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• 在细胞条件下, PPi由三磷酸腺苷(ATP)在水解酶的催化下水解产生, 同时还伴随着二磷酸腺苷(ADP)、单磷酸腺苷(AMP)以及大量磷酸根(Pi)等阴离子的生成.而且在不同pH值下PPi还以HP₂O₄^2-, H₂PO₄^-, HP₂O₇^3- (HPPi), H₂P₂O₇^2-(H₂PPi)等形式存在.另外, PPi较高的溶剂化能(ΔG⁰=-465 kJ•mol^-1)^[7]使其与水分子之间存在较强的氢键相互作用.正是由于存在较多的干扰离子以及具有与水较强的结合能力, 使得生理条件下PPi的检测仍然面临着巨大的挑战.

  焦磷酸根离子(P₂O₇^4-, PPi)不仅是工业废水中较难处理的含磷污染源之一, 而且是一类非常重要的生物目标阴离子.研究表明, PPi能够参与许多生命过程中的能量传递以及新陈代谢^[1], 如在DNA聚合酶的催化下参与DNA的复制, 据此可通过对PPi的传感实现DNA序列的实时测定^[2]. PPi还可作为潜在的生物标记物应用于癌症^[3]、软骨钙质沉着病^[4]以及关节炎^{[5, 6]}等病的早期诊断和治疗.由此可见, PPi的检测在生命科学、环境科学以及医学科学等领域都具有重要的科学意义.

  1    PPi传感器/体系的设计原理

  金属配合物作为阴离子比色、荧光传感器/体系, 具有较高灵敏度和选择性、较短的响应时间等优势^{[18, 19]}.目前, 基于金属配合物的传感器/体系的设计主要有两种策略:一是将PPi作为第二配体, 并与金属离子配合物之间通过强配位作用结合, 由此改变金属配合物的配位方式以及存在形式, 并转化为比色、荧光信号^[20].其中金属配合物为PPi结合位点(受体), 传统有机染料为信号报告基团(指示剂), 两种传感元件之间通过共价作用链接在同一个分子之中.比如二甲基吡啶胺(DPA)的Zn²⁺配合物Zn²⁺-DPA对PPi具有较强的亲和能力(K_a≈10⁶~10⁸ L•mol^-1).含有两个Zn²⁺-DPA结构单元的受体结合PPi之后, 往往促使其在溶液中形成聚集体, 从而失去了自由状态下的光学信号, 如图 2所示.据此, Yoon等^{[21, 22]}设计开发了大量基于Zn²⁺-DPA的PPi分子荧光探针, 并对此做了专门的综述性报道.另一种设计策略是基于竞争络合的指示剂置换法^{[23, 24]}. PPi作为金属离子的竞争配体, 促使其从“受体/指示剂”传感体系中解离, 从而恢复了指示剂自由状态下的光学信号^{[25, 26]}.遗憾的是, 这两类传感器/体系对PPi检测的选择性和灵敏度并不是很高, 大约在10 μmol•L^-1数量级^{[27, 28]}.另外, 生物流体中ATP, AMP, ADP等干扰离子的含量大约在nmol•L^-1数量级, 要比PPi含量低, 而Pi却比PPi含量高^[29].所以, 开发灵敏度更高的传感器/体系势在必行.

  近期报道的基于传感材料(尤其是纳米材料)的集成型传感体系在纯水中对PPi具有非常高的选择性和灵敏度, 最低检出限可达nmol•L^-1级别甚至更低.这种传感体系是将金属配合物通过共价或非共价的方式集成在特定功能的传感材料表面所形成, PPi作为第二配体或竞争配体诱导传感体系聚集状态的改变, 并伴随着传感体系光学信号的改变.通常, 传感材料既是传感元件的载体, 同时还是传感体系的信号报告基团^[30].作为传感元件的载体通常要满足如下要求: (1) 良好的水溶性; (2) 良好的生物兼容性; (3) 信号放大功能.

  

  图1 PPi荧光传感器1

  1. Fluorescent sensor for PPibased on compound 1

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  本文依据传感材料的不同, 分类介绍不同类型的集成型传感体系, 依次为: (1) 基于纳米材料的传感体系.这类传感体系构筑于纳米材料表面, 本文以金纳米粒子、量子点以及其它类型的纳米粒子为代表性传感材料, 进一步详细介绍. (2) 基于共轭聚电解质/聚合物的传感体系.这类传感体系以共轭聚电解质/聚合物为载体以及信号报告基团. (3) 基于脂质体的传感体系.受体分子、信号报告基团两种传感元件在脂质体双分子层上组装形成超分子组装体, 然后利用组装体对PPi进行传感. (4) 基于诱导聚集发光材料的传感体系.这类传感体系以活化的共轭分子为信号基团, PPi诱导下聚集状态的改变表现为体系荧光信号的增强或淬灭. (5) 其它类型的传感体系.本文将基于其它传感材料的PPi传感新技术、新方法统一在这种体系下评述.需要说明的是在(4)、(5)两种体系中并没有实体的传感材料, 但传感过程中分析物诱导传感体系经历聚集体的形成与解离, 聚集体本身具有信号放大功能, 因而在此一并介绍.本文对PPi化学、生物传感体系的发展方向做了简单的展望.

  

  图2 DPA, Zn²⁺-DPA以及(Zn²⁺-DPA)₂-PPi的结构

  2. Structures of DPA, Zn²⁺-DPA and (Zn²⁺-DPA)₂-PPi

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  早期临床上采用酶测的方法检测PPi, 这种方法准确可靠, 但是检测过程冗长且需要使用放射性标记试剂^{[8, 9]}. 1994年Czarnik等^[10]开创性地设计合成了基于分子荧光团的分子传感器1(图 1)之后, 类似的基于分子荧光团的分子传感器^[11~15]相继被报道.这类传统的传感器通常由PPi结合位点和信号报告基团通过共价链接于同一个分子之中^{[16, 17]}, 一般只有在极性有机溶剂中才有较好的选择性和灵敏度.

  2    基于纳米材料的传感体系

  纳米粒子(NPs)由于小尺寸效应、表面效应、量子尺寸限域效应以及宏观量子隧道效应使其具有超高的消光系数、距离相关的表面等离子共振等独特的光学性能^{[31, 32]}.正是基于这些特性, 再加上它们良好的光稳定性、生物兼容性等优点, 纳米材料往往表现出比常规传感分子更适合传感的光、磁、热、电等性能.其中, 金纳米粒子、量子点、氧化石墨烯、硅纳米粒子等已被作为PPi传感体系中的载体或信号报告基团.

  2.1    基于金纳米粒子的传感体系:

  

  图5 基于2-AuNPs的比色传感体系对PPi的传感机制

  5. Sensing mechanism of 2-AuNPs based colorimetric sensing ensemble for PPi

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  图9 基于BSA-AuNCs-Cu²⁺的PPi荧光传感体系

  9. Fluorescent sensing ensemble for PPi based on BSA-AuNCs-Cu²⁺

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  图3 Cu²⁺与AuNPs表面的Cys以及PPi之间的竞争配位

  3. Competitive coordination of Cu²⁺ with AuNPs surface-confined Cys and PPi

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  最近, Han课题组^[36]再次构筑了以2-AuNPs为信号基团和载体, DPA功能化的3Cu²⁺-4(图 6)为受体分子的比色传感体系.研究表明, 该传感体系能够快速而专一选择性地裸眼检测PPi, 最低检出限为320 nmol•L^-1, 其它含磷阴离子对PPi的检测不存在干扰.

  Liu等^[40]制备了牛血清蛋白保护的金纳米簇(BSA-AuNCs), 其在pH=6的缓冲溶液中能够发射红色荧光(λ_em=635 nm).牛血清蛋白中甘氨酸与Cu²⁺配位形成多组分体系(BSA-AuNCs-Cu²⁺), 同时荧光淬灭. PPi加入之后, 由于Cu²⁺与PPi之间的强亲和力导致其在BSA-AuNCs-Cu²⁺体系中解离, 溶液恢复红色荧光, 如图 9所示.这种环境友好型荧光传感体系能够在较宽的线性浓度范围内(0.16~78.1 μmol•L^-1)快速而高选择地检测PPi, 最低检出限为83 nmol•L^-1.这种荧光传感体系能够检测工业镀铜废液中的PPi.

  Yang等^[41]将11-巯基十一烷酸功能化的金纳米簇(MUA-AuNCs)分散于pH为7.4的水溶液中, 表现出强荧光发射(λ_em=612 nm), 金纳米簇表面羧基与Cu²⁺形成配合物(MUA-AuNCs-Cu²⁺)之后溶液荧光淬灭. PPi与Cu²⁺的竞争配位之后, MUA-AuNCs再次分散而荧光恢复.焦磷酸酶促使PPi水解之后荧光再次淬灭, 由此实现了焦磷酸酶活性的实时高灵敏度的检测, 如图 10所示.

  

  图7 基于竞争配位机制的PPi化学发光传感体系

  7. Chemiluminescence sensing emsemble for PPi based on the mechanism of competitive coordination

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  图4 焦磷酸酶调控下Cu²⁺与AuNPs表面的Cys以及PPi之间的可逆竞争配位

  4. Reversible competitive coordination of Cu²⁺ between AuNPs surface-confined Cys and PPi regulated by PPase

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  Cui等^[37]以N-(氨基丁基)-N-乙基异氨基苯二酰肼(5)为化学发光试剂, 半胱氨酸(Cys)为Cu²⁺配体, 中性条件下, 捕获Cu²⁺之后制备成双功能化的金纳米粒子Cu²⁺-Cys/5-AuNPs.如图 7所示, 由于Cys, Cu²⁺, Au-NPs对Cys-H₂O₂化学发光系统的协同催化效果, Cu²⁺-Cys/5-AuNPs化学发光强度比5单功能化金纳米粒子5-NPs增强了354倍. PPi与Cu²⁺更强的亲和能力使Cu²⁺从金纳米粒子表面解离, 导致金纳米粒子发光强度的剧烈减弱. Cu²⁺-Cys/5-AuNPs可作为PPi的化学发光传感体系, 实现了对PPi高选择性高灵敏的检测, 最低检出限为3.6 nmol•L^-1.该化学发光传感体系已应用于人体血浆样品中PPi的检测.

  

  图10 基于MUA-AuNCs-Cu²⁺的PPi荧光传感体系

  10. Fluorescent sensing ensemble for PPi based on the MUA-AuNCs-Cu²⁺

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  Han等^[35]利用竞争配位策略构筑了基于AuNPs的PPi比色传感体系, 其中, 有机磷酸酯功能化的AuNPs (2-AuNPs)为信号报告单元, 二氨甲基吡啶-Zn²⁺配合物([3-Zn]⁴⁺)为PPi受体基团.在pH为7的缓冲溶液中, [3-Zn]⁴⁺与2-AuNPs表面磷酸基团的配位结合诱导纳米级组装体(AuNPs-S)的形成, 同时伴随着溶液颜色从红色到蓝色的转变. PPi与[3-Zn]⁴⁺竞争结合使其从AuNPs-S中解离, 2-AuNPs再次得到分散, 溶液颜色从蓝色变为红色.通过AuNPs可控组装与解组装机制实现了对PPi的比色传感, 最低检出限为146 nmol•L^-1, ADP, AMP以及ADP等离子无干扰.

  金纳米粒子(AuNPs)因其具有尺寸可控、合成简单、易于修饰、较好的生物兼容性以及高的消光系数更适合于生物目标分子的比色传感体系的构筑. Mao等^[33]利用Cu²⁺与半胱氨酸(Cys)和PPi之间的竞争配位, 实现了关节炎病人滑液中PPi的比色检测, 如图 3所示. Cys功能化的金纳米粒子Cys-AuNPs分散于水中形成红色溶液(λ_max=519 nm). Cu²⁺与Cys的配位作用诱导Cys-AuNPs的聚集, 并伴随着蓝色(λ_max=650 nm)溶液的形成.之后, PPi作为竞争配体结合聚集体Cu²⁺-Cys-AuNPs中的Cu²⁺, 从而使得聚集体解离并得到Cys-AuNPs的分散体系, 此时溶液颜色变为酒红色, 由此实现了PPi的裸眼检测.研究结果表明, 该体系能够用于关节炎滑液中PPi的定性、定量检测.该工作对PPi传感器/体系的临床应用提供了理论依据, 为关节炎病的临床诊断提供了简便而快速的方法.

  

  图8 基于AuNRs-SiO₂-6的近红外荧光传感体系对PPi的荧光响应以及细胞成像

  8. Near-IR fluorescent sensing ensemble based on AuNRs-SiO₂-6 for PPi and the cell imaging

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  等离子增强的荧光技术能够明显放大荧光信号, 提高检测灵敏度^[38]. Ouyang等^[39]便是利用等离子荧光增强技术设计了基于核/壳金纳米棒(AuNRs)的近红外荧光增强型PPi传感体系(图 8).其中, 修饰过的带有正电荷的AuNRs为核, 包裹在核表面的二氧化硅壳层经过化学修饰而带负电荷, 形成等离子共振体AuNRs-SiO₂纳米粒子.之后再将卟啉6作为荧光发射体通过酰胺键共价交联于纳米粒子硅表面, 共同构建了核/壳/荧光分子层的等离子荧光放大传感体系AuNRs-SiO₂-6.在缓冲溶液中(pH=7.4), 一方面由于AuNRs-SiO₂等离子体共振吸收(λ_max=654 nm)与荧光发射体6的荧光发射光谱(λ_em=650 nm)完美重叠, 另一方面由于硅壳层厚度控制在22 nm, AuNRs-SiO₂-6具有最佳的荧光放大能力. Cu²⁺与6中已活化过的羧基配位形成AuNRs-SiO₂-6-Cu²⁺导致传感体系荧光淬灭.而Cu²⁺与PPi的竞争配位使其从传感体系中解离而使量子点溶液荧光恢复.据此, 发展了一种基于金纳米粒子的PPi荧光增强型传感体系, 检出限为820 nmol•L^-1且无其它离子干扰.该体系能应用于生理条件下HeLa细胞中Cu²⁺, PPi的原位检测.

  正是基于Cu²⁺和PPi对Cys-AuNPs引发的聚集和解聚原理, 研究人员已将上述体系应用于焦磷酸酶(PPase)活性的实时检测^[34](图 4).在相继加入Cu²⁺和PPi的金纳米粒子分散体系中, 利用PPase催化PPi水解生成Pi而释放出Cu²⁺, Cu²⁺与半胱氨酸配位导致聚集体的再次形成, 并伴随着溶液颜色从蓝色向红色的转变. PPase的加入促使金纳米粒子在聚集和分散两种状态之间完成可逆转化, 并借助于两种状态下最大吸收波长(A_{650 nm}, A_{522 nm})的比率变化, 实现了对PPase活性的实时检测.这是金纳米粒子首次利用比色法检测PPase活性的报道.

  

  图6 基于3Cu²⁺-4的PPi比色传感体系

  6. Colorimetric sensing ensemble for PPi based on 3Cu²⁺-4

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  2.2    基于量子点的传感体系

  最近, 该课题组^[48]利用Cu²⁺与CQDs表面羧基以及PPi之间的竞争配位, CQDs在Cu²⁺和PPi的诱导下从聚集态向分散态的转变, 同时伴随着体系荧光的淬灭和恢复, 由此构筑了PPi荧光传感体系(图 13).实现了人血清样品中碱性磷酸酶活性的实时检测.

  相对于金属量子点而言, 碳量子点(carbon quantum dots, CQDs)无毒害作用, 对环境的危害小, 制备成本低廉等优势, 已应用于生物传感以及医学成像等领域^{[45, 46]}.最近, Chai等^[47]报道了一种基于碳量子点的可逆荧光纳米开关, 是一种高选择性检测PPi的纳米组装体.如图 12所示, 分散在缓冲溶液(pH=7.4)中的CQDs具有强绿色荧光, Ce³⁺与CQDs表面羧基的配位结合诱导CQDs的聚集, 这种纳米组装体(Ce³⁺-CQDs)的形成直接导致CQDs荧光淬灭. PPi加入后形成Ce³⁺-PPi沉淀的同时使得聚集体解聚, CQDs再次分散而荧光恢复, 由此实现对PPi的选择性荧光传感, 最低检出限为0.1 μmol•L^-1.沉淀Ce³⁺-PPi被离心分离之后得到的CQDs溶液可循环利用, 使其成为一种可逆的PPi荧光“turn on”型开关.

  纳米晶体量子点(quantumdots, QDs)具有较大的Stocks位移、尺寸依存的带隙能量、较宽的激发光谱以及较窄的发射光谱, 有效地避免了光谱的重叠, 有利于荧光信号的检测^[42].另外, 量子点具有比传统有机荧光材料更大的荧光量子产率、高的发光强度(单个粒子的发光强度是单个有机染料分子的100倍左右)等优点.

  Chen等^[50]报道了基于氧化石墨烯的氮掺杂量子点N-GQDs (图 15), 其在365 nm激发下能观察到黄绿色荧光(λ_em=510 nm).在Tris-HCl缓冲溶液中, Eu³⁺与氨基羧的多位点配合形成N-GQDs-Eu³⁺, 量子点的进一步聚集导致荧光淬灭. PPi与氨基酸之间更强的竞争结合能力使量子点从聚集态中被释放出来, 同时荧光恢复.因此, N-GQDs-Eu³⁺可作为“off-on”型荧光探针, 实现了对PPi高选择性检测, 最低检出限为74 nmol•L^-1.

  

  图13 基于Cu²⁺-CQDs聚集体的碱性磷酸酶活性的实时荧光检测

  13. A real-time fluorescent assay for the detection of alkaline phosphatase activity based on Cu²⁺-CQDs aggregation

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  图14 基于CQDs-Pb²⁺的PPi荧光传感体系

  14. Fluorescent sensing ensemble based on CQDs-Pb²⁺for PPi

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  图15 基于N-GQDs-Eu³⁺的PPi荧光传感体系

  15. Fluorescent sensing ensemble based on N-GQDs-Eu³⁺

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  Ngeontae等^[43]最近报道了基于CdS量子点的PPi荧光传感体系.在pH为7.5的Tris-HCl缓冲液中, 半胱氨功能化的量子点(Cys-CdS QDs)平均粒径为4.7 nm, 525 nm处出现强荧光发射. Fe³⁺与量子点表面半胱胺配位形成[Cys-CdS QDs]-Fe³⁺多组分荧光传感体系.而PPi与Fe³⁺的竞争配位促使量子点与Fe³⁺配合物之间的电子转移, 由此导致量子点荧光淬灭(图 11). [Cys-CdS QDs]-Fe³⁺传感体系能选择性地检测PPi, 最低检测限为0.11 μmol•L^-1, 该体系已被应用于尿液中PPi的检测.最近, Ding等^[44]所报道的基于CdS量子点的传感体系对PPi的检测更加灵敏, 最低检出限降至35 nmol•L^-1.

  

  图11 基于荧光量子点[Cys-Cds QDs]-Fe³⁺的PPi荧光传感体系

  11. Fluorescent sensing ensemble based on [Cys-Cds QDs]-Fe³⁺

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  Wang等^[49]的研究工作表明, 荧光淬灭的CQDs-Pb²⁺体系(图 14)能从18种阴离子中高选择性的检测PPi, 最低检出限为0.5 μmol•L^-1.同时, CQDs-Pb²⁺传感体系能够检测尿样中PPi的含量.该工作中所用到的CQDs不需要化学修饰, 制备工艺简单.可惜的是, 这种基于纳米材料的荧光传感体系并没有提高对PPi的灵敏度.

  

  图12 基于Ce³⁺-CQDs的可逆PPi荧光传感体系

  12. Reversible fluorescent sensing ensemble based on Ce³⁺-CQDs for PPi

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  3.3    基于其它纳米材料的传感体系

  

  图17 基于Fe₃O₄-NPs磁纳米粒子的PPi荧光传感体系

  17. Fluorescent sensing ensemble for PPi based on Fe₃O₄-NPs

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  Tang等^[52]最近设计了基于磁纳米粒子的PPi荧光传感体系(图 17).作者首先在水溶液中制备了FAM标记的单链DNA (F*-DNA), 显示强绿色荧光发射(λ_em=518 nm), 与Fe₃O₄磁纳米粒子之间形成复合物(Fe₃O₄-NPs/F*-DNA)之后使其荧光淬灭. PPi与Fe₃O₄之间更强的亲合能力导致F*-DNA从纳米粒子表面解离而恢复自由状态, 同时绿色荧光恢复.这种荧光增强型传感体系在0.2~4 μmol•L^-1浓度区间内对PPi的最低检出限为76 nmol•L^-1, 而且具有较好的选择性和灵敏度.该方法能检测滑液中PPi, 达到诊断的目的.

  显然, 纳米材料可被设计为纯水中溶解度好、分散度高、放大传感信号、检出限(最低检出限低至nmol•L^-1级别)低的新型传感体系, 因而大大地提高了检测灵敏度.纳米传感材料与先进的生物技术相结合更是推动了传感体系的进一步发展.正是由于纳米材料独特的光学性能使其在发光器件、光学生物标记等领域具有广泛的应用前景, 俨然已成为取代传统有机染料分子理想的信号报告基团.

  

  图16 基于硅纳米粒子7的比色传感体系

  16. Colorimetric sensing ensemble for PPi based on Si-Nanoparticle 7

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  硅纳米粒子由于原料易得且无光学干涉、成熟的表面功能化技术等优点, 已被作为分析物各独立元件的集成平台构筑PPi多组分传感体系. Ahn等^[51]将Zn²⁺-DPA功能化的硅纳米粒子7作为分子识别受体而邻苯二酚紫(PV)为指示剂, 两种分子元件在pH为7的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液中, 自组装成为PPi比色传感体系, 其溶液表现为蓝色(λ_max=625 nm), 如图 16所示. PPi加入之后与Zn²⁺-DPA的竞争配位使PV从传感体系中解离, 从而导致溶液颜色逐渐恢复黄色(λ_max=444 nm).这种比色传感体系对PPi表现出专一选择性的裸眼检测.

  3    共轭聚电解质/聚合物的传感体系

  Bunz等^[29]报道了一种典型的PPi“受体/荧光指示剂”传感体系^{[58, 59]}(图 20).其中聚电解质10(λ_em=460 nm)为荧光指示剂, 立方体状的钴铁氧体磁纳米粒子([CoFe₂O₄]_x)为PPi受体, 两者通过静电相互作用自组装成为多组分荧光传感体系10-NPs.两者间典型的荧光共振能量传递导致10在10-NPs体系中90%的荧光淬灭.在pH为7.2的缓冲溶液中, PPi与磁纳米粒子的竞争结合导致荧光指示剂10从组装体中解离而荧光恢复.这种“turn-on”型荧光传感体系分别在200 μmol•L^-1 Pi或2 μmol•L^-1 PPi存在时可观察到溶液荧光的改变.因此, 10-NPs可选择性的检测PPi, 而且检测过程几乎不受其它含磷阴离子的干扰.该体系还被成功的应用于焦磷酸酶活性的监测.

  

  图20 基于聚电解质10的PPi荧光传感体系

  20. Fluorescence sensing ensemble for PPi based on anionic conjugated polyelectrolyte 10

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  图18 基于阴离子聚电解质8的PPi荧光传感体系

  18. Fluorescence sensing ensemble for PPi based on anionic polyelectrolyte 8

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  2010年, Schanze等^[57]构筑了基于聚阳离子电解质9的比率传感体系, 研究表明, PPi与多胺阳离子的结合导致聚合物从链状自由态向聚集态的转变, 同时伴随着最大吸收波长以及最大发射波长的红移, 由此实现了对PPi的比色及荧光传感(图 19).该传感器对PPi的检出限为340 nmol•L^-1, 而且这种比率传感器能区分Pi溶液中的PPi.

  Iyer等^[60]设计合成了基于阴离子型共轭聚合物11(图 21). 11在AIE机制下pH为7.4的缓冲溶液中发光(λ_em=419 nm), 与Cu²⁺配位络合之后紫外-可见光谱红移, 同时造成荧光的淬灭. PPi-Cu²⁺的竞争键合使其紫外-可见吸收光谱以及荧光发射光谱恢复, Pi无影响.因此, 11-Cu²⁺能选择性地比色、荧光双通道检测PPi, 最低检出限为8.90 nmol•L^-1.该体系能够应用于ALP活性的实时检测以及细胞成像之中.

  聚电解质是一类水溶性的聚合物, 与小分子染料相比具有更强的信号放大功能, 常被用来构筑化学或生物传感器/体系^[53].其中, 聚电解质共轭骨架为这类传感器的信号报告基团, 而PPi结合位点则共价链接于共轭骨架之上, 通过PPi诱导聚合物构型或交联方式的改变, 达到检测PPi的目的.

  

  图23 基于Zn²⁺-13-14的PPi比色、荧光传感体系

  23. Colorimetric and fluorescent sensing ensemble for PPi based on Zn²⁺-13-14

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  图22 基于12-Cu²⁺的PPi荧光传感机制

  22. Fluorescent sensing mechanism for PPi based on 12-Cu²⁺

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  相比之下, 基于聚电解质的这类传感器对PPi具有较好的选择性和灵敏度, 最低检出限同样为nmol•L^-1级别.但作为传感器的聚合物本身具有合成复杂、耗时耗力的缺点, 势必将会逐渐被其它方法所取代.

  聚丁二炔(PDA)分子在外界环境刺激下能够从蓝色向红色转变. Ahn等^[62]正是利用这种独特的颜色变化构筑了高选择性的PPi比色、荧光传感体系(图 23).他们首先合成了基于丁二炔的胺类(13)以及Zn (DPA)功能化的胺类14, 两种单体对应的脂质体在pH为7的溶液中1:1混合之后依此通过超声自组装、紫外光辐射下的交联聚合与Zn²⁺的配位之后得到Zn²⁺-13-14蓝色溶液, Pi和PPi的加入使溶液变为紫色, 其它离子不能引起任何颜色改变.随后将Zn²⁺-13-14固定于醛基修饰的玻璃表面制备成脂质体微阵列芯片, 该芯片对1 pmol• L^-1浓度之下的PPi通过红色荧光的增强而选择性的响应, 而同浓度的Pi却不能引起任何变化.

  2007年, Schanze等^[54]首次利用阴离子型共轭聚电解质8构筑PPi荧光传感体系(图 18). 8在HEPES缓冲溶液(pH=7.5)中因聚集而发光, Cu²⁺与聚电解质侧链羧基配位形成8-Cu²⁺, 由于电荷或能量转移的原因使聚电解质荧光淬灭. PPi加入后与Cu²⁺离子竞争络合形成Cu²⁺-PPi, 与此同时, 被释放出的8再次聚集而荧光恢复. 8-Cu²⁺作为“turn on”型荧光传感器, 对PPi的最低检出限为80 nmol•L^-1, 检测过程无其它阴离子干扰.随后, 他们将该体系应用于生理条件下碱性磷酸酶^[56]以及腺苷酸激酶^[55]活性的实时检测.

  

  图19 基于共轭聚电解质9的PPi荧光比率传感体系

  19. Fluorescence ratiometric sensing ensemble for PPi based on conjugated polyelectrolyte 9

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  图21 阴离子型共轭聚合物11的结构示意图

  21. Schematic representation of the structure of anionic conjugated polymer 11

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  Tian等^[61]设计合成了基于DPA功能化的亲水性共聚复合物12 (m/n=930:1)(图 22). 12由于侧链2-羟乙基在水中聚合而不能溶解, 在H₂O-CH₃CH₂OH (V:V=2:5, pH=7)溶液中有强荧光发射(λ_em=605 nm).配合物12-Cu²⁺的形成降低了分子内电荷转移效率而荧光淬灭. 12-Cu²⁺在溶液中能够选择性地对PPi快速响应, 复合物12-Cu²⁺-PPi中分子内电荷转移效率的增加使其荧光增强. Pi, ATP, ADP以及AMP对PPi的检测几乎没有干扰.另外, 作者将12-Cu²⁺在石英片上制备成荧光薄膜传感材料, 这种膜材料对PPi具有与溶液中相似的荧光响应, 说明它完全能够满足生物过程中PPi的高通量检测.

  4    基于脂质体的传感体系

  目前基于这种脂质体的传感体系只有König课题组做了初步的探索.但这种模块化的传感体系对PPi的选择性和灵敏性相对较差, 而且模块化元件化合物合成相对复杂^[65].

  2009年, König等^[63]将两亲性金属配合物嵌入到脂质体双层膜, 紫外光辐射下通过二乙炔的聚合组装成为多组分囊泡, 溶液颜色从无色变为蓝色.其中金属离子配合物15-Zn²⁺, 16-Zn²⁺, 17-Cu²⁺(图 24)既是PPi受体位点同时还是信号报告基团.中性条件下, mmol•L^-1浓度的PPi使囊泡溶液从深蓝色变为红色, 同时伴随着最大吸收波长的蓝移以及荧光发射强度的增强.相对而言, 双核配合物16-Zn²⁺传感体系对PPi具有较强的亲和力, 但检测过程受到ATP以及CN^-的干扰, 而17-Cu²⁺体系却对PPi具有专一选择性识别的能力.这些比色、荧光传感体系可制备成检测试纸可快速检测PPi, ATP.

  

  图25 基于自组装囊泡的模块化PPi荧光传感体系

  25. Fluorescent sensing ensemble for PPi based on modular self-assembled vesicle

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  图24 复合物15-Zn²⁺, 16-Zn²⁺, 17-Cu²⁺的结构示意图

  24. Schematic representation of the structures of 15-Zn²⁺, 16-Zn²⁺ and 17-Cu²⁺

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  之后, König等^[64]用两亲性的双核锌配合物18、羧基荧光素19分别作为PPi结合位点和指示剂, 采用模块化构筑策略, 两种独立元件以非共价相互作用共同嵌入到磷脂囊泡中组装成为可发光囊泡受体(E_m=520 nm)(图 25).由于PPi-18之间配位相互作用导致环境敏感型染料分子19在组装体中的重排, 进而使得荧光增强.作者以磷脂囊泡为载体, 与模块化的不同受体位点化合物以及环境敏感型染料进行组装, 不同的组装体系能够实现不同底物的选择性检测.凝胶色谱法回收后的囊泡可重复利用, 充分体现了超分子组装体可逆性优势.

  5    基于诱导聚集发光体的传感体系

  最近, Zheng等^[73]设计合成了基于四苯基乙烯的咪唑盐类大环传感器23(图 29). 23自身无荧光发射.由于尺寸匹配原则, 23与PPi形成几乎无荧光的1:1静电络合物23-PPi, 其它无机盐阴离子无响应.而Zn²⁺与23-PPi的配位进一步形成聚集体23-PPi-Zn, AIE机制导致聚集体在472 nm处出现强荧光发射, 从而构筑了一种荧光“turn on”型的传感器.

  

  图29 基于23的PPi荧光传感机制

  29. Sensing mechanism of 23 based fluorescent sensor for PPi

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  Cao等^[74]最近设计合成了基于聚降冰片稀的荧光传感器24(图 30). 24在缓冲溶液中由于喹啉侧链聚合的原因, 表现出喹啉激基缔合物的发射峰(λ_em=475 nm). 24-Zn²⁺的形成导致荧光发射光谱的蓝移(λ_em=425 nm), 当逐渐加入PPi, 传感体系在425 nm处荧光强度逐渐减弱直到完全淬灭.由此实现对PPi的选择性检测, 两种传感体系对PPi的最低检出限分别为28和35 μmol•L^-1, 并实现了HepG-2活体细胞的生物成像.

  

  图28 化合物22对PPi的荧光传感机制

  28. Sensing mechanism of 22 based fluorescent sensor for PPi

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  图31 基于25-Cu²⁺的PPi比色、荧光传感

  31. Colorimetric and fluorenscent sensing ensemble for PPi based on 25-Cu²⁺

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  图26 基于聚集体20的PPi比色、荧光传感体系

  26. Colorimetric and fluorescent sensing ensembles for PPi based on 20

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  自诱导聚集发光(aggregation-induced emission, AIE)机制^[66]报道以来, 已被广泛应用于各种客体分子的传感^[67~69].最近, Das等^[70]利用AIE机制实现了对PPi的检测(图 26).苯并咪唑功能化的亚胺类传感器20在THF中无荧光发射, 而在H₂O/THF (V:V=99:1)的混合体系中, 能通过π-π堆积以及分之内、分子间的氢键作用聚集, 分子内C-C以及C=N键的旋转受限导致聚集体在530 nm处出现荧光发射.随后, PPi与NH和OH之间的氢键作用使分子进一步聚集而荧光增强.同时, 溶液颜色从无色变为淡黄色.另外, Ca²⁺与PPi竞争结合后聚集体荧光剧烈减弱, 溶液颜色退去.研究结果说明, 20在水溶液中可作为PPi的“开-关”型比色、荧光传感器, 检测限约为1.67 nmol•L^-1, 而且无其它阴离子的干扰.有趣的是, 该传感器在生理条件下能够实现人体Hela活细胞中PPi的原位检测.

  

  图30 基于24-Zn²⁺的PPi荧光传感体系

  30. Fluorenscent sensing ensemble for PPi based on 5-Zn²⁺

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  Li等^[75]合成了基于苝酰亚胺的阴离子型传感器25(图 31).络合物25-Cu²⁺在缓冲溶液中的聚集导致荧光淬灭, PPi竞争络合Cu²⁺之后使得聚集体解离而荧光恢复, 从而实现了对PPi的比色、荧光传感. 25-Cu²⁺对PPi的最低检出限为0.2 μmol•L^-1, 无其它离子干扰. 25-Cu²⁺可用于碱性磷酸酶的活性检测.

  最近, Yu等^[71]报道了基于四苯乙烯分子21通过AIE机制识别PPi的荧光传感体系(图 27).由于从四苯乙烯到吡啶盐的分子内电荷转移, 它们在水溶液中只有较弱的荧光发射. PPi诱导下聚集体的形成极大地限制了四苯乙烯基团分子内旋转而荧光显著增强(AIE机制, λ_em=625), 实现了对PPi荧光“turn on”型传感, 最低检出限为133 nmol•L^-1.用化合物21制备的固体薄膜同样能够快速而选择性地检测PPi.该传感体系能够在Hela细胞中实现对PPi的荧光检测.

  Hong等^[72]设计了DPA修饰的四苯乙烯衍生物22(图 28).荧光光谱研究表明, 在H₂O/DMSO (V:V=10:1)混合溶液中, 由于AIE机制, 22在472 nm处出现较强的荧光发射. Zn²⁺-22的形成降低了化合物的聚集程度, 导致化合物荧光逐渐淬灭. PPi-Zn²⁺-DPA的形成限制了四苯乙烯分子中苯基的旋转, 从而导致分子荧光显著增强.这种荧光“turn on”型传感体系对PPi的最低检出限为0.92 μmol•L^-1.遗憾的是, AMP, ATP对PPi的检测存在一定的干扰, 而Pi以及ADP的影响作者没有考虑.

  

  图27 基于化合物21的PPi荧光传感

  27. Fluorescent sensor for PPi based on 21

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  6    构筑于其它载体上的传感体系

  最近, George等^[78]合成了苝二酰亚胺功能化的2, 2'-二甲基吡啶胺与Zn²⁺的配合物27-Zn²⁺, 并通过其与磷酸腺苷客体分子的特异性结合调控超分子组装体的手性(图 34).在HEPES-CH₃CN (V:V=9:1)体系中, 由于苝基团分子间疏水以及π-π堆积相互作用而形成前手性H-聚集体(H1-State). ATP与27-Zn²⁺的特异性结合促使受体分子完成H-聚集, 进而通过同促变构效应诱导H1-State重组为右手螺旋聚集体(H2-State).而非手性PPi以及手性ADP却能通过异促变构机制, 促使H1-State向H2-State的转变.该工作首次报道了同促、异促变构机制在单一体系中对超分子组装体手性的调控, 而且这种独特的异促变构效应能进一步应用于ATP的自动调节.

  最近, Molina等^[77]在乙醇溶液中将二咔唑基脲26通过烷基双硫键固定于金表面, 得到受体分子在金表面的自组装单层膜(self-assembled monolayer, SAM) 26-SAM (图 33). 26-SAM进一步被作为表面等离子共振传感器, 通过氢键相互作用, 高选择性、高灵敏度地识别HPPi.实验结果表明, 在不同的缓冲介质中, 最低检出限可达到0.097 nmol/L, 对于HPPi而言, 这是截至目前所报道检出限最低的人工受体.另外, ATP, ADP以及其它不同形状、电荷、尺寸的阴离子不影响HPPi的检测.该工作首次借助于表面等离子共振技术实现了对小分子量分析底物的检测, 这为生理条件下检测重要的生物标记物提供了一种新方法.

  

  图34 ATP和PPi对超分子组装体手性的调控

  34. Regulation of supramolecular chirality by ATP and PPi

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  Zhao等^[76]利用荧光标记的单链DNA (ss-DNA)实现了对PPi的快速检测(图 31).在pH为7.4的缓冲溶液中, 静电络合物ss-DNA-Al³⁺的聚集导致ss-DNA荧光淬灭.而PPi与Al³⁺的竞争络合使得ss-DNA从聚集体中被释放出来, 荧光得以恢复.从而实现了对PPi高选择性高灵敏度的荧光检测, 最低检出限为40 nmol•L^-1, 其它阴离子无干扰.同时, 这种“turn on”型荧光传感器ss-DNA-Al³⁺可直接应用于尿液和细胞溶解液中PPi的实时检测.

  

  图32 ss-DNA-Al³⁺对PPi的荧光传感机制

  32. Sensing mechanism of ss-DNA-Al³⁺based fluorescent sensing ensemble for PPi

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  图33 基于26-SAM的PPi表面等离子共振传感器

  33. Surface plasmon resonance sensor for HPPi based on 26-SAM

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  7    结论及展望

  新型传感技术与纳米材料的相结合将会对PPi的传感注入新的活力.纳米材料的可控制备和化学修饰将会进一步推动PPi传感体系的发展.

  最近几年, 通过科研工作者的不懈努力和精心设计, 基于传感材料的生物阴离子PPi比色、荧光传感器/体系得到了启蒙发展.本文通过对不同类型传感体系进行分类综述, 旨在重点介绍生物阴离子PPi的快速、简单、高选择性高灵敏度的传感方法.对比分析发现, 不同类型的传感器/体系优缺点并存.其中共轭聚电解质/聚合物以及聚集诱导发光分子自身合成困难, 生物兼容性较差, 注定将被其它传感方法所取代.纳米材料因为独特的光、电、磁等性质, 更适合发展新型的PPi传感体系, 尤其是还具有良好生物兼容性的荧光碳点.纳米材料作为载体的传感体系已表现出较高的临床应用价值, 这对相关疾病的早期诊断和治疗具有重要的现实意义.

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  图 1  PPi荧光传感器1

  Figure 1  Fluorescent sensor for PPibased on compound 1

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  图 2  DPA, Zn²⁺-DPA以及(Zn²⁺-DPA)₂-PPi的结构

  Figure 2  Structures of DPA, Zn²⁺-DPA and (Zn²⁺-DPA)₂-PPi

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  图 3  Cu²⁺与AuNPs表面的Cys以及PPi之间的竞争配位

  Figure 3  Competitive coordination of Cu²⁺ with AuNPs surface-confined Cys and PPi

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  图 4  焦磷酸酶调控下Cu²⁺与AuNPs表面的Cys以及PPi之间的可逆竞争配位

  Figure 4  Reversible competitive coordination of Cu²⁺ between AuNPs surface-confined Cys and PPi regulated by PPase

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  图 5  基于2-AuNPs的比色传感体系对PPi的传感机制

  Figure 5  Sensing mechanism of 2-AuNPs based colorimetric sensing ensemble for PPi

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  图 6  基于3Cu²⁺-4的PPi比色传感体系

  Figure 6  Colorimetric sensing ensemble for PPi based on 3Cu²⁺-4

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  图 7  基于竞争配位机制的PPi化学发光传感体系

  Figure 7  Chemiluminescence sensing emsemble for PPi based on the mechanism of competitive coordination

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  图 8  基于AuNRs-SiO₂-6的近红外荧光传感体系对PPi的荧光响应以及细胞成像

  Figure 8  Near-IR fluorescent sensing ensemble based on AuNRs-SiO₂-6 for PPi and the cell imaging

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  图 9  基于BSA-AuNCs-Cu²⁺的PPi荧光传感体系

  Figure 9  Fluorescent sensing ensemble for PPi based on BSA-AuNCs-Cu²⁺

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  图 10  基于MUA-AuNCs-Cu²⁺的PPi荧光传感体系

  Figure 10  Fluorescent sensing ensemble for PPi based on the MUA-AuNCs-Cu²⁺

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  图 11  基于荧光量子点[Cys-Cds QDs]-Fe³⁺的PPi荧光传感体系

  Figure 11  Fluorescent sensing ensemble based on [Cys-Cds QDs]-Fe³⁺

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  图 12  基于Ce³⁺-CQDs的可逆PPi荧光传感体系

  Figure 12  Reversible fluorescent sensing ensemble based on Ce³⁺-CQDs for PPi

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  图 13  基于Cu²⁺-CQDs聚集体的碱性磷酸酶活性的实时荧光检测

  Figure 13  A real-time fluorescent assay for the detection of alkaline phosphatase activity based on Cu²⁺-CQDs aggregation

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  图 14  基于CQDs-Pb²⁺的PPi荧光传感体系

  Figure 14  Fluorescent sensing ensemble based on CQDs-Pb²⁺for PPi

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  图 15  基于N-GQDs-Eu³⁺的PPi荧光传感体系

  Figure 15  Fluorescent sensing ensemble based on N-GQDs-Eu³⁺

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  图 16  基于硅纳米粒子7的比色传感体系

  Figure 16  Colorimetric sensing ensemble for PPi based on Si-Nanoparticle 7

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  图 17  基于Fe₃O₄-NPs磁纳米粒子的PPi荧光传感体系

  Figure 17  Fluorescent sensing ensemble for PPi based on Fe₃O₄-NPs

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  图 18  基于阴离子聚电解质8的PPi荧光传感体系

  Figure 18  Fluorescence sensing ensemble for PPi based on anionic polyelectrolyte 8

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  图 19  基于共轭聚电解质9的PPi荧光比率传感体系

  Figure 19  Fluorescence ratiometric sensing ensemble for PPi based on conjugated polyelectrolyte 9

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  图 20  基于聚电解质10的PPi荧光传感体系

  Figure 20  Fluorescence sensing ensemble for PPi based on anionic conjugated polyelectrolyte 10

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  图 21  阴离子型共轭聚合物11的结构示意图

  Figure 21  Schematic representation of the structure of anionic conjugated polymer 11

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  图 22  基于12-Cu²⁺的PPi荧光传感机制

  Figure 22  Fluorescent sensing mechanism for PPi based on 12-Cu²⁺

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  图 23  基于Zn²⁺-13-14的PPi比色、荧光传感体系

  Figure 23  Colorimetric and fluorescent sensing ensemble for PPi based on Zn²⁺-13-14

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  图 24  复合物15-Zn²⁺, 16-Zn²⁺, 17-Cu²⁺的结构示意图

  Figure 24  Schematic representation of the structures of 15-Zn²⁺, 16-Zn²⁺ and 17-Cu²⁺

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  图 25  基于自组装囊泡的模块化PPi荧光传感体系

  Figure 25  Fluorescent sensing ensemble for PPi based on modular self-assembled vesicle

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  图 26  基于聚集体20的PPi比色、荧光传感体系

  Figure 26  Colorimetric and fluorescent sensing ensembles for PPi based on 20

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  图 27  基于化合物21的PPi荧光传感

  Figure 27  Fluorescent sensor for PPi based on 21

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  图 28  化合物22对PPi的荧光传感机制

  Figure 28  Sensing mechanism of 22 based fluorescent sensor for PPi

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  图 29  基于23的PPi荧光传感机制

  Figure 29  Sensing mechanism of 23 based fluorescent sensor for PPi

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  图 30  基于24-Zn²⁺的PPi荧光传感体系

  Figure 30  Fluorenscent sensing ensemble for PPi based on 5-Zn²⁺

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  图 31  基于25-Cu²⁺的PPi比色、荧光传感

  Figure 31  Colorimetric and fluorenscent sensing ensemble for PPi based on 25-Cu²⁺

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  图 32  ss-DNA-Al³⁺对PPi的荧光传感机制

  Figure 32  Sensing mechanism of ss-DNA-Al³⁺based fluorescent sensing ensemble for PPi

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  图 33  基于26-SAM的PPi表面等离子共振传感器

  Figure 33  Surface plasmon resonance sensor for HPPi based on 26-SAM

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  图 34  ATP和PPi对超分子组装体手性的调控

  Figure 34  Regulation of supramolecular chirality by ATP and PPi

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