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  汞广泛存在于自然界,是最常见的环境污染物之一,而且环境中的无机汞可以被微生物转化为甲基汞,并进一步通过食物链被人体吸收,从而对肾脏、大脑及神经系统造成严重损害^[1～3]. 因此,高选择性、高灵敏度地检测和识别汞离子具有重要的意义. 目前,检测Hg^2＋的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)^[4]、原子发射光谱法(AES)^[5]、原子吸收光谱法(AAS)^[6]、电感耦合等离子体质谱法(ICPMS)^[7]等,这些仪器运行成本较高、维护繁琐等缺点限制其广泛应用.

  

  图图式 1 R的合成

  Figure 图式 1. Synthesis of R

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  罗丹明衍生物不仅具有优异的光物理和化学性能,而且螺酰胺环的“OFF-ON”识别金属离子机理,使其成为制备荧光探针的理想结构之一^[9～15]. 螺环状态下的探针溶液无颜色、无荧光发射; 但在金属离子的诱导下,螺酰胺环被打开,并伴随着明显的颜色变化,发出强烈的荧光^[16～18]. 尽管已有一些罗丹明荧光增强型探针分子被用于识别Hg^2＋的报道,但其中许多仍然存在一些不足,例如灵敏度低、易受其它金属离子的干扰(尤其是Cu^2＋,Ni^2＋,Cr^3＋和Fe^3＋)^[19～22],并且较少的一部分能够实现在活细胞中Hg^2＋的成像. 另外,羟乙基肼基团的引入可以增强探针分子与过渡金属离子的键合能力,提高探针分子的选择性^{[23, 24]}. 因此,本论文设计合成了一种新型的罗丹明B类Hg^2＋荧光探针R (Scheme 1). 研究表明,化合物R不仅对Hg^2＋具有高的选择识别能力,且受常见金属离子的干扰较小; 而且,化合物R在MGC-803活细胞中实现了Hg^2＋的成像. 探针化合物R的合成路线如Scheme 1所示.

  近几年,荧光分析法因具有灵敏度高、选择性好、检测方便,并可以对细胞内金属离子实现原位和成像分析等特点,被广泛应用于各种金属离子的检测,成为环境分析和生命科学领域的研究热点之一. 由于自旋轨道耦合效应,Hg^2＋对荧光团具有猝灭作用,通常报道的Hg^2＋荧光探针是荧光猝灭型的,存在检测灵敏度低、背景信号干扰大等缺点^[8].

  1    结果与讨论

  1.1.    分子的设计与合成

  罗丹明氧杂蒽类荧光探针的螺酰胺环独特的开闭环结构是理想的“OFF-ON”荧光开关模型,是设计荧光增强型探针的理想结构. 另外,羟乙基肼基团可以提高探针分子与过渡金属离子的键合能力,增强探针选择性^{[23, 24]}. 因此,本文在罗丹明B结构中引入羟乙基肼基团,设计了目标化合物R. R的合成路线如Scheme 1所示,以罗丹明B为原料,首先肼解为罗丹明B酰肼1,然后与苯基乙二醛缩合反应得到席夫碱2,再经硼氢化钠还原得到新型罗丹明B衍生物R. 该反应条件温和、后处理简便、产物收率高.

  1.2.    化合物R的光谱性能研究

  1.3.    化合物R对细胞中Hg^2＋的荧光成像实验

  在细胞成像实验中,将20 μmol/L探针R溶液加入到育有人体胃癌细胞MGC-803细胞的培养液中,在37 ℃的二氧化碳培养箱中培养20 min,用PBS缓冲溶液洗去细胞外的残余探针R,用荧光显微镜进行观察,细胞没有荧光信号产生(图 8a). 当向上述含有探针R的细胞培养液中加入Hg^2＋(20 μmol/L),并在37 ℃的条件下孵化2.5 h,用PBS缓冲溶液洗去过量的金属离子,再次成像发现活细胞发出了红光的荧光(图 8b),这表明探针R具有良好的细胞渗透性,可以对活细胞内的Hg^2＋进行荧光成像.

  

  图8 R在MGC-803细胞中对Hg^2＋的荧光成像

  Figure 8. Fluorescence images of Hg^2＋ in MGC-803 cells with R

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  1.4.    化合物R的晶体结构

  

  图9 化合物R的单晶结构图

  Figure 9. Single crystal structure of R

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  晶体结构如图 9所示. 从图 9可以看出: 化合物R是由氧杂蒽荧光团与螺内酰胺组成,无对称中心,其中氧杂蒽环与苯并内酰环的夹角为88.6°,近乎垂直.

  1.2.3    不同浓度Hg^2＋对化合物R荧光光谱的影响

  

  图5 R (10 mol/L)中逐渐加入Hg^2＋(0～5.5 equiv.)的荧光发射变化曲线图

  Figure 5. Fluorescence emission spectra of R (10 mol/L) upon titration of Hg^2＋(0～5.5 equiv.)

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  在10 mmol/L HEPES/EtOH (V/V＝4/6,pH＝7.0)溶液中测定了在不同Hg^2＋浓度下化合物R的荧光发射光谱,如图 5所示. 在化合物R的最大发射波长(582 nm)处,随着Hg^2＋浓度的不断增大,溶液的荧光强度也不断的增加,这表明化合物R和Hg^2＋有良好的结合作用.

  进一步的研究结果(如图 6所示)表明,Hg^2＋浓度在5×10^-7～2.5×10^-6mol/L范围内与探针R的荧光强度呈良好的线性关系,曲线方程为y＝-17.9＋69.7x,相关系数R²＝0.99118,表明化合物R可以定量地检测此范围内的Hg^2＋含量.

  

  图6 R的荧光强度随Hg^2＋浓度(5×10^-7～2.5×10^-6mol/L)变化的线性关系图

  Figure 6. Fluorescence intensity of probe R as a function of concentration of Hg^2＋(5×10^-7～2.5×10^-6mol/L)

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  1.2.2    化合物R对金属离子的选择性识别

  进一步考察了其它金属离子和Hg^2＋共存时对Hg^2＋测定的影响. 所有离子的浓度均为20 mol/L,黑色柱状图代表加入不同的金属离子,红色柱状图代表在 Hg^2＋存在时加入不同的金属离子. 从图 4中可以看出,共存离子存在下,探针R对Hg^2＋识别的荧光强度基本保持不变,说明探针R对Hg^2＋识别具有较强的抗干扰能力. 因此,化合物R是一个高选择性的荧光增强型 Hg^2＋探针.

  

  图2 (a)探针R对金属离子的颜色变化及(b)探针R对金属离子的荧光变化

  Figure 2. The colorimetric (a) and fluorometric (b) changes of R (10 mol/L) upon addition of Hg^2＋(50 mol/L) and other cations (50 mol/L) in 10 mmol/L HEPES/EtOH (V/V＝4/6,pH＝7.0) solution

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  图4 其它金属离子和Hg^2＋ (20 mol/L)共存时探针R (10 mol/L)荧光强度的变化

  Figure 4. Fluorescence intensity changes of R (10 mol/L) upon the addition of different metal ions (20 mol/L) in and without the presence of Hg^2＋ (20 mol/L) of different ions reacting to probe R

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  图3 R (10 mol/L)对金属离子(20 mol/L)的选择性

  Figure 3. Fluorescence spectra of probe R (10 mol/L) to different metal ions (20 mol/L)

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  为了测定化合物R对金属离子的识别性能,在10 mmol/L HEPES/EtOH (V/V＝4/6,pH＝7.0)溶液中,通过荧光光谱检测化合物R对金属离子(Hg^2＋、Fe^3＋、Co^2＋、Mg^2＋、Zn^2＋、Al^3＋、Ni^2＋、Cr^3＋、Mn^2＋、Ca^2＋、Li^＋、Cd^2＋和Cu^2＋)的选择性识别,结果如图 2和3所示. 从图 2和3可以看出,在未加入金属离子或者加入Fe^3＋、 Co^2＋、Mg^2＋、Zn^2＋、Al^3＋、Ni^2＋、Cr^3＋、Mn^2＋、Ca^2＋、Li^＋、Cd^2＋和Cu^2＋时,溶液显示无色,几乎没有荧光发射,说明R主要以螺环的形式存在; 而加入Hg^2＋后,在最大发射波长582 nm处荧光发射明显增强,溶液的颜色由无色变成粉红色,这可能是由于Hg^2＋诱导电子发生转移导致螺环结构开环. 由此可见,裸眼即可定性的检测溶液中是否含有Hg^2＋.

  1.2.4    化合物R与Hg^2＋的结合方式

  

  图7 R和Hg^2＋ ([R]＋[Hg^2＋]＝20 μmol/L)的Job曲线

  Figure 7. Job’s plot of R and Hg^2＋([R]＋[Hg^2＋]＝20 μmol/L)

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  图图式 2 R识别Hg^2＋的可能机理

  Figure 图式 2. Proposed mechanisms for Hg^2＋-promoted fluorescence enhancement of probe R

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  为了进一步确定探针R与Hg^2＋之间的结合比,采用等物质的量连续变化法(Job’s Plot),使探针R与Hg^2＋的总浓度保持为20 μmol/L,随着Hg^2＋摩尔分数的不断改变,体系的荧光强度在582 nm处随之变化,如图 7所示. 从图 7可以看出,当Hg^2＋的摩尔分数为0.5时,探针R和Hg^2＋体系在582 nm处出现最大的荧光强度,表明探针化合物R和Hg^2＋的络合比为1:1. 根据实验结果和文献报道^{[23, 24, 26, 27]},推测探针R识别Hg^2＋的可能机理:Hg^2＋作为催化剂,先与探针R形成络合物,然后被水解为罗丹明B,如Scheme 2所示. 探针R溶液中加入过量 Hg^2＋的ESI-MS图验证了这一推测,m/z 935.93,957.92,443.65分别为[R＋Hg^2＋＋2NO₃^-＋MeOH＋H^＋],[R＋Hg^2＋＋2NO₃^-＋MeOH＋Na^＋]和罗丹明B的离子峰.

  1.2.1    pH对化合物R荧光光谱的影响

  溶液pH 的不同会影响螺酰胺环的存在形式^[25],因此,考察不同pH值溶液对化合物R荧光强度的影响是十分必要的. 我们以λ_ex＝530 nm为激发波长,在10 mmol/L HEPES/EtOH (V/V＝4/6)溶液中测定了不同pH值溶液对探针化合物R及R＋Hg^2＋荧光强度的影响,结果如图 1所示. pH在5～9的范围内,探针R基本没有荧光响应,主要以螺酰胺环的形式存在. 在pH为5～7的范围内,R＋Hg^2＋的荧光强度几乎不变,可以利用罗丹明衍生物的“OFF-ON”机理检测Hg^2＋. 而pH在7～9之间,荧光强度随pH的增强而减小,这可能是碱性条件下,Hg^2＋会形成Hg(OH)₂,从而减少了其与探针R的作用. 由此可见,在pH为5～7的范围内,探针R 对Hg^2＋的检测基本不受pH的影响,这有利于其在细胞及生物体内进一步的应用^[18].

  

  图1 pH值对R (10 mol/L)和R (10 mol/L)＋Hg^2＋(20 mol/L)荧光强度的影响

  Figure 1. Fluorescent intensity of free R (10 mol/L) and in the presence of Hg^2＋(20 mol/L) with different pH

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  2    结论

  本文以罗丹明B为荧光基团,羟乙基肼片段为识别基团设计合成了一种新型的Hg^2＋荧光探针化合物R,并对其进行了结构表征. 在10 mmol/L HEPES/EtOH (V/V＝4/6,pH＝7.0)溶液中,探针R可以选择性识别Hg^2＋. 在Hg^2＋浓度(5×10^-7～2.5×10^-6mol/L)范围内,其荧光强度和Hg^2＋浓度具有良好的线性关系,可在此范围内定量地检测Hg^2＋的含量. 另外,R在MGC-803活细胞中实现了Hg^2＋的荧光成像,对生物体活细胞内Hg^2＋检测具有一定的指导意义.

  3    实验部分

  3.1.    仪器与试剂

  AVANCE II 400 MHz核磁共振仪(德国Brucker公司),EA-1112A元素分析仪(意大利Thermos公司),SATURN 724＋CCD单晶X射线衍射仪(日本理学公司),Thermo LXQ液相色谱离子阱质谱联用仪(美国Thermo公司),CaryEclipse荧光分光光度计(澳大利亚瓦里安有限公司),数字显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司).

  所有试剂均为市售分析纯,实验所用的水均为去离子水.

  3.2.    化合物的合成

  3.3.    化合物R的晶体结构

  将探针R溶解在二氯甲烷和正己烷混合溶液中,室温放置,得到适合X射线单晶衍射测试的无色针状晶体. 化合物R的分子式为C₃₆H₄₀N₄O₃ (M_r＝576.72),晶体结构属于三斜晶系,P1空间群,晶胞参数 a＝9.2223(18) ,b＝11.074(2) ,c＝15.590(3) ,α＝85.28(3)°,β＝78.64(3)°,γ＝75.28(3)°,V＝1508.9(5) ³,Z＝2,D_c＝1.269 Mg/m³,＝0.081 mm^-1,F(000)＝616; 光源: Mo Kα射线(λ＝0.71073 nm),测试温度293(2) K,最终偏离因子: R₁＝0.0764,wR₂＝0.1486; 偏离因子: R₁＝0.1140,wR₂＝0.1671,扫描范围: 3.15°～26.04°,GOF＝1.115; 衍射点/独立衍射点: 5765/392. 精修方法: 基于F²的全矩阵最小二乘法. 数据存于英国剑桥晶体结构数据库中心,CCDC号为1444931.

  3.4.    荧光光谱的测定方法

  将探针R用乙醇配成 1×10^-3mol/L 的溶液,金属盐用去离子水配成1×10^-3mol/L的溶液. 移取探针R溶液0.1 mL置于10 mL容量瓶中,移取金属盐溶液0.2 mL加入容量瓶中,再用10 mmol/L HEPES/EtOH (V/V＝4/6,pH＝7.0)缓冲溶液定容,震荡使其混合均匀,得到测试溶液中探针浓度为10 μmol/L,金属盐溶液浓度为20 μmol/L. 进而测定其荧光发射光谱(选择性、竞争性、浓度梯度、Job曲线等)及pH对探针分子荧光发射光谱的影响,pH由1 mol/L HCl和NaOH调节.

  测试条件: 在室温下,将待测溶液装入1 cm×1 cm×4 cm的石英比色皿中,激发波长(λ_ex)为530 nm,扫描540～750 nm范围内的荧光光谱.

  辅助材料(Supporting Information) 席夫碱2的¹H NMR谱图和ESI-MS谱图,化合物R的¹H NMR谱图、¹³C NMR谱图、ESI-MS谱图,探针R＋Hg^2＋的ESI-MS图,以及化合物R的部分键长(Å)和键角(°)数据. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  3.2.1    罗丹明酰肼(1)的合成

  参考文献^[28]的方法合成罗丹明酰肼(1),浅粉色固体,收率95%,m.p. 175～176 ℃(文献值^[28] m.p. 176～177 ℃).

  3.2.2    席夫碱(2)的合成

  向25 mL圆底烧瓶中加入1 (2.28 g,5.0 mmol),一水合苯基乙二醛(1.02 g,6.0 mmol)和无水甲醇(30 mL),搅拌回流3 h后,过滤、干燥,得席夫碱(2),黄色固体,收率85%. m.p. 224～225 ℃; ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ: 8.40 (s,1H),7.89～8.04 (m,3H),7.17～7.59 (m,5H),6.28～6.54 (m,6H),3.35 (q,J＝6.8 Hz,8H),1.18 (t,J＝6.8 Hz,12H); ESI-MS m/z: 573.58 (M＋H^＋). Anal. calcd for C₃₆H₃₆N₄O₃: C 75.50,H 6.34,N 9.78; found C 75.44,H 6.48,N 9.72.

  3.2.3    荧光探针R的合成

  向25 mL圆底烧瓶中加入席夫碱2 (0.57 g,1.0 mmol)和四氢呋喃(10 mL),室温搅拌,将硼氢化钠(0.04 g,1.0 mmol)分批加入到上述反应液中,TLC监测反应进程. 反应完毕后,除去溶剂,向其中加入20 mL水,二氯甲烷萃取,合并有机相,无水硫酸钠干燥,减压除去溶剂,残余的固体经乙酸乙酯/石油醚重结晶得罗丹明B衍生物R,白色固体,收率82%. m.p. 215～216 ℃; ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ: 7.98 (d,J＝6.8 Hz,1H),7.53～7.56 (m,2H),7.11～7.21 (m,6H),6.29～6.66 (m,6H),5.46 (s,1H),4.51～4.69 (m,2H),3.36 (q,J＝7.2 Hz,8H),2.47～2.49 (m,2H),1.18 (t,J＝7.2 Hz,12H); ¹³C NMR (100 MHz,CDCl₃) δ: 11.3,43.1,58.5,64.9,69.2,96.7,103.7,106.8,122.5,123.0,126.6,127.3,129.3,131.3,134.5,141.7,141.8,147.8,151.9,151.7,164.4; ESI-MS m/z: 577.63 (M＋H^＋). Anal. calcd for C₃₆H₄₀N₄O₃: C 74.97,H 6.99,N 9.71; found C 74.92,H 6.88,N 9.77.

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  图式 1  R的合成

  Scheme 1  Synthesis of R

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  图 1  pH值对R (10 mol/L)和R (10 mol/L)＋Hg^2＋(20 mol/L)荧光强度的影响

  Figure 1  Fluorescent intensity of free R (10 mol/L) and in the presence of Hg^2＋(20 mol/L) with different pH

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  图 2  (a)探针R对金属离子的颜色变化及(b)探针R对金属离子的荧光变化

  Figure 2  The colorimetric (a) and fluorometric (b) changes of R (10 mol/L) upon addition of Hg^2＋(50 mol/L) and other cations (50 mol/L) in 10 mmol/L HEPES/EtOH (V/V＝4/6,pH＝7.0) solution

  The two photos were obtained in normal light (a) and upon at 365 nm using UV lamp (b),respectively

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  图 3  R (10 mol/L)对金属离子(20 mol/L)的选择性

  Figure 3  Fluorescence spectra of probe R (10 mol/L) to different metal ions (20 mol/L)

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  图 4  其它金属离子和Hg^2＋ (20 mol/L)共存时探针R (10 mol/L)荧光强度的变化

  Figure 4  Fluorescence intensity changes of R (10 mol/L) upon the addition of different metal ions (20 mol/L) in and without the presence of Hg^2＋ (20 mol/L) of different ions reacting to probe R

  From left to right 20 µmol/L of (1) Fe^3＋,(2) Co^2＋,(3) Mg^2＋,(4) Zn^2＋,(5) Al^3＋,(6) Na^＋,(7) Ni^2＋,(8) Cr^3＋,(8) Mn^2＋,(10) Ca^2＋,(11) Li^＋,(12) Cd^2＋,(13) Cu^2＋,(14) Hg^2＋ (black bars: R with different ions,red bars: R with Hg^2＋and other metal ions)

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  图 5  R (10 mol/L)中逐渐加入Hg^2＋(0～5.5 equiv.)的荧光发射变化曲线图

  Figure 5  Fluorescence emission spectra of R (10 mol/L) upon titration of Hg^2＋(0～5.5 equiv.)

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  图 6  R的荧光强度随Hg^2＋浓度(5×10^-7～2.5×10^-6mol/L)变化的线性关系图

  Figure 6  Fluorescence intensity of probe R as a function of concentration of Hg^2＋(5×10^-7～2.5×10^-6mol/L)

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  图 7  R和Hg^2＋ ([R]＋[Hg^2＋]＝20 μmol/L)的Job曲线

  Figure 7  Job’s plot of R and Hg^2＋([R]＋[Hg^2＋]＝20 μmol/L)

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  图式 2  R识别Hg^2＋的可能机理

  Scheme 2  Proposed mechanisms for Hg^2＋-promoted fluorescence enhancement of probe R

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  图 8  R在MGC-803细胞中对Hg^2＋的荧光成像

  Figure 8  Fluorescence images of Hg^2＋ in MGC-803 cells with R

  (a) Fluorescence images of MGC-803 cells treated with R (20 μmol/L); (b) Fluorescence images of MGC-803 cells incubated with R (20 μmol/L) for 20 min,and then further incubated with Hg^2＋ (20 μmol/L) for 2.5 h

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  图 9  化合物R的单晶结构图

  Figure 9  Single crystal structure of R

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