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• 薯蓣皂苷元(图 1)是从薯蓣科植物盾叶薯、穿龙薯蓣等根茎中分离出来的一种甾体类化合物^[1], 其化学名称为Δ⁵-异螺旋甾烯-3β-醇, 是合成甾体激素类药物和甾体避孕药的重要原料^[2], 具有降血脂、抗血栓、抗肿瘤等药理活性^[3~12].但是薯蓣皂苷元的药物脂溶性大, 口服生物利用度很低, 抗肿瘤活性较弱, 毒副作用较大, 这使得薯蓣皂苷元在医药上的应用受到限制.近年来, 多个课题组对薯蓣皂苷元的A环C-3位羟基和F环C-26进行结构修饰和改造, 当引入亲水基团(如含氮基团、酰胺基团、盐类基团、糖类基团等)^{[6, 13~23]}, 水溶性增加, 生物活性明显提高; 引入亲酯类的基团(如L-苯丙氨酸、L-赖氨酸等)^{[13, 15~18]}, 水溶性降低, 生物活性较低.实验表明, 薯蓣皂苷元的水溶性增加能提高其生物活性.

  图 1

  

  图 1.  薯蓣皂苷元的结构

  Figure 1.  Structure of cyclovirobuxine

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  受到以上工作的启发, 我们设想对薯蓣皂苷元C-3位酰胺化再引入含氮基团, 通过提高水溶性来改善生物活性.而且胺类衍生物结构具有独特的生物活性, 可以延长药物在体内的作用时间, 降低毒副作用, 提高药物的生物利用度^[24~31], 将薯蓣皂苷元A环3位改造成酰胺含氮类结构的化合物, 同类衍生物的合成鲜有报道, 因此我们设计了C-3位酰胺化后引入含氮基团.

  本工作以薯蓣皂苷元为原料, 将C-3位羟基叠氮化, 然后使叠氮基还原为氨基得到化合物3^[22], 再以三乙胺作碱, 与氯乙酰氯反应得到C-3位酰胺类化合物4^[32], 最后化合物4再与含氮化合物反应, 得到一系列酰胺类含氮衍生物5.对目标化合物5进行药理活性研究, 考察不同衍生物的抗肿瘤活性.

  1.   结果与讨论

  1.1   目标化合物5的设计合成

  薯蓣皂苷元结构中存在不同的活性基团, 首先将C-3位羟基转变为酰胺基团, 再与含氮类化合物反应生成目标化合物5a~5i (Scheme 1).在这些衍生物合成中, 为了考察不同含氮化合物的药理活性, 本工作选择了不同结构特征的胺类化合物, 如含氮杂环类、含氮直链类.

  图式 1

  

  图式 1.  目标化合物5的合成

  Scheme 1.  Synthesis of compounds 5

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  1.2   目标化合物5的合成条件研究

  在衍生物5的合成中, 对溶剂进行了筛选.当以甲苯作溶剂时, 由于原料溶解性差, 原料无法反应完全; 当二氯甲烷、丙酮作溶剂时, 原料溶解性提高, 原料反应完全且产率显著提高.本工作不仅考察了溶剂对反应的影响, 而且也考察缚酸剂对反应的影响.反应物有机胺本身为碱, 因此在大部分衍生物的合成中, 不加碱的条件下就可完全反应, 但是在5b、5g的合成中, 不加碱的条件下, 反应不完全且副产物较多.其原因可能是, 咪唑、四氢吡咯活性较差, 加入碱后可能会提高亲核试剂的活性.当以丙酮作溶剂, 三乙胺为缚酸剂时, 副产物减少且原料反应完全, 产率提高到86%.

  1.3   目标化合物5的结构表征

  薯蓣皂苷元含氮衍生物的IR谱图中, N—H的伸缩振动峰在3354~3553 cm^-1左右, 酰胺结构的C＝O的伸缩振动峰在1651~1688 cm^-1.在其¹H NMR谱图中, 薯蓣皂苷元的特征峰分别是δ 5.41~5.38 (H-6), 4.41 (H-16), 4.12 (H-3), 2.89~4.61 (CH₂-H)和3.46~3.35 (H-26);含氮衍生物中, δ 7.50, 7.14, 6.91处为咪唑环上的质子峰, 吗啉环的质子峰在δ 3.69和2.5左右, 羟乙基哌嗪环的质子峰在δ 3.04左右, 哌嗪环的质子峰在δ 2.97左右, 四氢吡咯环的质子峰在δ 3.13和2.5左右, 二乙醇胺的质子峰在δ 3.63和2.74左右, 二乙胺的质子峰在δ 2.50左右.在HRMS谱图中, 目标产物的HRMS [M+H]⁺实测值和理论计算值一致, 进一步证实了目标化合物的结构.

  1.4   药理实验

  采用噻唑蓝(MTT)法考察了所有衍生物对A549(人肺癌细胞)、A431(人肺癌细胞)、H1975(人肺癌细胞)、HCT-116(人结肠癌细胞)、Aspc-1(人胰腺癌细胞)和Ramos(人B淋巴瘤细胞)的抗肿瘤活性以及对HBE(人支气管上皮细胞)、LO-2(正常肝细胞)的细胞毒性, 测定结果如表 1所示.

  表 1

  

  表 1  薯蓣皂苷元衍生物的抗肿瘤活性及细胞毒性[IC₅₀/(μmol•L^-1)]

  Table 1.  Antitumor activity and cytotoxicity [IC₅₀/(μmol•L^-1)] of diosgenin derivatives

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  Compound	Antitumor activity							Cytotoxicity
  	A549	A431	H1975	HCT-116	Aspc-1	Ramos		HBE	LO-2
  5a	5.13	4.12	6.66	5.83	7.73	10.97		5.72	5.62
  5b	2.24	8.87	22.57	8.57	18.71	＞40		10.91	11.95
  5c	28.21	8.77	57.88	10.49	15.06	29.60		51.85	11.86
  5d	5.00	8.24	41.56	11.15	23.53	＞40		13.50	20.73
  5e	3.36	2.47	8.16	6.03	6.73	12.01		63.07	4.15
  5f	12.05	33.72	74.03	31.58	29.66	＞40		85.49	＞40
  5g	23.50	19.44	46.97	18.13	29.57	＞40		55.74	22.63
  5h	4.50	18.77	41.83	5.60	29.06	＞40		＞80	26.18
  5i	12.22	6.82	17.10	9.17	13.55	19.87		55.38	8.74
  4	2.89	3.19	＜5	9.34	13.37	3.56		22.91	4.25
  阿霉素	0.78	＜2.5	＜5	＞1.2.5	＜5	＜2.5		＜5	7.88
  薯蓣皂苷元	71.23	4.74	50.59	31.41	63.11	＞40		45.56	＞40

  薯蓣皂苷元含氮衍生物IC₅₀值显示, 大部分衍生物比薯蓣皂苷元具有高的肿瘤抑制活性和低的细胞毒性.尤其是含有哌嗪环的衍生物5a、5e对大部分细胞抗肿瘤活性显著, 仅对A431、Ramos细胞抑制活性较差.此外, 除衍生物5a (IC₅₀＝5.72 μmol•L^-1)、5b (IC₅₀＝10.91 μmol•L^-1)、5d (IC₅₀＝13.50 μmol•L^-1)外, 其余衍生物对HBE细胞均显低的细胞毒性, 对LO-2细胞, 该系列衍生物的细胞毒性普遍较高.中间体4和衍生物5对肺癌细胞A549, H1975, A431表现出良好的抑制活性, 对肺癌细胞A431, 抑制活性较差, 其中化合物4、5a和5e, 对A549, H1975和三种肺癌细胞都具有显著的抗肿瘤活性.对于HCT-116(人结肠癌细胞)、Aspc-1(人胰腺癌细胞), 化合物4和衍生物5有较好的生物活性, 对Ramos(人B淋巴瘤细胞), 化合物5a、5c、5e、5i及4抗肿瘤活性较高, 其余衍生物抗肿瘤活性较差.

  鉴于衍生物5e对大部分细胞有较好的抑制活性和较低的生物毒性, 我们对衍生物5e进行了酶活性的测试. EGFR酶(表皮生长因子受体)广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面, EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关.因此, 我们选用EGFR考察5e的活性, 首先考察不同浓度50, 100, 200, 500 nmol• L^-1下细胞的存活率, 计算得IC₅₀值为332.9 nmol•L^-1, 实验结果进一步体现了5e良好的生物活性.

  1.5   水溶性实验

  用紫外分光光度法测定薯蓣皂苷元及其衍生物在水中的溶解性^{[33, 34]}, 在紫外可见分光光度计上于200~900 nm范围内扫描, 在271 nm处有特征吸收峰, 确定检测波长为271 nm, 测定结果如表 2所示.

  表 2

  

  表 2  薯蓣皂苷元及薯蓣皂苷元衍生物的水溶性

  Table 2.  Water-solublity of diosgenin and diosgenin derivatives

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  Compound	Solublity/(mg•mL-1)
  薯蓣皂苷元	0.247
  中间体4	0.387
  5a	0.545
  5b	0.315
  5c	0.431
  5d	0.570
  5e	0.620
  5f	0.382
  5g	0.398
  5h	0.361
  5i	0.422

  薯蓣皂苷元衍生物5a~5i及中间体4的水溶性相对于薯蓣皂苷元在水中的溶解度分别比薯蓣皂苷元增加了1.5~2.5倍不等, 其中5a, 5d, 5e溶解性较好, 为薯蓣皂苷元的2.2倍以上, 生物活性也相对较好(IC₅₀＝3.66~12.0 μmol•L^-1); 5c、5i溶解性一般, 为薯蓣皂苷元的1.7倍以上, 生物活性部分较好(IC₅₀＝6.82~29.6 μmol•L^-1); 4, 5b, 5f, 5g, 5h水溶性较差, 生物活性大部分较低(IC₅₀＝12.05~74.03 μmol•L^-1).该系列衍生物中, 水溶性较好的化合物在药理实验中也表现出了良好的生物活性, 这为下一步设计薯蓣皂苷元衍生物提供了新的方向.

  1.6   分子对接模型

  利用AutoDock分子对接软件, 对比5e、吉非替尼(Gefitinib)与EGFR的结合情况.从结合位点分析, 化合物5e与EGFR的结合区域及占据位点与Gefitinib的结合位点部分相同(图 2), 如Asp-855、Leu-718, Gly-719, Val-726, Ala-743等结合位点一致, 说明了甾体骨架对于生物活性的重要性.此外, 5e结构中哌嗪环上的羟基与Ser-720结合可能形成氢键, 使得5e和EGFR结合更牢固, 因而提高化合物5e的抗肿瘤活性.在化合物5e, 5a, 5d的结构中均含有活泼氢, 而且药理活性都较高.可能原因是这些化合物能与EGFR中的Ser-720形成氢键增强结合, 提高抗肿瘤药理活性.

  图 2

  

  图 2.  化合物5e(红色)、Gefitinib(绿色)与EGFR的对接模型

  Figure 2.  Docking model of compound 5e(red) and Gefitinib (green) with EGFR

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  2.   结论

  以薯蓣皂苷元为先导物, 设计合成了9个新型薯蓣皂苷元含氮衍生物, 其结构经¹H NMR, ¹³C NMR, IR和HRMS鉴定.所有衍生物都经过了抗肿瘤活性和细胞毒性的研究, 与薯蓣皂苷元对比, 大部分衍生物及中间体显示出高抑制活性和低细胞毒性, 其中含有哌嗪环的衍生物5a, 5e及中间体4显示出了较强的抑制活性, 5c, 5e~5i衍生物对HBE细胞显示低的细胞毒性.本文的研究结果对薯蓣皂苷元的结构修饰和不同基团抗肿瘤活性的研究提供一定的参考价值.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  Agilent-400 (400 MHz)型核磁共振仪, TMS作内标, CDCl₃作溶剂; SGW-4显微熔点测定仪(上海精密科学仪器有限公司), 温度计未经校正; LCQ ADVANTAGE MAX质谱仪; SGW-1型旋光仪(上海仪电物理光学仪器有限公司); FTS 3000傅里叶变换红外光谱仪(美国DIGILAB公司), KBr压片; UV-210A型紫外分光光度计; 硅胶GF₂₅₄高效板(烟台江友硅胶开发有限公司).其余试剂均为分析纯试剂.

  3.2   细胞的培养

  收集对数期生长的A549, A431, H1975, HCT-116, Aspc-1, Ramos, HBE和LO-2细胞, 调整悬浊液浓度, 每孔体积100 μL, 7×10³个细胞, 接种到96孔板.细胞贴壁后, 0%胎牛血清RPMI-1640培养液饥饿10 h, 对照组用10% FBS RPMI-1640培养, 36 ℃, 5% CO₂培养箱中培养50 h.

  3.3   MTT法测定药理活性及细胞毒性

  A549, A431, H1975, HCT-116, Aspc-1, Ramos, HBE和LO-2八种细胞培养后, 加入100 μL MTT溶液, 4 h后终止培养, 每孔加入100 μL三联液, 在摇床上轻微振荡, 使结晶全部溶解.用酶联检测仪测定各孔吸光度值, 选择570 nm波长, 以RPMI-1640培养液空白凋零, 测各孔的吸光度值.细胞生长抑制率(%)＝(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100%. GraphPad软件中的GraphPad prism针对抑制浓度作图, 由log[抑制率]相对于反应, 可变斜率模型估算出IC₅₀值.

  3.4   水溶性实验

  用紫外分光光度法测定薯蓣皂苷元及薯蓣皂苷元衍生物在水中的溶解度^{[33, 34]}, 用甲醇配制薯蓣皂苷元及衍生物0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 mg•mL^-1的浓度梯度制备标准曲线.分别称取3 mg薯蓣皂苷元、薯蓣皂苷元中间体及衍生物溶于5 mL蒸馏水中, 室温超声15 min, 过滤待测.在紫外可见分光光度计上于271 nm处测定.

  3.5   化合物1~3的合成

  化合物1~3按照文献[22]制备, 且表征数据与文献一致.

  (25R)-3α-甲磺酰酯基螺甾烷-5-烯(1):产率96%. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 5.42 (d, J＝5.1 Hz, 1H, 6-H), 4.51~4.45 (m, 1H, 3-H), 4.40 (q, J＝7.4 Hz, 1H, 16-H), 3.46 (dd, J＝3.1, 3.3 Hz, 1H, 26α-H), 3.36 (t, J＝10.9 Hz, 1H, 26β-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 138.81, 123.65, 109.40, 82.02, 80.87, 66.96, 62.16, 56.48, 49.95, 41.72, 40.37, 39.77, 39.25, 38.89, 36.98, 36.64, 32.13, 31.93, 31.50, 31.45, 30.40, 29.07, 28.91, 20.93, 19.34, 17.26, 16.39, 14.64; HRMS (ESI) calcd for C₂₈H₄₅O₅S [M+H]⁺ 493.2988, found 493.2999.

  (25R)-3α-叠氮基基螺甾烷-5-烯(2):产率97%. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 5.39 (d, J＝4.8 Hz, 1H, 6-H), 4.40 (q, J＝7.4 Hz, 1H, 16-H), 3.84~3.86 (m, 1H, 3-H), 3.46 (dd, J＝2.8, 3.1 Hz, 1H, 26α-H), 3.36 (t, J＝10.9 Hz, 1H, 26β-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 138.25, 123.01, 109.40, 80.94, 66.97, 62.20, 58.30, 56.60, 49.96, 41.75, 40.37, 39.87, 37.35, 36.18, 33.73, 32.10, 31.95, 31.53, 31.45, 30.45, 28.96, 26.23, 20.65, 19.16, 17.29, 16.43, 14.67; HRMS (ESI) calcd for C₂₇H₄₂N₃O₂ [M+H]⁺ 440.3277, found 440.3278.

  (25R)-3α-氨基螺甾烷-5-烯(3):产率45%. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 5.38 (d, J＝5.2 Hz, 1H, 6-H), 4.41 (q, J＝7.45 Hz, 1H, 16-H), 3.46 (dd, J＝3.1, 3.6 Hz, 1H, 26α-H), 3.36 (t, J＝10.8 Hz, 1H, 26β-H), 3.20 (brs, 1H, 3-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 138.92, 123.36, 109.42, 80.97, 66.97, 62.23, 56.65, 50.46, 47.07, 41.75, 40.38, 39.92, 39.87, 37.69, 33.16, 32.27, 31.97, 31.53, 30.44, 29.84, 29.35, 28.95, 20.71, 19.01, 17.28, 16.42, 14.67; HRMS (ESI) calcd for C₂₇H₄₄NO₂ [M+H]⁺ 414.3372, found 414.3366.

  3.6   (25R)-3α-氯乙酰胺基螺甾烷-5-烯(4)的合成

  氮气保护下, 将化合物3 (1.95 g, 4.7 mmol)溶于CH₂Cl₂ (60 mL)中, 0 ℃下加入三乙胺(2.6 mL, 18.7 mmol), 滴加氯乙酰氯(0.7 mL, 9.3 mmol), 滴毕在0 ℃下继续4.5 h.停止反应加水(60 mL×3)洗涤, 无水硫酸钠干燥, 减压浓缩.柱色谱分离得化合物4^[32] (1.20 g, 52%). m.p. 183~187 ℃; [α]_D²⁷ -123.8 (c 0.002, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 6.72 (brs, 1H, N-H), 5.44 (d, J＝5.1 Hz, 1H, 6-H), 4.40 (q, J＝7.5 Hz, 1H, 16-H), 4.12 (q, J＝2.9 Hz, 1H, 3-H), 4.00 (d, J＝4.8 Hz, 2H, CH₂-H), 3.46 (dd, J＝2.8, 3.1 Hz, 1H, 26α-H), 3.36 (t, J＝10.9 Hz, 1H, 26β-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 164.71, 138.36, 123.89, 109.31, 80.74, 66.82, 62.06, 56.34, 50.58, 46.01, 42.88, 41.59, 40.20, 39.65, 37.51, 36.94, 34.29, 32.07, 31.79, 31.36, 31.33, 30.26, 28.77, 25.98, 20.55, 18.85, 17.10, 16.23, 16.23 14.49; IR (KBr) ν: 3286, 2955, 1683, 1651, 1538, 1059, 903 cm^-1; HRMS (ESI) calcd for C₂₉H₄₅ClNO₃ [M+H]⁺490.3088, found 490.3160.

  3.7   化合物5的合成

  3.7.1   5a, 5d, 5e, 5i的合成

  称取中间体4 (0.15 g, 0.31 mmol)和哌嗪(0.13 g, 1.5 mmol)溶于丙酮(8 mL)中, 在60 ℃下回流反应6 h.停止反应, 减压蒸去溶剂, 加10 mL H₂O析出固体, 抽滤、烘干滤饼, 重结晶得产物5a.

  (25R)-3α-哌嗪乙酰胺基螺甾烷-5-烯(5a):白色固体, 收率91%. m.p. 174~177℃; [α]_D²⁷ -103.5 (c 0.002, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 7.44 (brs, 1H, N-H), 5.38 (d, J＝5.0 Hz, 1H, 6-H), 4.41 (q, J＝7.54 Hz, 1H, 16-H), 4.12 (s, 1H, 3-H), 3.46 (d, J＝10.2 Hz, 1H, 26α-H), 3.37 (t, J＝10.9 Hz, 1H, 26β-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 168.80, 139.26, 123.05, 109.25, 80.70, 77.19, 62.05, 61.97, 56.55, 54.18, 51.07, 46.14, 44.94, 41.58, 40.21, 39.68, 37.58, 37.26, 34.68, 32.37, 31.79, 31.38, 31.36, 30.26, 28.77, 20.54, 18.93, 17.11, 16.26, 14.51, 0.98; IR (KBr) ν: 3350, 2948, 2870, 1683, 1521, 1461, 1058 cm^-1; HRMS (ESI) calcd for C₃₃H₅₄N₃O₃ [M+H]⁺ 540.4165, found 540.4167.

  同法制备5d, 5e和5i.

  (25R)-3α-二乙醇胺乙酰胺基螺甾烷-5-烯(5d):白色固体, 收率67%. m.p. 234~236 ℃; [α]_D²⁷-117.5 (c 0.002, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 7.33 (brs, 1H, N-H), 5.39 (d, J＝7.6 Hz, 1H, 6-H), 4.40 (q, J＝7.2 Hz, 1H, 16-H), 4.17 (s, 1H, 3-H), 3.63 (t, J＝4.7 Hz, 4H, OHCH₂-H), 3.47 (d, J＝10.8 Hz, 1H, 26α-H), 3.37 (t, J＝10.9 Hz, 1H, 26β-H), 3.20~3.40 (m, 2H, CH₂-H), 2.74 (t, J＝4.7 Hz, 4H, NCH₂-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 165.73, 137.96, 137.75, 130.60, 124.31, 119.50, 109.20, 80.70, 77.19, 66.79, 62.01, 56.20, 50.57, 50.24, 45.60, 41.57, 40.14, 39.53, 37.43, 37.04, 34.56, 31.85, 31.32, 30.25, 28.77, 25.96, 20.47, 18.74, 17.10, 16.20, 14.51; IR (KBr) ν: 3435, 3349, 2953, 1659, 1526, 1053, 984 cm^-1; HRMS (ESI) calcd for C₃₃H₅₅N₂O₅ [M+H]⁺ 559.4111, found 559.4106.

  (25R)-3α-羟乙基哌嗪乙酰胺基螺甾烷-5-烯(5e):白色固体, 收率66%. m.p. 202~204 ℃; [α]_D²⁷ -98.5 (c 0.002, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 7.47 (brs, 1H, N-H), 5.38 (s, 1H, 6-H), 4.45~4.37 (m, 1H, 16-H), 4.18~4.06 (m, 1H, 3-H), 3.62 (d, J＝4.7 Hz, 2H, CH₂-H), 3.46 (d, J＝10.3 Hz, 1H, 26α-H), 3.36 (t, J＝11.0 Hz, 1H, 26β-H), 3.04~2.91 (m, 2H, HOCH₂-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 168.88, 139.30, 122.98, 109.30, 80.68, 77.21, 66.82, 62.03, 61.17, 59.39, 57.74, 56.81, 53.35, 53.27, 51.06, 44.85, 41.56, 40.23, 39.80, 37.51, 37.28, 37.28, 34.63, 32.40, 31.76, 31.33, 31.29, 30.23, 28.73, 26.28, 20.53, 18.93, 17.10, 16.26, 14.48, 0.97; IR (KBr) ν: 3367, 2957, 1672, 1526, 1058, 985 cm^-1; HRMS (ESI) calcd for C₃₅H₅₈N₃O₄ [M+H]⁺ 584.4427, found 584.4421.

  (25R)-3α-N-甲基哌嗪乙酰胺基螺甾烷-5-烯(5i):收率68%. m.p. 173~177 ℃; [α]_D²⁷ -121 (c 0.002, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 7.50 (brs, 1H, N-H), 5.38 (s, 1H, 6-H), 4.42 (d, J＝7.0 Hz, 1H, 16-H), 4.13 (s, 1H, 3-H), 3.47 (d, J＝10.5 Hz, 1H, 26α-H), 3.37 (t, J＝10.9 Hz, 1H, 26β-H), 2.98 (s, 2H, N-CH₂-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 168.90, 139.26, 128.03, 109.28, 80.70, 77.20, 66.82, 62.04, 61.15, 56.81, 55.56, 53.17, 51.04, 46.07, 44.79, 41.56, 40.23, 39.81, 37.48, 37.31, 34.63, 32.37, 31.77, 31.34, 31.30, 30.24, 28.74, 26.33, 20.55, 18.95, 17.10, 16.27, 14.48, 0.98; IR (KBr) ν: 3357, 2950, 1687, 1513, 1462, 1053 cm^-1; HRMS (ESI) calcd for C₃₄H₅₆N₃O₃ [M+H]⁺ 554.4322, found 554.4327.

  3.7.2   (25R)-3α-咪唑乙酰胺基螺甾烷-5-烯(5b)的合成

  将中间体4 (0.13 g, 0.26 mmol)、咪唑(0.18 g, 2.6 mol)和CH₂Cl₂ (10 mL)加入圆底烧瓶中, 加入三乙胺(0.22 mL, 1.6 mmol)在60 ℃下回流反应, 用薄层色谱(TLC)跟踪反应.用水洗涤、干燥、过滤得0.12 g米白色固体5b, 产率86%. m.p. 179~180 ℃; [α]_D²⁷-106.5 (c 0.002, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 7.50 (s, 1H, 咪唑-H), 7.14 (s, 1H, 咪唑-H), 6.91 (s, 1H, 咪唑-H), 5.41 (d, J＝7.6 Hz, 1H, 6-H), 5.17 (brs, 1H, N-H), 4.61 (s, 2H, CH₂-H), 4.41 (q, J＝7.4 Hz, 1H, 16-H), 4.07 (s, 1H, 3-H), 3.46 (d, J＝7.2 Hz, 1H, 26α-H), 3.36 (t, J＝10.9 Hz, 1H, 26β-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 165.73, 137.92, 137.75, 130.60, 124.31, 119.50, 109.20, 80.70, 66.79, 62.01, 56.20, 50.57, 50.24, 45.60, 41.57, 40.14, 39.53, 37.43, 37.04, 34.56, 31.94, 31.76, 31.36, 31.27, 30.25, 28.77, 25.96, 20.47, 18.74, 17.10, 16.20, 14.51; IR (KBr) ν: 3408, 2968, 1685, 1082, 806 cm^-1; HRMS (ESI) calcd for C₃₂H₄₈N₃O₃ [M+H]⁺ 522.3696, found 522.3699.

  3.7.3   (25R)-3α-哌啶乙酰胺基螺甾烷-5-烯(5c)的合成

  依次将中间体4 (0.09 g, 0.18 mmol)、CH₂Cl₂ (3 mL)和哌啶(0.2 mL, 1.9 mmol)加入圆底烧瓶中室温反应, 反应结束后, 减压蒸去溶剂, 加水析出固体, 抽滤, 滤饼用水洗涤三次, 烘干, 得0.08 g化合物5c, 产率81%. m.p. 128~132 ℃; [α]_D²⁷ -112 (c 0.002, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 7.95 (brs, 1H, N-H), 5.39 (d, J＝7.5 Hz, 1H, 6-H), 4.42 (q, J＝7.4 Hz, 1H, 16-H), 4.11 (s, 1H, 3-H), 3.46 (d, J＝7.7 Hz, 1H, 26α-H), 3.35 (t, J＝13.4 Hz, 1H, 26β-H), 2.89 (s, 2H, CH₂-H), 2.39 (d, J＝26.8 Hz, 4H, 哌啶-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 139.14, 123.03, 109.27, 80.72, 77.19, 66.81, 62.18, 62.04, 56.67, 54.86, 50.89, 44.91, 44.56, 41.56, 40.21, 39.75, 37.50, 37.21, 34.60, 32.33, 31.78, 30.26, 28.76, 26.41, 26.18, 23.74, 20.54, 18.95, 17.10, 16.27, 14.50, 0.98; IR (KBr) ν: 3553, 3355, 2941, 1677, 1522, 1054 cm^-1; HRMS (ESI) calcd for C₃₄H₅₅N₂O₃ [M+H]⁺ 539.4213, found 539.4206.

  3.7.3   (25R)-3α-吗啉乙酰胺基螺甾烷-5-烯(5f)和(25R)-3α-二乙胺乙酰胺基螺甾烷-5-烯(5h)的合成

  将中间体4 (0.31 g, 0.63 mmol)溶于吗啉(10 mL)中, 室温搅拌10 h后停止反应.反应液中加入水有固体析出, 抽滤、滤饼用水洗涤(5 mL×3)、烘干、重结晶得0.30g化合物5f, 产率88%. m.p. 218~220 ℃; [α]_D²⁷ -120 (c 0.002, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 7.48 (brs, 1H, N-H), 5.39 (d, J＝1.2 Hz, 1H, 6-H), 4.43 (q, J＝7.5 Hz, 1H, 16-H), 4.14 (s, 1H, 3-H), 3.69 (s, 4H, 吗啉环-H), 3.48 (d, J＝9.0 Hz, 1H, 26α-H), 3.38 (t, J＝10.8 Hz, 1H, 26β-H), 2.97 (d, J＝3.9 Hz, 2H, CH₂-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 139.27, 13.06, 109.23, 80.68, 77.21, 67.18, 66.80, 62.05, 61.60, 56.57, 53.63, 51.09, 45.01, 41.58, 40.21, 39.68, 37.56, 37.26, 34.66, 32.34, 31.78, 31.36, 30.25, 28.77, 26.19, 20.54, 18.94, 17.11, 16.26, 14.51; IR (KBr) ν: 3354, 2955, 2894, 1687, 1515, 1119, 1049, 905 cm^-1; HRMS (ESI) calcd for C₃₃H₅₃N₂O₄ [M+H]⁺ 541.4005, found 541.4007.

  同法制备5h.米白色固体, 收率58%. m.p. 173~177 ℃; [α]_D²⁷-121 (c 0.002, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 7.69 (brs, 1H, N-H), 5.37 (d, J＝5.2 Hz, 1H, 6-H), 4.41 (q, J＝7.4 Hz, 1H, 16-H), 4.12 (s, 1H, 3-H), 3.46 (d, J＝10.7 Hz, 1H, 26α-H), 3.37 (t, J＝10.9 Hz, 1H, 26β-H), 2.98 (s, 2H, N-CH₂-H), 2.54 (dd, J＝9.0, 11.4 Hz, 4H, N-CH₂-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 110.0, 109.27, 80.76, 77.18, 66.82, 62.83, 62.06, 41.58, 40.21, 39.71, 38.79, 37.47, 32.18, 31.80, 31.35, 30.27, 28.77, 26.21, 20.55, 18.98, 17.11, 16.26, 14.51, 0.99, 0.05; IR (KBr) ν: 3374, 2943, 1686, 1514, 1061, 905, 803 cm^-1; HRMS (ESI) calcd for C₃₃H₅₅N₂O₃ [M+H]⁺ 527.4213, found 527.4224.

  3.7.4   (25R)-3α-四氢吡咯乙酰胺基螺甾烷-5-烯(5g)的合成

  依次将中间体4 (0.13 g, 0.26 mmol)、CH₂Cl₂ (7 mL)、四氢吡咯(0.25 mL, 3.0 mmol)和三乙胺(0.20 mL, 1.5 mmol)加入圆底烧瓶中室温反应, TLC跟踪反应直至反应完全.减压蒸去溶剂, 加水析出固体, 抽滤、滤饼用水洗涤(5 mL×3)、烘干、重结晶得0.10 g化合物5g, 产率77%, m.p. 164~167 ℃; [α]_D²⁷ -101 (c 0.002, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 7.45 (brs, 1H, N-H), 5.37 (d, J＝5.2 Hz, 1H, 6-H), 4.41 (q, J＝7.5 Hz, 1H, 16-H), 4.12 (t, J＝7.1 Hz, 3H, 3-H, CH₂-H), 3.46 (dd, J＝4.3, 4.4 Hz, 1H, 26α-H), 3.37 (t, J＝10.9 Hz, 1H, 26β-H), 3.13 (q, J＝16.2 Hz, 2H, N-CH₂-H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 138.98, 123.13, 109.26, 80.73, 77.19, 66.81, 62.05, 58.35, 56.55, 54.12, 50.79, 45.20, 41.57, 40.21, 39.70, 37.48, 37.22, 34.53, 32.30, 31.79, 31.34, 30.26, 28.76, 26.22, 23.97, 20.54, 18.99, 17.11, 16.26, 14.50, 0.99; IR (KBr) ν: 3356, 2949, 2868, 2795, 1688, 1515, 1057, 903, 804 cm^-1; HRMS (ESI) calcd for C₃₃H₅₂N₂O₃ [M+H]⁺ 525.4056, found 525.4049.

  辅助材料(Supporting Information) 中间体4和目标化合物5a~5i的¹H NMR, ¹³C NMR, IR, HRMS (ESI)谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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  图 1  薯蓣皂苷元的结构

  Figure 1  Structure of cyclovirobuxine

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  图式 1  目标化合物5的合成

  Scheme 1  Synthesis of compounds 5

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  图 2  化合物5e(红色)、Gefitinib(绿色)与EGFR的对接模型

  Figure 2  Docking model of compound 5e(red) and Gefitinib (green) with EGFR

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  表 1  薯蓣皂苷元衍生物的抗肿瘤活性及细胞毒性[IC₅₀/(μmol•L^-1)]

  Table 1.  Antitumor activity and cytotoxicity [IC₅₀/(μmol•L^-1)] of diosgenin derivatives

  Compound	Antitumor activity							Cytotoxicity
  	A549	A431	H1975	HCT-116	Aspc-1	Ramos		HBE	LO-2
  5a	5.13	4.12	6.66	5.83	7.73	10.97		5.72	5.62
  5b	2.24	8.87	22.57	8.57	18.71	＞40		10.91	11.95
  5c	28.21	8.77	57.88	10.49	15.06	29.60		51.85	11.86
  5d	5.00	8.24	41.56	11.15	23.53	＞40		13.50	20.73
  5e	3.36	2.47	8.16	6.03	6.73	12.01		63.07	4.15
  5f	12.05	33.72	74.03	31.58	29.66	＞40		85.49	＞40
  5g	23.50	19.44	46.97	18.13	29.57	＞40		55.74	22.63
  5h	4.50	18.77	41.83	5.60	29.06	＞40		＞80	26.18
  5i	12.22	6.82	17.10	9.17	13.55	19.87		55.38	8.74
  4	2.89	3.19	＜5	9.34	13.37	3.56		22.91	4.25
  阿霉素	0.78	＜2.5	＜5	＞1.2.5	＜5	＜2.5		＜5	7.88
  薯蓣皂苷元	71.23	4.74	50.59	31.41	63.11	＞40		45.56	＞40

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  表 2  薯蓣皂苷元及薯蓣皂苷元衍生物的水溶性

  Table 2.  Water-solublity of diosgenin and diosgenin derivatives

  Compound	Solublity/(mg•mL-1)
  薯蓣皂苷元	0.247
  中间体4	0.387
  5a	0.545
  5b	0.315
  5c	0.431
  5d	0.570
  5e	0.620
  5f	0.382
  5g	0.398
  5h	0.361
  5i	0.422

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