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  视网膜新生血管是导致许多眼致盲性疾病(如早产儿视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等)的主要因素.其造成的渗出、出血和增生等病理改变, 对眼部结构和功能的损害是引起视力障碍的重要原因^[1].目前对其发生机制的研究表明:缺氧是诱导一些生长因子、整合素、蛋白酶表达上调的初始因素, 进而促进血管内皮细胞的增殖和迁移.具体表现为:视网膜色素上皮细胞能够表达血管内皮生长因子(VEGF)和基质细胞衍生因子定向趋化骨髓来源细胞, 并参与眼新生血管的发生发展^{[1, 2]}, 而在高糖和缺氧刺激下这种作用更为明显^[3].因此, 通过抗血管化作用, 有望实现对该类疾病的治疗.

  首先以商业化的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA-COOH)和氨基聚乙二醇羧基(NH₂-PEG-COOH)为原料, 以生物型分子1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为媒介, 以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂, 通过简单、绿色的羧基和胺基的偶联反应, 制备了PLGA-PEG共聚物, 合成路线如图 1所示.以制备的PLGA-PEG共聚物为载体, 进而包裹PEDF得到了PLGA-PEG/PEDF乳剂, 并进一步考察了该乳剂作为抑制VEGF的潜能.研究表明, 所开发的PLGA-PEG/PEDF能够作为一种良好的新生血管生成抑制剂, 对于某些通过抗血管化生成治疗的疾病具有良好的应用前景. PLGA-PEG/PEDF乳剂及其与细胞相互作用如图 2所示.

  色素上皮衍生因子(PEDF)被证明是眼内一种重要的新生血管生成抑制因子. PEDF的抗新生血管生成作用、抗氧化作用及抗血管通透性作用已有很多研究^{[4, 5]}, 近年来其用于抑制炎症作用的报道也越来越多^{[6, 7]}.例如, Gao等^[7]证明了PEDF作为血管抑制剂参与了眼后新生血管形成的调节.而Stellmach等认为, PEDF可能是通过促进活化的血管内皮细胞凋亡, 使血管内皮细胞对缺氧诱发的新生血管的信号不起反应.

  近年来, 聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)已成为一种极具潜力的给药载体, 其药物包封率高、可修饰性强、生物安全性好, 对药物可起到很好的保护作用.但PLGA表面疏水性强, 入血易被网状内皮系统(RES)清除, 很难有效送达靶部位.另一方面, 聚乙二醇(PEG)亲水性强、生物安全性好、抗原性和免疫原性.通过PLGA和PEG反应合成PLGA-PEG共聚物, 可以有效地将两者结合起来, 延缓RES的清除, 延长循环时间, 具有极好的发展前景^[8].目前PLGA-PEG共聚物的制备方法主要包括开环聚合法和缩合共聚法.这两种方法均以乳酸或丙交酯为原料, 通过多步反应得到目标产物.其中需要用到二氯甲烷、氯仿等有机溶剂, 反应后需要深度的干燥才能除去有机溶剂.这难以适用于生物领域的应用.

  

  图1 PLGA-PEG分子的合成示意图

  Figure 1. Preparation of PLGA-PEG molecule

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  图2 PLGA-PEG/PEDF乳剂及其与细胞相互作用示意图

  Figure 2. Schematic illustration of PLGA-PEG/PEDF emulsion preparation and its interaction with HUVEC cell

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  1    结果与讨论

  1.1    PLGA-PEG共聚物及PLGA-PEG/PEDF乳剂的制备

  以PLGA-PEG为原料制备PLGA-PEG/PEDF乳剂后.对乳剂进行了粒径、zeta电位和TEM表征.如图 4所示, 当乳剂中无PEDF时, PLGA-PEG乳剂的水合平均粒径为218 nm, zeta电位为-30.5 mV.加载PEDF后, 纳米乳剂的平均粒径为254 nm, zeta电位为-12.3 mV.结果表明, PEDF成功地加入到PLGA-PEG聚合物中.此外, 在插入的透射电子显微镜图显示PLGA-PEG/ PEDF乳剂为球形纳米结构, 外层的黑色为PLGA-PEG壳, 内部灰色的为PEDF核.得到纳米乳剂分散性好, 无明显团聚, 平均粒径大约在250 nm左右.高速离心法得到PEDF的包封率为74.6%.

  

  图4 PLGA-PEG和PLGA-PEG/PEDF乳剂的粒径分布图

  Figure 4. Size distribution of PLGA-PEG emulsion and PLGA-PEG/PEDF emulsion

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  图3 PLGA-PEG的结构式和核磁氢谱

  Figure 3. Chemical formula and ¹H NMR of PLGA-PEG

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  PLGA-PEG由PLGA-COOH和NH₂-PEG-COOH分子反应合成产物采用核磁共振氢谱表征PLGA-PEG的结构.如图 3所示, PLGA-COOH分子中的H_a化学位移δ5.2, H_b化学位移δ4.8, NH₂-PEG-COOH分子中的H_d化学位移δ3.6, H_c化学位移δ 1.6, 谱线中同时出现了4个峰, 说明PLGA-PEG被成功地合成.另外, 根据文献[9]报道, PEG的接枝率可以通过以下方式计算: PLGA分子中单体的分子量为130, 本实验中所用PLGA聚合物分子量为20000, 所以每个PLGA聚合物分子中含有约154个单体, 而每个单体中有两个H_b原子.同样的, 就可以计算出一个PEG分子链由有77个单体组成, 而每个单体中有四个H_d原子.因此, 单个PLGA聚合物分子中H_b原子的数量等于单个PEG分子中H_d原子的数量.如果PLGA与PEG完全反应, 那么在核磁氢谱上H_b与H_d的峰面积应该是一样的.但由于存在未反应的PEG, 且已经通过透析将其除去, 所以H_d的峰面积与H_b的峰面积比就是PEG在PLGA上的接枝率, 即3.52/ 4.18≈84%.因此, 本实验中反应的接枝率约为84%, 其与文献[9]报道类似.

  1.2    PLGA-PEG/PEDF乳剂与细胞的相互作用

  进一步地, 观察了PLGA-PEG/PEDF乳剂对HUVEC细胞体外生长的抑制情况.如图 6所示, 随着PLGA-PEG/PEDF乳剂浓度和纯PEDF浓度的增加, HUVEC细胞的活性均降低, PLGA-PEG/PEDF乳剂实验组的细胞活性降低的更为明显.此结果表明, PLGA-PEG/PEDF乳剂具有比纯PEDF具有更显著的抑制效率.此外, 由图 6可以得出, 在PLGA-PEG/PEDF乳剂实验组中, IC₅₀值是16.9 μg/mL; 纯PEDF实验组中, IC₅₀值是18.3 μg/mL.此结果也显示, PLGA-PEG/ PEDF乳剂增加了对HUVEC细胞的体外生长的抑制作用.

  首先, 用CCK-8法检测评价PLGA-PEG/PEDF乳剂的细胞毒性.如图 5所示, 研究了不同浓度的PLGA-PEG/PEDF乳剂(0~25 μg/mL)与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞共培养12和24 h后的细胞活性.由图 5a可见, 随着PLGA-PEG/PEDF乳剂浓度的增加和培养时间的延长, HUVEC细胞活性明显降低.相比于对照组, 培养12和24 h后, 随着PLGA-PEG/PEDF乳剂浓度的递增, 细胞存活率有显著的差异.当PLGA-PEG/ PEDF乳剂浓度达到25 μg/mL的高剂量时, 细胞存活率分别维持在67.3%和65.1%.这可能是由于其原因PLGA-PEG/PEDF乳剂中释放出来的PEDF对HUVEC细胞中VEGF基因表达有抑制作用.为进一步证明细胞活性提高的原因, 检测了PLGA-PEG乳剂的细胞毒性.如图 5b所示, 在乳剂浓度提高的过程中, 相比于正常培养基培养的细胞, 除了在25 μg/mL浓度下共孵育24 h的实验组有轻微的下降外, 其他组细胞活性无明显变化.

  

  图6 PLGA-PEG/PEDF乳剂和PEDF对HUVEC细胞的抑制效果

  Figure 6. Inhibitory effects of PLGA-PEG/PEDF emulsion and free PEDF on HUVEC cells as examined by CCK-8 assay

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  图5 (a) PLGA-PEG/PEDF乳剂和(b) PLGA-PEG乳剂对HU-VEC细胞的细胞毒性

  Figure 5. In vitro HUVEC cell cytotoxicity of (a) PLGA-PEG/PEDF emulsion and (b) PLGA-PEG emulsion (concen-tration was calculated by PLGA-PEG)

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  1.3    PLGA-PEG/PEDF乳剂对VEGF的抑制

  

  图7 ELISA法检测不同条件下HUVEC细胞中VEGF的表达情况

  Figure 7. The VEGF levels in the HUVEC cell culture medium by ELISA with the different condition

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  在以前的报道中, 缺氧是一种应激因素, 不仅影响肿瘤相关因子的转录表达, 而且为新血管的生成提供了途径^[11].此外, PEDF可以更好地在缺氧条件下调节VEGF的表达^[12].因此, 我们进一步观察了在25 μg/mL PLGA-PEG/PEDF乳剂在不同氧气浓度下调节VEGF水平的能力.如图 8a所示, 当氧气浓度降低时, 对照组的VEGF水平不断升高, 氧气浓度从正常氧浓度降低到1%氧浓度时, VEGF浓度从220 pg/mL提高到385 pg/ mL.此结果表明, 缺氧可以激活HUVEC细胞中的VEGF水平.但是, 当PLGA-PEG/PEDF加入后, 降低了VEGF表达.抑制率从正常氧浓度的26.4%提高到1%氧浓度的30.1%.此外, 随着缺氧时间的增加, HUVEC细胞中VEGF的表达和被抑制也逐渐增大(图 8b).这些结果表明, 获得的PLGA-PEG/PEDF乳剂在缺氧条件下可以更加有效抑制VEGF的表达.

  为了说明PLGA-PEG/PEDF乳剂处理过程中, HUVEC细胞活性降低的原因, 进行ELISA分析检测细胞VEGF的水平.如图 7所示, 评估了在不同培养时间和PLGA-PEG/PEDF乳剂浓度的条件下VEGF的水平.无PLGA-PEG/PEDF乳剂时, VEGF含量约为220 pg/mL, 这是以往的报道一致^[10].但如图 7a所示, 随PLGA-PEG/PEDF乳剂浓度的增加, HUVEC细胞的VEGF水平逐渐下降. 25 μg/mL PLGA-PEG/PEDF培养24 h后, 其VEGF含量为174 pg/mL.结果表明, PLGA-PEG/PEDF乳剂中释放的PEDF可以抑制VEGF的表达, 减少细胞增殖.此外, 我们检查了不同培养时间下的VEGF水平.如图 7b所示, 随着培养时间的增加, HUV-EC细胞中VEGF水平也逐渐减小.在25 μg/mL PLGA-PEG/PEDF乳剂条件下培养48 h, 其VEGF的含量约为153 pg/mL.这些结果表明, 获得的PLGA-PEG/PEDF乳剂可以抑制VEGF, 从而控制血管化.

  

  图8 ELISA法检测不同条件下HUVEC细胞中VEGF的表达情况

  Figure 8. The VEGF levels in the HUVEC cell culture medium at the concentration of 25 μg/mL PLGA-PEG/PEDF by ELISA

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  2    结论

  以PEG和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)成功制备了PLGA-PEG材料, 其反应的接枝率约为84%.以该PLGA-PEG材料为载体通过包裹PEDF, 得到了PLGA-PEG/PEDF乳剂, 其粒径约为218 nm, 对PEDF的包封率为74.6%.通过PLGA-PEG/PEDF乳剂与HUVEC共培养发现, 该乳剂能明显降低细胞存活率, 其原因在于PLGA-PEG/PEDF乳剂中释放的PEDF能有效抑制细胞中VEGF的生成, 从而降低细胞活性.考察了不同氧浓度下, 乳剂对VEGF的抑制作用.结果发现, 乳剂在缺氧条件下可以更加有效抑制VEGF的表达.体内分布实验表明, PLGA-PEG/PEDF乳剂能有效到达眼部等部位.因此, PLGA-PEG/PEDF能够作为一种良好的新生血管生成抑制剂, 对于某些通过抗血管化生成治疗的眼部疾病具有良好的应用前景.

  3    实验部分

  3.1    PLGA-PEG的合成

  PLGA-PEG的合成方法简述如下^[13]:利用PLGA-COOH的羧基与NH₂-PEG-COOH的氨基进行反应合成PLGA-PEG.将200 mg PLGA-COOH、1.8 mg NHS、2.9 mg EDC、1 mg DMAP加入10 mL二氯甲烷(CH₂Cl₂)中室温反应24 h时.然后加入34 mg NH₂-PEG-COOH和8.6 L三乙胺继续反应8 h.待反应结束后, 用旋转蒸发仪减压除掉CH₂Cl₂后, 加5 mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解.把溶液用截留分子量为14000的透析袋透析除掉小分子杂质和未反应掉的PEG, 冷冻干燥得到目标产物备用.

  3.2    PLGA-FITC的合成与提纯

  把300 mg PLGA-COOH、1.8 mg NHS、2.9 mg EDC、1 mg DMAP加入10 mL CH₂Cl₂中室温反应24 h.然后加入1.8 mg乙二胺和8.6 L三乙胺继续反应3 h.待反应结束后, 再往溶液中加入35 mg异硫氰酸荧光素(FITC)继续反应8 h.用旋转蒸发仪减压除掉CH₂Cl₂, 加5 mL DMF溶解.把溶液用截留分子量14000的透析袋透析除掉小分子杂质, 冷冻干燥得到目标产物.

  产物采用凝胶柱进行提纯^[14], 在凝胶柱中加入一定量的PLGA-FITC乳剂, 待乳剂全部进入凝胶后, 缓慢向柱中加满纯水, 以纯水进行洗脱, 收集最先下来的浊液.

  3.3    PLGA-PEG/PEDF乳剂的制备

  PLGA-PEG/PEDF乳剂的制备方法^[15]简述如下:分别将10 mg PLGA-PEG溶解在200 μL二氯甲烷, 100 μg PEDF溶解在200 μL司盘80@二氯甲烷(司盘80溶解在二氯甲烷中, 司盘80的质量分数为15%)中.经过充分混合, 用匀浆机在冰浴条件下超声1 min.然后在冰浴条件下超声3 min (工作3 s、停止10 s).进一步地, 在冰浴条件下搅拌10 min (工作1 min, 停止1 min), 最后敞口搅拌2~3 h除去二氯甲烷.

  3.4    材料表征

  采用氢核磁表征PLGA-PEG, 以氘代氯仿(CDCl₃)为溶剂在仪器Bruker AM-400中检PLGA-PEG的氢核磁图谱.采用纳米激光粒度仪表征乳剂尺寸, 将合成的PLGA-PEG乳剂及PLGA-PEG/PEDF乳剂稀释5倍后, 分别置于Malvern Zetasizer Nano ZS仪器中检测其粒度及zeta电位.采用透射电子显微镜观察乳剂大小与形貌, 将合成的PLGA-PEG/PEDF乳剂稀释5倍后滴至铜网上, 在远红外灯下烘干, 置于JEOL-2100F透射电子显微镜中观察.

  3.5    包封率测定

  式中, EE、m_总、m_游分别代表包封率、系统中的包封与未包封的总药量、未包封的药量.其中, m_游通过测定上清液中的药量获得, m_总通过加乙腈溶解乳剂后测定获得.

  用高速离心法测定PEDF的包封率.具体如下:取PLGA-PEG/PEDF乳剂1 mL, 高速离心(HITACHI-CP100WX, 16000 r/min), 20 min后取上清液测定m_游.

  包封率的计算公式: EE (%)=(m_总-m_游)/m_总×100%

  3.6    细胞毒性

  用CCK-8法测定PLGA-PEG/PEDF乳剂的毒性作用.将HUVEC细胞接种密度为在96孔板中, 每孔分别有5000个细胞. 48 h后, 用100 μL含不同浓度的PLGA-PEG/PEDF乳剂代替培养基(对照组细胞用DMEM培养基单独培养).培养一定时间后(12和24 h), 弃上清液, 加入10 μL CCK-8溶液, 然后在37 ℃下孵育细胞.培养4 h后, 用酶标仪测定吸光度(IMark Bio-Rad, 美国), 以450 nm为测定波长.

  3.7    低氧下的细胞培养

  辅助材料(Supporting Information)  PLGA-PEG分子的¹H NMR谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  将HUVEC细胞接种密度为在96孔板中, 每孔分别有5000个细胞. 48 h后, 用100 μL含不同浓度的PLGA-PEG/PEDF乳剂代替培养基(对照组细胞用DMEM培养基单独培养).在1%或10% O₂浓度的三气培养箱中缺氧条件下, 培养一定时间后(0~48 h), 弃上清液, 加入10 μL CCK-8溶液, 然后在37 ℃下孵育细胞.培养4 h后, 用酶标仪测定吸光度(IMark Bio-Rad, 美国), 以450 nm为测定波长.

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  图 1  PLGA-PEG分子的合成示意图

  Figure 1  Preparation of PLGA-PEG molecule

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  图 2  PLGA-PEG/PEDF乳剂及其与细胞相互作用示意图

  Figure 2  Schematic illustration of PLGA-PEG/PEDF emulsion preparation and its interaction with HUVEC cell

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  图 3  PLGA-PEG的结构式和核磁氢谱

  Figure 3  Chemical formula and ¹H NMR of PLGA-PEG

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  图 4  PLGA-PEG和PLGA-PEG/PEDF乳剂的粒径分布图

  Figure 4  Size distribution of PLGA-PEG emulsion and PLGA-PEG/PEDF emulsion

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  图 5  (a) PLGA-PEG/PEDF乳剂和(b) PLGA-PEG乳剂对HU-VEC细胞的细胞毒性

  Figure 5  In vitro HUVEC cell cytotoxicity of (a) PLGA-PEG/PEDF emulsion and (b) PLGA-PEG emulsion (concen-tration was calculated by PLGA-PEG)

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  图 6  PLGA-PEG/PEDF乳剂和PEDF对HUVEC细胞的抑制效果

  Figure 6  Inhibitory effects of PLGA-PEG/PEDF emulsion and free PEDF on HUVEC cells as examined by CCK-8 assay

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  图 7  ELISA法检测不同条件下HUVEC细胞中VEGF的表达情况

  Figure 7  The VEGF levels in the HUVEC cell culture medium by ELISA with the different condition

  (a) Concentration of PLGA/PEDF emulsion at 24 h culture and (b) culture time at 25 μg/mL PLGA/PEDF emulsion

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  图 8  ELISA法检测不同条件下HUVEC细胞中VEGF的表达情况

  Figure 8  The VEGF levels in the HUVEC cell culture medium at the concentration of 25 μg/mL PLGA-PEG/PEDF by ELISA

  (a) Different oxygen concentration at 8 h hypoxia treatment time and (b) hypoxia treatment time at 1% oxygen concentration

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