (m, 1H), 7.79~7.73 (m, 1H), 7.67 (ddd, J＝8.0, 2.2, 1.0 Hz, 1H), 7.53 (dt, J＝7.9, 1.2 Hz, 1H), 7.46~7.38 (m, 2H), 7.33 (t, J＝7.9 Hz, 1H), 7.07 (s, 2H), 6.95 (s, 1H), 2.41 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.55, 165.98, 150.25, 139.78, 138.09, 135.74, 135.32, 132.55, 129.05, 128.71, 128.56, 125.27, 121.31, 119.75, 118.38, 102.00, 21.42; HRMS calcd for C₁₇H₁₆N₃OS (M+H)⁺ 310.1014, found 310.10598.

N-(3-(2-氨基噻唑-4-基)苯基)-3, 4-二氯苯甲酰胺(3b):灰白色固体, 收率92.6%. m.p. 211.2~213.0 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.45 (s, 1H), 8.28~8.19 (m, 2H), 7.96 (dd, J＝8.4, 2.1 Hz, 1H), 7.83 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 7.66 (ddd, J＝8.1, 2.2, 1.0 Hz, 1H), 7.59~7.51 (m, 1H), 7.35 (t, J＝7.9 Hz, 1H), 7.07 (s, 2H), 6.97 (s, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.57, 163.49, 150.10, 139.32, 135.80, 135.57, 134.78, 131.70, 131.20, 130.04, 129.16, 128.52, 121.67, 119.78, 118.46, 102.15; HRMS calcd for C₁₆H₁₂Cl₂N₃OS (M+H)⁺ 364.0078, found 364.0080.

N-(3-(2-氨基噻唑-4-基)苯基)-2, 4-二氯苯甲酰胺(3c):白色固体, 收率91.2%. m.p. 214.4~214.9 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.73 (s, 1H), 8.37 (d, J＝1.9 Hz, 1H), 7.94 (d, J＝2.0 Hz, 1H), 7.81 (d, J＝8.2 Hz, 1H), 7.76~7.65 (m, 3H), 7.49 (t, J＝7.9 Hz, 1H), 7.24 (s, 2H), 7.11 (s, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.59, 164.41, 150.07, 139.32, 136.23, 135.94, 135.22, 131.66, 130.77, 129.61, 129.26, 127.88, 121.61, 119.00, 117.64, 102.21; HRMS calcd for C₁₆H₁₂Cl₂N₃OS (M+H)⁺ 364.0078, found 364.01598.

N-(3-(2-氨基噻唑-4-基)苯基)-3-氯苯甲酰胺(3d):灰白色固体, 收率91.1%. m.p. 171.2~171.5 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.56 (s, 1H), 8.40 (d, J＝1.8 Hz, 1H), 8.21 (t, J＝1.9 Hz, 1H), 8.10 (d, J＝7.8 Hz, 1H), 7.83 (d, J＝8.0 Hz, 2H), 7.73 (dd, J＝15.3, 7.6 Hz, 2H), 7.51 (t, J＝7.9 Hz, 1H), 7.23 (s, 2H), 7.12 (s, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.58, 164.38, 150.15, 139.47, 137.27, 135.79, 133.62, 131.82, 130.83, 129.12, 127.85, 126.95, 121.58, 119.79, 118.45, 102.10; HRMS calcd for C₁₆H₁₃ClN₃OS (M+H)⁺ 330.0468, found 330.0549.

N-(3-(2-氨基噻唑-4-基)苯基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺(3e):浅黄色固体, 收率92.1%. m.p. 199.1~201.0 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.54 (s, 1H), 8.37~8.26 (m, 2H), 8.23 (t, J＝1.9 Hz, 1H), 8.02~7.94 (m, 1H), 7.80 (t, J＝7.8 Hz, 1H), 7.70 (ddd, J＝8.1, 2.3, 1.1 Hz, 1H), 7.56 (dt, J＝7.8, 1.3 Hz, 1H), 7.36 (t, J＝7.9 Hz, 1H), 7.07 (s, 2H), 6.97 (s, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.57, 164.35, 150.11, 139.39, 136.13, 135.80, 132.34, 130.17, 129.72 (d, J_CF＝32.32 Hz), 129.40, 129.16, 128.60, 128.57, 125.78 (d, J_CF＝273.71 Hz), 124.72, 124.69, 124.65, 124.61(dd, J_CF＝4.04 Hz), 121.65, 119.87, 118.55, 102.14; HRMS calcd for C₁₇H₁₃F₃N₃OS (M+H)⁺ 364.0731, found 364.0836.

N-(3-(2-氨基噻唑-4-基)苯基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(3f):白色固体, 收率92.6%. m.p. 210.7~211.7 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.53 (s, 1H), 8.25 (t, J＝1.9 Hz, 1H), 8.21~8.14 (m, 2H), 7.98~7.89 (m, 2H), 7.67 (ddd, J＝8.1, 2.2, 1.0 Hz, 1H), 7.56 (dt, J＝7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.36 (t, J＝7.9 Hz, 1H), 7.08 (s, 2H), 6.97 (s, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.58, 164.72, 150.11, 139.40, 139.13, 135.81, 131.91(d, J_CF＝32.32 Hz), 131.59, 129.16, 129.04, 125.88, 125.85, 125.81, 125.77 (dd, J_CF＝4.04 Hz), 123.01, 121.68 (d, J_CF＝186.85 Hz), 119.83, 118.48, 102.14; HRMS calcd for C₁₇H₁₃F₃N₃OS (M+H)⁺ 364.0731, found 364.0736.

N-(3-(2-氨基噻唑-4-基)苯基)-3-氟苯甲酰胺(3g):白色固体, 收率93.3%. m.p. 177.2~178.7 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.53 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.04~7.93 (m, 2H), 7.82 (dd, J＝8.0, 2.0 Hz, 1H), 7.74 (ddd, J＝19.9, 10.0, 6.8 Hz, 2H), 7.61 (td, J＝8.5, 2.5 Hz, 1H), 7.51 (t, J＝7.9 Hz, 1H), 7.23 (s, 2H), 7.12 (s, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.58, 164.47, 164.44, 163.56 (d, J_CF＝245.43 Hz), 161.13, 150.17, 139.47, 137.64, 137.57, 135.79, 131.04, 129.11, 124.34 (d, J_CF＝2.02 Hz), 124.32, 121.57, 119.83, 119.00, 118.79, 118.48, 115.05 (d, J_CF＝23.23 Hz), 102.09; HRMS calcd for C₁₆H₁₃FN₃OS (M+H)⁺ 314.0763, found 314.0827.

N-(3-(2-氨基噻唑-4-基)苯基)-4-氟苯甲酰胺(3h):白色固体, 收率93.6%. m.p. 219.0~221.0 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.32 (s, 1H), 8.24 (t, J＝1.9 Hz, 1H), 8.12~8.00 (m, 2H), 7.69~7.61 (m, 1H), 7.53 (dt, J＝7.8, 1.3 Hz, 1H), 7.42~7.30 (m, 3H), 7.07 (s, 2H), 6.95 (s, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.56, 165.72 (d, J_CF＝249.47 Hz), 164.76, 163.25, 150.20, 139.64, 135.75, 131.75, 131.72, 130.88 (d, J_CF＝9.09 Hz), 130.79, 129.08, 121.41, 119.80, 118.44, 115.86 (d, J_CF＝21.21 Hz), 115.65, 102.05; HRMS calcd for C₁₆H₁₃FN₃OS (M+H)⁺ 314.0763, found 314.0777.

N-(3-(2-氨基噻唑-4-基)苯基)-3, 4-二甲氧基苯甲酰胺(3i):黄色固体, 收率90.6%. m.p. 223.5~225.0 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.09 (s, 1H), 8.16 (t, J＝1.9 Hz, 1H), 7.63 (td, J＝8.1, 1.9 Hz, 2H), 7.57~7.45 (m, 2H), 7.29 (t, J＝7.9 Hz, 1H), 7.05 (d, J＝8.5 Hz, 1H), 7.02 (s, 2H), 6.92 (s, 1H), 3.81 (d, J＝6.0 Hz, 6H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.53, 165.21, 152.01, 150.25, 148.66, 139.83, 135.70, 129.01, 127.29, 121.50, 121.18, 119.93, 118.57, 111.37, 111.31, 101.98, 56.08, 56.03; HRMS calcd for C₁₈H₁₈N₃O₃S (M+H)⁺ 356.1069, found 356.1069.

N-(3-(2-氨基噻唑-4-基)苯基)-3, 5-二甲氧基苯甲酰胺(3j):黄色固体, 收率91.7%. m.p. 208.4~209.1 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.19 (s, 1H), 8.18 (d, J＝2.2 Hz, 1H), 7.67~7.59 (m, 1H), 7.50 (dd, J＝7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.30 (t, J＝7.9 Hz, 1H), 7.11 (d, J＝2.1 Hz, 2H), 7.02 (s, 2H), 6.92 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.35~3.28 (m, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.55, 165.33, 160.77, 150.20, 139.58, 137.31, 135.74, 129.05, 121.43, 119.94, 118.59, 106.00, 103.84, 102.04, 55.93; HRMS calcd for C₁₈H₁₈N₃O₃S (M+H)⁺ 356.1069, found 356.1069.

N-(3-(2-氨基噻唑-4-基)苯基)环己基甲酰胺(3k):白色固体, 收率86.1.3%. m.p. 178.5~179.7 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.80 (s, 1H), 8.05 (t, J＝1.9 Hz, 1H), 7.46~7.36 (m, 2H), 7.21 (t, J＝7.9 Hz, 1H), 7.01 (s, 2H), 6.86 (s, 1H), 2.29 (tt, J＝11.7, 3.3 Hz, 1H), 1.82~1.67 (m, 4H), 1.62 (d, J＝11.3 Hz, 1H), 1.45~1.31 (m, 2H), 1.30~1.08 (m, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 174.69, 168.48, 150.28, 140.05, 135.71, 129.04, 120.55, 118.45, 117.16, 101.88, 45.24, 29.58, 25.85, 25.68; HRMS calcd for C₁₆H₂₀N₃OS (M+H)⁺ 302.1327, found 302.1327.

3.2.4 系列Ⅱ目标化合物的合成

将4-(3-氨基苯基)噻唑-2-胺(0.19 g, 1.0 mmol)、三乙胺(0.20 g, 2.0 mmol)和取代的苯甲酰氯(2.5 mmol)加入到CH₂Cl₂ (10 mL)溶液中, 回流反应约24 h. TLC监测反应结束后, 将反应混合物加水(10 mL), 用CH₂Cl₂ (10 mL×3)萃取.合并的有机层依次用饱和NaHCO₃溶液和饱和NaCl溶液洗涤, 用无水NaSO₄干燥有机层并减压浓缩.残余物通过柱色谱法纯化.

2, 4-二氯-N-(4-(3-(2, 4-二氯苯甲酰氨基)苯基)噻唑- 2-基)苯甲酰胺(4a):白色固体, 收率64.2%. m.p. 174.2~176.7 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.19 (s, 1H), 10.81 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 7.95 (dd, J＝6.2, 2.0 Hz, 2H), 7.91~7.78 (m, 4H), 7.77~7.70 (m, 2H), 7.67 (d, J＝8.1 Hz, 1H), 7.59 (d, J＝8.0 Hz, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 164.61, 164.49, 158.00, 149.42, 139.57, 136.18, 136.16, 135.29, 135.19, 133.59, 132.04, 131.66, 131.36, 130.77, 129.79, 129.64, 127.92, 127.88, 121.96, 119.71, 117.64, 109.57; HRMS calcd for C₂₃H₁₄Cl₄N₃O₂S (M+H)⁺ 535.9561, found 535.9617.

3-氯-N-(4-(3-(3-氯苯甲酰氨基)苯基)噻唑-2-基)苯甲酰胺(4b):白色固体, 收率66.3%. m.p. 195.2~196.7 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.14 (s, 1H), 10.62 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.36 (d, J＝2.4 Hz, 1H), 8.28~8.20 (m, 2H), 8.11 (d, J＝7.8 Hz, 1H), 7.92~7.71 (m, 7H), 7.60 (t, J＝7.9 Hz, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 164.47, 164.40, 158.74, 149.60, 139.68, 137.22, 135.20, 134.44, 133.84, 133.66, 132.83, 131.91, 131.00, 130.90, 129.47, 128.46, 127.85, 127.38, 126.96, 122.01, 120.56, 118.62, 110.00, 109.50; HRMS calcd for C₂₃H₁₆Cl₂N₃O₂S (M+H)⁺ 468.0340, found 468.0383.

3-(三氟甲基)-N-(4-(3-(3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯基)噻唑-2-基)苯甲酰胺(4c):白色固体, 收率60.2%. m.p. 213.0~215.0 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.22 (s, 1H), 10.76 (s, 1H), 8.71~8.61 (m, 2H), 8.57 (d, J＝7.9 Hz, 1H), 8.53~8.43 (m, 2H), 8.17 (dd, J＝13.0, 7.8 Hz, 2H), 7.97 (t, J＝7.9 Hz, 2H), 7.92~7.80 (m, 3H), 7.62 (t, J＝7.9 Hz, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 164.45, 164.42, 158.92, 149.53, 139.62, 136.09, 135.22, 133.51, 132.77 (d, J_CF＝33.33 Hz), 132.34, 130.33, 130.22, 129.91, 129.76, 129.59, 129.50, 129.45, 128.65, 126.57, 125.77, 125.68, 125.45, 125.42, 125.38, 125.34, 124.72, 124.68, 124.64, 124.61 (dd, J_CF＝4.04 Hz), 123.06, 122.96, 122.08 (d, J_CF＝145.44 Hz), 120.99, 120.64, 118.73, 109.53; HRMS calcd for C₂₅H₁₆F₆N₃O₂S (M+H)⁺ 536.0867, found 536.0915.

4-(三氟甲基)-N-(4-(3-(4-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯基)噻唑-2-基)苯甲酰胺(4d):白色固体, 收率61.0%. m.p. 211.3.2~212.7 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.29 (s, 1H), 10.75 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.48 (d, J＝8.1 Hz, 2H), 8.35 (d, J＝8.1 Hz, 2H), 8.10 (d, J＝8.1 Hz, 4H), 7.87 (q, J＝6.4, 5.1 Hz, 2H), 7.81 (dd, J＝7.8, 2.1 Hz, 1H), 7.61 (t, J＝7.9 Hz, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 164.79, 164.71, 158.74, 149.60, 139.63, 139.07, 136.32, 135.21, 132.71, 132.40 (m, J_CF＝33.33 Hz), 131.99, 131.67, 129.61, 129.51, 129.05, 126.02, 125.98, 125.94, 125.90, 125.86, 125.82 (m, J_CF＝4.04 Hz), 125.71, 125.59, 123.00, 122.12 (d, J_CF＝153.52 Hz), 120.60, 118.65, 109.62; HRMS calcd for C₂₅H₁₆F₆N₃O₂S (M+H)⁺ 536.0867, found 536.0924.

3-氟-N-(4-(3-(3-氟苯甲酰氨基)苯基)噻唑-2-基)苯甲酰胺(4e):白色固体, 收率84.4%. m.p. 179.9~181.6 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.13 (s, 1H), 10.59 (s, 1H), 8.65 (d, J＝1.9 Hz, 1H), 8.19~8.09 (m, 2H), 8.05~7.94 (m, 2H), 7.87 (d, J＝7.8 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.78 (ddt, J＝11.6, 8.1, 4.0 Hz, 3H), 7.71~7.57 (m, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 164.54, 164.52, 164.46, 163.57, 161.15 (d, J_CF＝238.36 Hz), 161.13, 158.79, 149.60, 139.68, 137.57, 137.51, 135.20, 134.73, 134.66, 131.28, 131.20, 131.12 (d, J_CF＝8.08 Hz), 131.04, 129.47, 124.92, 124.89, 124.35, 124.32 (d, J_CF＝3.03 Hz), 122.02, 120.59, 120.11, 119.90, 119.10, 118.89, 118.66, 115.58, 115.35, 115.05 (d, J_CF＝23.23 Hz), 114.82, 109.51; HRMS calcd for C₂₃H₁₆F₂N₃O₂S (M+H)⁺ 436.0931, found 436.0934.

4-氟-N-(3-(4-(4-氟苯甲酰氨基)苯基)噻唑-2-基)苯甲酰胺(4f):白色固体, 收率64.8%. m.p. 187.2~189.7 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.05 (s, 1H), 10.53 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.42~8.34 (m, 1H), 8.20 (m, 3H), 7.86 (d, J＝7.9 Hz, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.78 (d, J＝8.2 Hz, 1H), 7.56 (td, J＝8.6, 4.6 Hz, 4H), 7.48 (t, J＝8.7 Hz, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 166.91, 166.50, 166.34 (d, J_CF＝251.49 Hz), 165.77 (d, J_CF＝211.09 Hz), 164.82, 164.68, 163.85, 163.29, 158.97, 149.55, 139.84, 135.21, 132.55, 132.45, 131.69 (d, J_CF＝8.08 Hz), 131.57, 131.48, 130.89 (d, J_CF＝9.09 Hz), 130.80, 129.42, 128.98, 121.85, 120.52, 118.62, 116.19 (d, J_CF＝22.22 Hz), 116.11 (d, J_CF＝23.23 Hz), 115.97, 115.93, 115.89, 115.71, 109.30; HRMS calcd for C₂₃H₁₆F₂- N₃O₂S (M+H)⁺ 436.0931, found 436.0978.

2-甲氧基-N-(4-(3-(2-甲氧基乙酰氨基)苯基)噻唑-2-基)乙酰胺(4g):白色固体, 收率86.0%. m.p. 145.8~147.0 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.41 (s, 1H), 9.98 (s, 1H), 8.46 (d, J＝1.8 Hz, 1H), 7.79~7.64 (m, 3H), 7.52 (t, J＝7.9 Hz, 1H), 4.33 (s, 2H), 4.18 (s, 2H), 3.54 (d, J＝10.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.03, 168.53, 157.75, 149.20, 139.22, 135.08, 129.41, 121.46, 119.77, 117.81, 108.79, 72.10, 70.87, 59.18, 59.09; RMS calcd for C₁₅H₁₈N₃O₄S (M+H)⁺ 336.1018, found 336.1061.

N-(4-(3-丁酰胺苯基)噻唑-2-基)丁酰胺(4h):白色固体, 收率88.9%. m.p. 166.5~168.3 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.23 (s, 1H), 9.91 (s, 1H), 8.25 (t, J＝2.0 Hz, 1H), 7.78 (s, 0H), 7.51 (d, J＝7.5 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.39~7.34 (m, 1H), 7.29 (t, J＝7.8 Hz, 1H), 2.39 (td, J＝7.3, 3.6 Hz, 2H), 2.26 (t, J＝7.3 Hz, 2H), 1.59 (qd, J＝7.3, 4.3 Hz, 4H), 0.88 (td, J＝7.4, 5.7 Hz, 6H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 171.89, 171.58, 158.27, 149.18, 140.10, 135.21, 129.37, 126.46, 120.86, 119.47, 118.96, 117.14, 108.33, 38.73, 37.21, 19.01, 18.61, 14.07, 13.97; HRMS calcd for C₁₇H₂₂N₃O₂S (M+H)⁺ 332.1433, found 332.1433.

3.2.5 活性测试

取对数生长期的受试细胞胞经EDTA-胰酶消化、离心之后, 将均匀的单细胞悬液(浓度为5×10⁴个/mL)按每孔细胞悬液100 μL准确接种至96孔板, 置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h.待细胞贴壁后各孔分别加入不同浓度的目标化合物100 μL, 每个浓度均设3个复孔.然后置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h, 各孔再加入MTT溶液, 继续培养4 h.弃去培养基后每孔加入100 μL DMSO, 培养板震荡10 min.用酶标仪测定每孔的吸光度值, 测试波长设为490和570 nm.各组OD值取均值后, 计算目标化合物的抑制百分数.根据不同难度的抑制率, 用GraphPad Prism 6软件采用非线性回归法计算半数抑制浓度IC₅₀值.

3.2.6 Western blotting实验

收集HT29细胞, PBS洗涤后加入RIPA (Radio immuno precipitation assay)缓冲液(150 mmol•L^－1 NaCl, 1% NP-40, 1% SDS, 1 mmol•L^－1 PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride), 10 μg/mL亮抑蛋白酶肽, 1 mmol•L^－1抑肽酶, 50 mmol•L^－1 Tris-Cl, pH 7.4)中30 min.通过BCA (Bicinchonininc acid)法测定蛋白质浓度后, 在10% SDS-PAGE凝胶上分离细胞裂解物(每道50 μg)并转移至PVDF膜上.将膜置于封闭缓冲液(含有5%脱脂奶粉的TBST)中室温封闭1 h, 然后将膜置于1:1000稀释的初级抗体温育3 h, 用1:2000稀释的HRP (Horseradish peroxidase)标记的二抗在室温下处理30 min.用ECL (Enhanced chemiluminescence)显色.

辅助材料(Supporting Information) 化合物2, 3a~3j, 4a~4h的¹H NMR、¹³C NMR.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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图 1 目标化合物的设计思想

Figure 1 Design method of the title compounds

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图 2 Crizotinib(棍状模型)及化合物3b(球棍模型)立体叠合

Figure 2 3D superimposition of crizotinib (stick) and compounds 3b (ball and stick)

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图式 1 目标化合物的合成路线

Scheme 1 Synthetic route of target compounds

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图 3 检测c-Met蛋白在HT29细胞中的表达

Figure 3 Analysis of expression of c-Met in HT29 cells

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图 4 化合物3d的分子对接图

Figure 4 Molecular docking of compound 3d

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图 5 蛋白-配体Crizotinib间相互作用

Figure 5 Protein-ligand Crizotinib interaction diagrams

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图 6 蛋白-化合物3d间相互作用

Figure 6 Protein-compound 3d interaction diagrams

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表 1 目标化合物对不同肿瘤细胞的增殖抑制活性

Table 1. Single concentration inhibition of the target compounds (% inhibition)

Compd.	Inhibition at 50 μmol/L
Compd.	A549	HT29	Hela	Karpas299
3a	23.20	29.60	19.12	14.43
3b	48.26	83.87	40.71	39.90
3c	24.14	46.27	31.91	35.56
3d	52.27	81.76	45.56	49.79
3e	18.47	70.54	30.53	35.29
3f	33.89	75.11	24.31	29.48
3g	30.55	50.28	20.29	21.85
3h	16.06	44.08	17.70	27.49
3i	14.33	26.69	13.51	9.64
3j	8.09	21.50	10.26	5.92
3k	3.54	4.20	3.74	2.56
4a	2.53	8.51	13.81	15.29
4b	10.33	31.66	11.50	17.78
4c	25.65	49.34	33.29	20.75
4d	43.26	60.66	25.88	19.90
4e	45.28	59.29	21.91	15.72
4f	3.21	12.85	11.50	10.81
4g	1.03	5.78	3.04	4.81
4h	0	1.72	0.80	0
Crizotinib	91.68	99.12	99.72	99.82

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表 2 目标化合物的体外抗增殖活性

Table 2. Antiproliferative activity of the target compounds

Compd.	IC₅₀/(μmol•L^－1)
Compd.	A549	HT29	Hela	Karpas299
3b	30.65	6.81	＞40	＞40
3d	14.46	4.42	24.27	28.68
3e	＞40	12.32	＞40	＞40
3f	＞40	10.54	＞40	＞40
Crizotinib	2.39	1.09	1.10	0.03

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142