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  本工作利用间二硝基苯醚作为识别位点, 结合分子内电荷转移(ICT)以及光诱导电子转移(PET)的信号报告机制, 设计合成了基于二芳基醚结构的传感探针分子8-(2, 4-二硝基苯酚基)芘甲醛(PCNP). PCNP以羟基芘甲醛作为发色团, 该发色团由简单且刚性的π共轭结构连接供电子基团羟基和吸电子基团醛基, 具有典型的ICT发光特性, 并且有着良好的光稳定性和较高的荧光量子产率^[22]; 探针分子中的2, 4-二硝基苯醚基团是强吸电子基团, 能够通过光致电子转移(PET)过程猝灭发色团的荧光, 二硝基苯醚基团在H₂S存在下发生硫解反应, PET过程被阻断, 发色团荧光恢复, 由此得到高倍数荧光增强的反应型H₂S荧光探针.

  硫化氢(H₂S)是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体, 会对环境造成污染; 但作为最简单的生物巯基化合物, H₂S是继一氧化碳(CO)、一氧化氮(NO)之后发现的又一种重要的内源性气体信号分子, 在神经系统、心血管系统中发挥着重要的生理调节作用^[1].生物体中内源性H₂S主要产生于半胱氨酸及其衍生物的酶催化反应过程中, 也可以通过非酶催化途径产生, 包括体内硫化物和多硫化物的代谢过程.内源性H₂S能够作为抗氧化剂清除体内的活性氧和活性氮物种, 同时也参与重要生理功能调节过程, 包括血管舒张、细胞凋亡、血管生成、神经传导、炎症反应、胰岛素分泌等^[2]. H₂S浓度失调则与多种疾病密切相关, 如肝硬化、阿尔茨海默症、帕金森症、肺动脉高压等^[3~5].因此, 识别和定量检测H₂S对于环境和生物医学研究具有重要的意义.

  H₂S具有良好的还原性和亲核性, 利用这些特殊的化学性质可以开发出反应型H₂S荧光探针, 反应型荧光探针具有良好选择性、抗干扰性及定量性, 近年来受到科研人员的广泛关注并得到了很大的发展^[6].反应型H₂S荧光探针的设计主要利用H₂S的亲核反应^[7~10]、还原反应^[11~14]和硫化铜沉淀反应^[15~17]等机制. 2, 4-二硝基苯醚基团(DNP)被广泛用于多肽合成时酪氨酸的保护, 在2-巯基乙醇的作用下会发生硫解反应脱保护^[18], 受到该过程的启发, 科研工作者们将DNP基团引入到不同的荧光团上, 开发了一系列基于间二硝基苯醚硫解反应的H₂S荧光探针^[19~21].

  1    结果与讨论

  1.1    PCNP探针分子的合成

  探针分子PCNP以8-羟基芘甲醛(1)和1-溴-2, 4-二硝基苯(2)为原料, 通过威廉姆森成醚反应制备得到, 合成路线如Eq. 1所示, 化合物PCNP结构通过了红外光谱、核磁共振氢谱和碳谱以及高分辨质谱的鉴定.

  1.2    PCNP对H₂S的光谱响应研究

  制备了PCNP (5×10^-6 mol•L⁻¹)在缓冲溶液(PBS, 10 mmol•L⁻¹, pH=7.4, 15 mmol•L⁻¹ CTAB)分散体系, 以NaHS作为H₂S的供体, 利用稳态光谱研究37 ℃条件下探针PCNP对H₂S的响应性质.向PCNP分散体系中加入NaHS (1×10^-4 mol•L⁻¹), 测定体系的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱(激发波长为409 nm)随时间的变化情况, 结果如图 1所示.加入H₂S后体系在291, 370和400 nm处的吸收峰逐渐减弱, 长波长区域出现新的吸收峰并逐渐增强, 最大峰在432和524 nm处, 溶液颜色由浅黄色变为红色.更为重要的是, PCNP体系的荧光信号在加入NaHS后迅速增强, 呈现出典型的“turn on”荧光响应, 荧光最大峰在503和604 nm处. 图 2b插入图是365 nm紫外灯照射下探针体系在加入NaHS前后的荧光照片, 在未加入NaHS时PCNP体系几乎看不到荧光, 而加入NaHS后PCNP体系发射橙色荧光.

  

  图2 PCNP (5×10^-6 mol•L⁻¹)探针体系在加入NaHS (1×10^-4 mol•L⁻¹)后604 nm处荧光强度随时间变化图(λ_ex=409 nm)

  Figure 2. Fluorescence intensity at 604 nm of the probe system (5×10^-6 mol•L⁻¹ PCNP) as a function of time after addition of NaHS (1×10^-4 mol•L⁻¹)

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  检测条件下产物的浓度很低, 可以认为其604 nm处的荧光强度与其浓度成正比, F_t和F₀分别为时间为t时及初始时604 nm处的实测荧光强度, 以系数a代表荧光强度与底物浓度的关系, 产物荧光强度增加与其浓度的关系为:

  利用式(4)对图 2中的数据进行拟合, 得到PCNP与H₂S反应的速率常数为0.20 min^-1.

  综合公式(1)~(3), 得到604 nm处荧光强度随时间变化的关系:

  

  图1 37 ℃下PCNP (5×10^-6 mol•L⁻¹)在PBS缓冲溶液分散体系中与NaHS (1×10^-4 mol•L⁻¹)作用不同时间后的紫外-可见吸收光谱图(a)和荧光光谱图(b)

  Figure 1. Time-dependent absorption spectra (a) and fluores-cence spectra (b) of PCNP (5×10^-6 mol•L⁻¹) in PBS buffer in λ_ex=409 nm. Inset shows the pictures of the probe solution under 365 nm UV lamp before and after addition of NaHS

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  荧光探针对检测物的响应速度是衡量探针性能的重要参数, 具有快速响应的探针有望应用于生物医学研究中动态实时传感和监测.以604 nm处的荧光强度对时间作图, 得到图 2所示的随时间变化荧光响应曲线.探针PCNP对H₂S响应迅速, 荧光强度在加入H₂S后快速增强, 约在10 min时达到最大值, 体系中反应达到平衡, 同时荧光强度增强了约260倍, 响应显著.根据荧光强度随时间变化数据可以通过曲线拟合计算体系中探针PCNP与H₂S的反应速率常数.在本实验条件下, H₂S的初始浓度(1×10^-4 mol•L^-1是PCNP分子的浓度(5×10^-6 mol•L⁻¹)的20倍, 近似认为在检测过程中H₂S的浓度不变, PCNP与H₂S的反应可看作是准一级反应过程, 其积分速率方程可表达为:

  化合物PCNP溶于常用有机溶剂, 不溶于水, 为了实现水相中对H₂S的稳定检测以及为今后在生物体系中的应用提供实验基础, 我们利用表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)将PCNP分散到磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH=7.4)中.首先测定了PCNP在缓冲溶液体系中的吸收和荧光发射光谱, PCNP呈现羟基芘甲醛的特征吸收, 最大吸收峰在291, 370和400 nm处. PCNP体系受光激发后几乎检测不到荧光, 这是由于发色团与强吸电子的二硝基苯基团发生了光致电子转移过程, 猝灭了PCNP中发色团的荧光.

  其中t为时间, [A]_t和[A]₀分别为时间为t时PCNP的浓度和PCNP的初始浓度, k为准一级速率常数. [A]₀和[A]_t的差即为PCNP与H₂S反应产物的浓度, 以[P]_t表示,

  1.3    探针PCNP对H₂S的检测限研究

  探针分子对目标物的检测灵敏度可以通过检测限来评价, 计算了PCNP对H₂S的检测限.在PCNP (5× 10-6 mol•L⁻¹)的缓冲溶液分散体系中, 加入不同浓度的NaHS (0~100 μmol•L⁻¹), 检测时间为10 min, 将体系在604 nm处的荧光强度与NaHS浓度作图, 得到如图 3所示工作曲线.在0~100 μmol•L⁻¹的范围内, 604 nm处的荧光强度与NaHS浓度呈线性关系.根据检测限(limit of detection, LOD)计算公式: LOD=3×S.D./K(其中置信参数设定为3, S.D.为未添加NaHS时探针分子荧光光谱变化的标准偏差, K为直线斜率), 计算得到在PCNP体系对H₂S的检测限为0.10 μmol•L^-1, 表明探针分子在水相中对H₂S具有很好的检测灵敏度.

  

  图3 PCNP (5×10^-6 mol•L⁻¹)探针体系604 nm处荧光强度随加入的NaHS浓度(0~100 μmol•L⁻¹)变化关系(λ_ex

  Figure 3. Change of fluorescence intensity at 604 nm of the PCNP sensing system (5×10^-6 mol•L⁻¹) as a function of the NaHS concentration (0~100 μmol•L⁻¹) (λ_ex=409 nm)

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  1.4    PCNP对H₂S识别选择性研究

  

  图4 PCNP (5×10^-6 mol•L⁻¹)探针体系分别加入不同化合物后在604 nm处的荧光强度, 以及在干扰化合物存在条件下加入NaHS后体系的荧光响应(λ_ex=409 nm)

  Figure 4. Fluorescence intensity at 604 nm of the PCNP probe system (5×10^-6 mol•L⁻¹) after addition of different chemicals and the fluorescence response toward NaHS in the presence of different chemicals

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  检测体系中往往含有多种化学物质并可能对目标物种的识别产生干扰, 探针体系对目标物种的识别选择性也是评价探针性能的重要指标.向PCNP (5×10^-6 mol•L⁻¹)的缓冲溶液分散体系中分别加入1×10 ^-4 mol•L⁻¹硫氢化钠, 生物巯基化合物(谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸), 有机酸或盐(柠檬酸、抗坏血酸、醋酸钠), 含硫无机盐(硫氰化钠、硫酸镁、硫酸氢钠、亚硫酸钠、过硫酸钠、焦亚硫酸钠、连二亚硫酸钠、硫代硫酸钠), 活性氧和活性氮物种(过氧化氢、次氯酸钠、硝酸钠、亚硝酸钠), 以及其他的无机盐(氟化钠、氯化钠、溴化钾、碘化钾、磷酸钠、碳酸钠, 碳酸氢钠), 3 min后测定这些体系604 nm处的荧光强度, 并与未加入干扰和检测物的空白样品比较.如图 4所示, 只有加入NaHS的体系呈现大幅度的荧光增强, 大多数有机、无机盐的加入对探针荧光强度没有明显影响; 谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸和还原性含硫化合物能使探针体系荧光略有增强, 但相比加入NaHS引起的荧光增强要小得多, 因此, 探针PCNP对H₂S的检测具有选择性.此外, 还在不同干扰化合物存在的条件下检测了探针体系对NaHS的荧光响应性质, 实验结果表明探针分子能够很好地对目标化合物进行识别.

  1.5    PCNP对H₂S的识别机理研究

  利用核磁共振氢谱和高分辨质谱对识别机理进行验证. PCNP与NaHS反应后芘环氢的化学位移明显地向高场移动, 这是由于化合物PCNP发生硫解反应后, 醚键断裂生成了电荷密度较大的氧阴离子, 增加了屏蔽作用.此外, 高分辨质谱对反应产物检测得到分子离子峰[M]-(m/z=245.0606)以及相应的同位素峰, 与羟基芘甲醛氧阴离子结构分子量一致.以上表征结果表明, 加入NaHS后, PCNP发生了硫解反应, 醚键断裂生成了羟基芘甲醛氧阴离子产物, 体系的光谱发生显著变化, 从而实现了对H₂S的传感识别.

  2    结论

  设计合成了以羟基芘甲醛为发色团、二硝基苯醚为识别位点的H₂S荧光探针PCNP, 以NaHS作为H₂S供体测试了PCNP在缓冲溶液分散体系中的荧光传感性能.体系中不含H₂S时, PCNP发生从发色团到二硝基苯基的分子内电子转移, 几乎不发射荧光; 加入H₂S后, PCNP发生硫解反应, 体系荧光迅速增强, 0.1 mmol•L⁻¹硫化氢存在下10 min体系荧光强度响应达到最大值, 荧光增强达260倍, 测定了PCNP与H₂S的反应速率常数为0.20 min, 探针体系的检测限达0.10 μmol•L⁻¹, 并且具有良好选择性.本研究提供了一种易于制备, 响应快速, 荧光增强显著的反应型硫化氢探针分子, 为开发高灵敏度有应用前景的硫化氢荧光探针提供了实验基础.

  3    实验部分

  3.1    仪器与试剂

  8-羟基芘甲醛根据文献[22, 23]合成得到. 1-溴-2, 4-二硝基苯为北京偶合科技有限公司产品, 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、硫氢化钠、谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸购于百灵威科技有限公司, 磷酸盐缓冲溶液(PBS, 10 mmol•L⁻¹, pH=7.4)为Solarbio产品, 其他试剂以及合成所用溶剂均为国药集团北京化学试剂公司分析纯或化学纯产品, 除特别说明外使用前未经进一步纯化.测试所用溶剂为百灵威科技有限公司HPLC纯度产品, 测试用水为MilliQ纯水系统制备的超纯水(电阻率18.3 MΩ•cm).

  北京中仪博腾科技有限公司X6精密显微熔点测定仪; Bruker Avance Π-400核磁共振仪; Varian Excalibur 3100红外光谱仪; Bruker solariX (ESI-MS)质谱仪; Thermo Scientific Q-Exactive (ESI-MS)质谱仪; Shimadzu UV-1601PC紫外-可见吸收光谱仪; Hitachi F-4600荧光光谱仪.

  3.2    实验方法

  辅助材料(Supporting Information) 化合物PCNP以及硫解反应产物的结构表征图谱.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  8-(2, 4-二硝基苯酚基)芘甲醛[8-(2, 4-dinitrophen-oxy) pyrene-1-carbaldehyde, PCNP]的合成.将8-羟基芘甲醛(0.120 g, 0.48 mmol)、1-溴-2, 4-二硝基苯(0.060 g, 0.24 mmol)和K₂CO₃ (0.067 g, 0.48 mmol)加入到50 mL三口烧瓶中, 用干燥的四氢呋喃溶解.在氮气保护下加热至回流, 反应2 h后, 停止反应.待冷却至室温, 将反应混合物倒入15 mL冰水中, 然后用乙酸乙酯萃取(20 mL×3), 合并有机相, 加入硫酸镁干燥.过滤, 滤液旋转蒸发, 得到粗产物.最后通过柱层析提纯[淋洗剂为二氯甲烷/石油醚(V / V=7/3)]得到0.050 g黄色固体, 产率50%. m.p. 239~241 ℃; UV-vis (THF) λ_max: 291, 370, 400 nm; ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ: 10.79 (s, 1H), 9.51 (d, J=9.3 Hz, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.54 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.48~8.33 (m, 3H), 8.26 (t, J=11.2 Hz, 2H), 8.19 (d, J=9.2 Hz, 1H), 7.84 (d, J=8.2 Hz, 1H), 6.87 (d, J=9.1 Hz, 1H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ: 194.08, 156.04, 148.47, 143.18, 142.38, 139.89, 135.67, 131.97, 130.89, 130.32, 129.61, 129.09, 128.27, 127.92, 126.40, 125.34, 124.69, 124.26, 123.45, 122.65, 122.26, 119.93, 119.51; IR (KBr) ν: 1682, 2770, 2873, 1485, 1531, 1033, 1273 cm^-1; HRMS calcd for C₂₃H₁₂N₂O₆Na 435.058757, found 435.05902.

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  图 1  37 ℃下PCNP (5×10^-6 mol•L⁻¹)在PBS缓冲溶液分散体系中与NaHS (1×10^-4 mol•L⁻¹)作用不同时间后的紫外-可见吸收光谱图(a)和荧光光谱图(b)

  Figure 1  Time-dependent absorption spectra (a) and fluores-cence spectra (b) of PCNP (5×10^-6 mol•L⁻¹) in PBS buffer in λ_ex=409 nm. Inset shows the pictures of the probe solution under 365 nm UV lamp before and after addition of NaHS

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  图 2  PCNP (5×10^-6 mol•L⁻¹)探针体系在加入NaHS (1×10^-4 mol•L⁻¹)后604 nm处荧光强度随时间变化图(λ_ex=409 nm)

  Figure 2  Fluorescence intensity at 604 nm of the probe system (5×10^-6 mol•L⁻¹ PCNP) as a function of time after addition of NaHS (1×10^-4 mol•L⁻¹)

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  图 3  PCNP (5×10^-6 mol•L⁻¹)探针体系604 nm处荧光强度随加入的NaHS浓度(0~100 μmol•L⁻¹)变化关系(λ_ex

  Figure 3  Change of fluorescence intensity at 604 nm of the PCNP sensing system (5×10^-6 mol•L⁻¹) as a function of the NaHS concentration (0~100 μmol•L⁻¹) (λ_ex=409 nm)

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  图 4  PCNP (5×10^-6 mol•L⁻¹)探针体系分别加入不同化合物后在604 nm处的荧光强度, 以及在干扰化合物存在条件下加入NaHS后体系的荧光响应(λ_ex=409 nm)

  Figure 4  Fluorescence intensity at 604 nm of the PCNP probe system (5×10^-6 mol•L⁻¹) after addition of different chemicals and the fluorescence response toward NaHS in the presence of different chemicals

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