多肽酰肼法合成翻译后修饰物蛋白NEDD8

引用本文: 管超建, 王涛, 王君, 李宜明. 多肽酰肼法合成翻译后修饰物蛋白NEDD8[J]. 有机化学, 2016, 36(11): 2763-2768. doi: 10.6023/cjoc201605013 shu

Citation: Guan Chaojian, Wang Tao, Wang Jun, Li Yiming. Synthesis of Post-translational Modifier Protein NEDD8 via Ligation of Peptide Hydrazides[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2016, 36(11): 2763-2768. doi: 10.6023/cjoc201605013 shu

多肽酰肼法合成翻译后修饰物蛋白NEDD8

管超建 ,
王涛 ,
王君 ^{*,
,} ,
李宜明 ^{*,
,}

1.
合肥工业大学生物与医学工程学院合肥 230009

通讯作者: 王君, E-mail: wangjun-08@126.com; 李宜明, E-mail: lym2007@mail.ustc.edu.cn

基金项目:
国家自然科学基金 21572043

国家自然科学基金 21372058

摘要: NEDD8（神经前体细胞表达发育下调蛋白8）是真核生物体内一种重要的类泛素化蛋白，参与调控细胞内一系列重要的生命过程.目前获得NEDD8的主要方法是生物重组表达，该策略的缺点在于表达量不高且需要除去外加纯化标签的步骤.本研究结合高温辅助固相合成技术与基于多肽酰肼连接的一锅连接-脱硫策略，较为高效地获得了均一性的NEDD8蛋白，为进一步研究NEDD8修饰蛋白的结构与功能提供了基础.

关键词:

English

Synthesis of Post-translational Modifier Protein NEDD8 via Ligation of Peptide Hydrazides

1.
Department of Pharmacy, School of Biological and Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009

Corresponding author: Wang Jun, wangjun-08@126.com; Li Yiming, lym2007@mail.ustc.edu.cn

Received Date: 10 May 2016
Revised Date: 08 June 2016
Fund Project:
National Natural Science Foundation of China

National Natural Science Foundation of China

Abstract: As an important ubiquitin-like modifier protein in eukaryotic organisms, NEDD8 (neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 8) is involved in regulating a series of important life processes in cells. Nowadays, the major method for obtaining NEDD8 is recombinant protein expression. However, the yield is relatively low and the recombined tag for purification needs to be removed in an extra step. In present work, NEDD8 protein was first synthesized in homogeneity by using high temperature assisted solid-phase peptide synthesis (SPPS) combining with the one-pot ligation-desulfurization strategy. This method lays the foundation for the study of NEDD8 modified proteins in future.

Key words:

前人主要通过生物重组表达的方法来获得NEDD8^[8].然而使用大肠杆菌体系表达NEDD8的效率较低^[9], 同时, 为了纯化蛋白需要融入His-tag或者GST标签, 然后再使用特异性的酶来切除.这样的策略较为繁琐, 且进一步降低了NEDD8的获取效率.近年来, 随着多肽/蛋白质固相合成(Solid-phase Peptide Synthesis, SPPS)及连接技术的不断改进, 化学合成已成为获得翻译后修饰蛋白的一种重要的手段^[10].本研究尝试使用多肽酰肼连接并结合一锅连接脱硫策略合成性质均一的NEDD8^[11]. NEDD8含有76个氨基酸, 我们首先将其分成三片段合成并通过两次连接后获得了全长蛋白.由于多次分离、纯化致使合成效率降低, 我们进一步使用高温辅助Fmoc-SPPS策略合成了长达56个AA的片段^[12], 并通过一锅连接脱硫获得了全长的NEDD8^[13].最后我们通过质谱、SDS-PAGE、CD (Circular Dichroism)等分析手段对合成蛋白进行了表征, 证明其拥有与天然表达NEDD8的类似结构.本工作为高效获得性质均一的NEDD8及其他类泛素蛋白提供了一种途径, 也为研究蛋白质NEDD化相关的生化、结构机制提供了基础.

2004年, 研究人员最早在泛素E3酶Cullin家族上发现了NEDD化修饰^[4].研究表明当NEDD8共价结合至Cullin蛋白上后, 会使Cullin的构象发生改变、活性增强, 从而能够更加高效地将Ub带到底物蛋白上完成泛素化^[5]. 2012年Fushman等^[6]发现NEDD化的多聚Ub链能够终止自身链的延长, 从而维持细胞内自由Ub的正常水平.除了Cullin与多聚Ub链外, 人们也在细胞内的一些其他蛋白如Pvhl、p53及其E3连接酶Mdm2、核糖体蛋白L11以及Caspase-7上发现了NEDD化修饰^[7].为了进一步研究蛋白质NEDD化引发的生化、结构机制, 获得大量、性质均一的NEDD8及多聚NEDD8链就显得尤为重要.

蛋白质翻译后修饰在真核生物的生命活动中发挥着关键的作用.作为最为重要的一类翻译后修饰, 泛素化(Ubiquitination, Ub)参与了真核细胞内包括靶蛋白降解、增殖与分化、DNA损伤修复等大部分生命进程^[1].近期, 一些类泛素化蛋白[如SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier), NEDD8 (Neural Precursor Cell Expressed Developmentally Down-Regulated 8)等]修饰在真核生物体内也被陆续被发现.其中NEDD8的结构与Ub最为相似, 二者的氨基酸序列的相似性达到了59%^[2].与Ub化过程类似, NEDD8也是通过激活酶E1、结合酶E2和连接酶E3的协同作用, 使得C端的Gly共价结合到底物蛋白的Lys上来发挥作用, 该过程被称为底物蛋白的NEDD化修饰^[3].

1    结果与讨论

1.1    三片段合成NEDD8

1.2    两片段连接一锅连接脱硫合成NEDD8

1.3    合成NEDD8与表达NEDD8的结构比较

图8 SDS-PAGE及CD分析比较合成与表达NEDD8

8. Comparison of synthetic NEDD8 and expressed NEDD8 via SDS-PAGE and CD analysis

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为了进一步确定合成NEDD8的结构正确性, 我们使用SDS-PAGE及圆二色谱(CD)方法将其与生物表达的NEDD8进行了比对.结果显示, 我们得到了具有较高均一性的蛋白, 与生物表达的NEDD8具有类似的二级结构(图 8).

1.1.2    多肽酰肼法连接片段1a与1b

图3 片段1d的色谱和质谱分析

3. HPLC and ESI-MS analysis of purified peptide 1d

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将片段1a (1.0 mmol/L)溶于反应缓冲液(6.0 mol/L Gn•HCl, 0.2 mol/L Na₂HPO₄, pH 2.6)中, 经亚硝酸钠氧化(-10 ℃)后得到1a的酰基叠氮产物.再外加硫醇、巯基乙酸甲酯(MTG), 调节pH至5.5, 得到1a的硫酯产物.最后加入1b (1.2 mmol/L), 调节pH至6.8~6.9, 使用HPLC监测发现8 h后可得到转化较完全的连接产物1d.分离、纯化后获得纯品2.1 mg (产率32%)(图 3). ESI-MS m/z: 6550.27 [M+H]⁺.

1.1.3    多肽酰肼法连接片段1c与1d

图4 全长NEDD8 (1e)纯化后的色谱和质谱分析

4. HPLC and ESI-MS analysis of full length purified NEDD8 (1e)

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将片段1d溶于pH 2.6的反应缓冲液中, 经亚硝酸钠氧化(-10 ℃)后再加入MTG并调节pH至5.5, 得到1d的硫酯产物.此时将片段1c加入反应液中, 调节pH至6.8~6.9.使用HPLC对反应进行监测发现11 h后即可得到转化完全的连接产物.此时在反应液中先后加入三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)、2-巯基乙烷磺酸钠(Mesna)后调pH至6.5, 最后加入偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐(VA-044)进行脱硫.经纯化、分离后获得全长的NEDD8蛋白1e约0.9 mg (产率10.5%)(图 4). ESI-MS m/z: 8537.58[M+H]⁺.

1.1.1    合成NEED8片段1a, 1b与1c

通过对NEDD8的序列分析我们发现整个片段只有两个Ala (56, 57位)适合作为连接位点.如果使用两片段合成则第一片段将会含有56个AA, 而超过50个氨基酸的长片段多肽通常难以合成或合成效率低下^[14].因此, 我们首先尝试采用三片段连接策略合成NEDD8 (图 1).由于1a片段的Gly35与Ala在结构上仅相差一个亚甲基, 且该氨基酸并不处于蛋白质的关键位点.因此, 选择Gly35为连接位点, 首先将其用Cys替代, 在接后再脱硫即可获得Ala35, 最终通过三片段连接合成NEDD8.使用常规的Fmoc固相合成方法获得了三个多肽片段1a, 1b, 1c.为了防止Met氧化形成副产物, 在合成中使用Nle代替片段中的Met^[15].经半制备HPLC (High Performance Liquid Chromatography)分离后得到纯品1a 35.4 mg (分离产率19.9%), 1b 31.4 mg (分离产率37.3%), 1c 18.6 mg (分离产率30.5%)(图 2).色谱、质谱分析证明了三段多肽合成的正确性.

图1 三片段合成策略

1. Strategy for three segments synthesis

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图2 三片段粗肽的色谱、质谱分析

2. HPLC and ESI analysis for three segments of crude peptides

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1.2.1    使用高温辅助Fmoc-SPPS法合成NEED8片段

虽然通过三片段连接策略可以获得全长NEDD8蛋白, 但多次连接、纯化过程不仅操作繁琐也使得产率并不理想.近期本课题组发展的高温辅助Fmoc-SPPS方法, 该策略有助于合成序列更长、纯度更高的肽片段^[12].基于此, 我们首先尝试合成长片段NEDD8(1-56) (2a), 进而通过两片段连接的获得蛋白, 并结合基于MTG的一锅连接脱硫方法提高合成效率(图 5)^[13]. HPLC及质谱结果证明, 通过使用高温辅助Fmoc-SPPS策略两段肽均可以正确获得, 尤其是片段2a的合成效率也较为理想.经分离、纯化后得到纯品2a 13.5 mg (分离效率11.3%)及2b 18.6 mg (分离产率30.5%) (图 6).

图5 两片段合成策略

5. Strategy for one-pot two segments ligation-desulfurization strategy

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图6 粗肽片段2a、2b的色谱和质谱分析

6. HPLC and ESI-MS analysis of crude 2a and 2b

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1.2.2    一锅连接脱硫获得全长NEDD8 (2c)

在获得片段2a和2b后, 我们首先将其连接以获得全长蛋白.将2a溶于pH 2.6的反应缓冲液中, 经亚硝酸钠化再加入MTG后调pH至5.5, 可得到2a的硫酯产物.此时将片段2b加入到反应液里, 调节pH至6.8~6.9, 使用HPLC监测发现11 h后即可完全获得连接产物.此时不经纯化直接在反应液中加入TCEP、Mesna后调pH至6.5, 最后加入VA-044进行脱硫, 37 ℃反应约10 h即可得到终产物2c.经分离、纯化后获得纯品约1.2 mg (产率24%).我们最终通过两片段连接一锅脱硫策略获得了天然的全长NEDD8蛋白(图 7). ESI-MS m/z: 8525.67[M+H]⁺.

图7 两片段合成全长NEDD8的色谱和质谱分析

7. HPLC and ESI-MS analysis of full length purified NEDD8 via one-pot two-segment ligation-desulfurization

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2    结论

本研究结合高温辅助Fmoc-SPPS、多肽酰肼连接及一锅连接脱硫策略较为高效地实现了重要翻译后修饰物蛋白NEDD8的三片段及两片段的化学合成.通过与生物表达NEDD8的分析比较, 证明了合成蛋白具有较好的均一性及正确的二级结构.本研究为获得大量、均一性好的NEDD8及其他类泛素蛋白提供了一种新途径, 进而为研究NEDD化蛋白的机构与功能机制提供了基础.

3    实验部分

3.1    仪器与试剂

分析及半制备型HPLC使用岛津(Prominence LC-20AT), 分析型色谱柱使用Grace Vydac“Peptide C18”, 150 mm×4.6 mm, 流速为1.0 mL/min, 紫外检测器波长为214和254 nm.半制备型色谱柱使用Grace Vydac“Peptide C18”, 250 mm×10 mm, 流速为4.0 mL/min, 紫外检测器波长为214和254 nm.流动相A使用含有0.08%三氟乙酸(TFA)的乙腈, 流动相B使用含有0.1% TFA的水.分析型HPLC使用乙腈浓度为10%~90%及20%~80%的梯度洗脱, 梯度时间分别为30和20 min.半制备型HPLC使用乙腈浓度为10%~90%和20%~80%的梯度洗脱, 梯度时间均为30 min.除特殊说明所采用试剂均为市售分析纯.

3.2    实验方法

3.2.3    多肽酰肼连接

称取1 mmol/L的C端为酰肼的多肽片段溶于pH 2.6的反应缓冲液中(900 µL), 在-10 ℃的条件下加入5 mmol/L的亚硝酸钠溶液至终体积为1 mL, 反应20 min后加入30 mmol/L的硫醇试剂, 调pH至7.0, 之后加入1.2 mmol/L N端为Cys的多肽片段, 使用分析型HPLC监测反应.反应完成后使用半制备型HPLC分离连接产物, 冻干后即可得到纯品^[16].

3.2.4    基于MTG的一锅连接-脱硫策略

称取1 mmol/L的C端为酰肼的多肽片段溶于pH 2.6的反应缓冲液中(900 µL), 在-10 ℃的条件下加入5 mmol/L亚硝酸钠溶液至终体积为1 mL, 反应20 min后加入30 mmol/L的MTG并调pH至5.5, 反应20 min后加入1.2 mmol/L N端为Cys的多肽片段, 使用分析型HPLC监测反应.反应完成后向反应液里先后加入250 mmol/L的TCEP, 100 mmol/L的Mesna, 调节pH至6.5, 最后加入30 mmol/L的VA-044, 在37 ℃下进行脱硫反应约10 h.反应完成后使用半制备型HPLC分离连接产物, 冻干后即可得到纯品.

辅助材料(Supporting Information) 各个肽片段色谱与质谱的原始谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

3.2.1    酰肼树脂的制备

称取232 mg (0.1 mmol) 2-Cl-Trt (Cl)树脂(取代度为0.43 mmol/g)于固相合成管内, 将N, N-二甲基甲酰胺(DMF)与二氯甲烷(DCM)按照(V:V=1:1)的比例加入到合成管内(混合液体积没过树脂即可), 将树脂溶胀10 min后抽干, 加入含5% NH₂NH₂•H₂O的DMF溶液4 mL, 室温反应两次每次1 h.反应结束后加入4 mL甲醇继续反应30 min.最后按照DMF, DCM, DMF的顺序各洗三次, 抽干后即用.

3.2.2    高温辅助Fmoc-SPPS

标准的高温辅助Fmoc-SPPS各试剂的用量为: 4 equiv.氨基酸, 4.5 equiv. 2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma), 4.5 equiv. N, N'-二异丙基碳二胺(DIC), 反应前需预先活化6 min, 反应温度90 ℃, 反应时长20 min.特殊氨基酸的反应条件如下, Arg: 4 equiv.氨基酸, 3.6 equiv. 6-氯苯并三氮唑-1, 1, 3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU), 8 equiv. N, N-二异丙基乙胺(DIEA), 室温反应50 min; Cys: 4 equiv氨基酸4.5 equiv. Oxyma, 4.5 equiv. DIC, 反应前需预先活化6 min, 50 ℃反应20 min.所有序列中的Met均用Nle代替, 反应按照标准条件进行.每个氨基酸反应结束后用含20%哌啶的DMF溶液哌解6 min以脱除Fmoc保护基, 再按照DMF, DCM, DMF的顺序各洗3~4次.所有氨基酸连接完成后用8 mL切割溶液[88% TFA, 5% H₂O, 5%苯酚, 2%三异丙基硅烷(TIPS)]将多肽片段从树脂上切除, 同时脱除掉所有氨基酸侧链保护基, 脱除时间为2 h.之后将切割液收集至离心管中, 通入氮气浓缩再用冰乙醚沉淀、离心后风干即可得到粗肽.粗肽经半制备型HPLC分离、冻干后得到纯肽.
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图 1 三片段合成策略

Figure 1 Strategy for three segments synthesis

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图 2 三片段粗肽的色谱、质谱分析

Figure 2 HPLC and ESI analysis for three segments of crude peptides

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图 3 片段1d的色谱和质谱分析

Figure 3 HPLC and ESI-MS analysis of purified peptide 1d

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图 4 全长NEDD8 (1e)纯化后的色谱和质谱分析

Figure 4 HPLC and ESI-MS analysis of full length purified NEDD8 (1e)

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图 5 两片段合成策略

Figure 5 Strategy for one-pot two segments ligation-desulfurization strategy

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图 6 粗肽片段2a、2b的色谱和质谱分析

Figure 6 HPLC and ESI-MS analysis of crude 2a and 2b

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图 7 两片段合成全长NEDD8的色谱和质谱分析

Figure 7 HPLC and ESI-MS analysis of full length purified NEDD8 via one-pot two-segment ligation-desulfurization

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图 8 SDS-PAGE及CD分析比较合成与表达NEDD8

Figure 8 Comparison of synthetic NEDD8 and expressed NEDD8 via SDS-PAGE and CD analysis

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