新型含氟甲基吡唑结构的氰基丙烯酸酯类化合物的合成及其生物活性

引用本文: 石玉军, 李阳, 方源, 叶林玉, 陈佳, 戴红. 新型含氟甲基吡唑结构的氰基丙烯酸酯类化合物的合成及其生物活性[J]. 有机化学, 2016, 36(6): 1431-1437. doi: 10.6023/cjoc201512019 shu

Citation: Shi Yujun, Li Yang, Fang Yuan, Ye Linyu, Chen Jia, Dai Hong. Synthesis and Bioactivity of Novel Cyanoacrylate Derivatives Containing Fluoride Methyl Pyrazole Moiety[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2016, 36(6): 1431-1437. doi: 10.6023/cjoc201512019 shu

新型含氟甲基吡唑结构的氰基丙烯酸酯类化合物的合成及其生物活性

石玉军 ^{a,b,*,
,} ,
李阳 ^a, ,
方源 ^a, ,
叶林玉 ^b, ,
陈佳 ^b, ,
戴红 ^{b,*,
,}

a.
江苏科技大学环境与化学工程学院镇江 212003
b.
南通大学化学化工学院南通 226019

通讯作者: 石玉军,E-mail: yjshi2015@163.com; 戴红,E-mail: daihong_2001@aliyun.com

基金项目:
国家自然科学基金 Nos.21202089,21372135

江苏省“六大人才高峰” Nos. 2011-SWYY-009, 2013-SWYY-013

和南通市科技计划 Nos.AS2014011,CP12013002

摘要: 为了从氰基丙烯酸酯类衍生物中寻找新的活性化合物, 采用活性亚结构拼接方法, 设计并合成了17个未见文献报道的新型含氟甲基吡唑结构的氰基丙烯酸酯类化合物. 利用¹H NMR、¹³C NMR和元素分析对所制备的化合物的结构进行了表征. 此外, 利用MS证实了化合物7b、7f、7j和7o的结构. 初步的生物活性测试结果显示, 部分目标化合物表现出明显的抗肿瘤活性.

关键词:

English

Synthesis and Bioactivity of Novel Cyanoacrylate Derivatives Containing Fluoride Methyl Pyrazole Moiety

Shi Yujun ^{a,b,*,
,} ,
Li Yang ^a, ,
Fang Yuan ^a, ,
Ye Linyu ^b, ,
Chen Jia ^b, ,
Dai Hong ^{b,*,
,}

a.
School of Environmental and Chemical Engineering, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212003
b.
College of Chemistry and Chemical Engineering, Nantong University, Nantong 226019

Corresponding author: Shi Yujun, yjshi2015@163.com; Dai Hong, daihong_2001@aliyun.com

Received Date: 14 December 2015
Revised Date: 07 January 2016
Fund Project:
Project supported by the National Natural Science Foundation of China

the Research Foundation of the Six People Peak of Jiangsu Province

and the Science and Technology Project Fund of Nantong City

Abstract: In order to find novel cyanoacrylate lead compounds, 17 new cyanoacrylate compounds bearing fluoride methyl pyrazole moiety were synthesized by the method of active substructure combination. They were structurally confirmed by ¹H NMR, ¹³C NMR and elemental analysis. The structures of compounds 7b, 7f, 7j and 7o were also tested through MS technique. Preliminary bioassay data showed that some of the target compounds displayed important anti-tumor activities.

Key words:

氰基丙烯酸酯类化合物是一类具有重要生物活性的物质,以其良好的杀菌、杀虫、除草、植物生调节、抗植物病毒、抗肿瘤等活性而一直倍受药物化学工作者的青睐,氰基丙烯酸酯类衍生物在药物研究和生物学方面发挥着越来越重要的作用^[1～12]. 近年来不少研究表明,在氰基丙烯酸酯分子结构中引入杂环单元往往会改善化合物的生物活性. 如Zhao等^[13]合成的含噁唑、喹啉杂环结构的氰基丙烯酸酯类衍生物对黄瓜子叶生根表现出良好的促进作用,Ouyang等^[14]报道的含吡啶杂环取代的氰基丙烯酸酯类化合物对人前列腺癌(PC3)和人表皮癌(A431)细胞具有较好的抑制活性. 另外,吡唑类化合物作为杂环体系中的重要一员,也以其广谱的生物活性及较好的环境相容性而引起人们极大的研究兴趣^[15～20]. 许多含吡唑基化合物在人类保健中有着广泛的应用,如消炎镇痛药安乃近、环氧合酶-2选择抑制剂塞来考昔等^{[21, 22]}. 此外,由于二氟甲基和三氟甲基具有强吸电子性、亲脂性和稳定的C—F键等特性,将含氟甲基单元引入到药物分子中能显著改善药物的理化性质,如提高稳定性、降低毒性、扩大生物活性谱等^[23～26],在新药创制研究中扮演着十分重要的角色,如对精神抑郁症具有治疗作用的药物Prozac、对Ⅱ型糖尿病有治疗效果的药物Januvia等^[27]. 鉴于此,为了进一步从氰基丙烯酸酯类化合物中寻找高活性的先导化合物,根据生物活性叠加原理,将吡唑片段引入到氰基丙烯酸酯分子结构中,同时引入重要的含氟甲基基团,设计并制备了一系列未见文献报道的新型含氟甲基吡唑结构的氰基丙烯酸酯类衍生物. 所合成的化合物结构均经¹H NMR、¹³C NMR和元素分析方法确认. 通过MS等方法对部分目标化合物进行了进一步的结构表征. 初步的生物活性试验结果表明,部分目标化合物具有较好的抗肿瘤作用. 其合成路线如Scheme 1所示.

图图式1 目标化合物7的合成路线

Figure 图式1. The synthetic route of title compounds 7

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1 结果与讨论

1.1 化合物的合成

表1 不同反应条件对目标化合物7b合成产率的影响 Table1. Effects of reaction conditions on the synthesis of the target compound 7b

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Entry	Solvent	Reaction condition	Yield/%
1	C₂H₅OH	Reflux for 2 h	56
2	CH₃CN	Reflux for 2 h	45
3	DMF	Room temperature for 2 h	70
4	DMSO	Room temperature for 2 h	41

表1 不同反应条件对目标化合物7b合成产率的影响
Table1. Effects of reaction conditions on the synthesis of the target compound 7b

目标化合物7是通过含氟甲基吡唑酰肼3与不同的氰基丙烯酸酯6的缩合反应制备而成. 以目标化合物7b的合成为研究对象,摸索了不同的反应条件对其反应收率的影响. 从表 1可以看出,选用DMF作溶剂,室温搅拌的方法,化合物7b的收率为70%,明显高于其它几种方法的合成收率. 实验过程中发现该方法反应条件比较温和,反应物溶解性好,后处理也较为简便. 最终选用该法成功地合成出了其它的含氟甲基吡唑结构的氰基丙烯酸酯类化合物.

1.2 目标化合物的图谱剖析

分别以目标化合物7b、7n的核磁氢谱和核磁碳谱数据为例进行解析. 对于化合物7b,δ在 8.87 处的单峰为吡唑环5-位氢的吸收峰; δ 6.93～7.32间的多重峰为苯环上五个氢的吸收峰; δ 4.58处的三重峰为与酯基相连的CH₂上两个氢的吸收峰; δ 4.28处的三重峰为与苯氧基相连的CH₂上两个氢的吸收峰; δ 4.03处的单峰对应于吡唑烷环NCH₃上三个氢的吸收峰; δ 2.50处的单峰为与双键相连的SCH₃上三个氢的吸收峰; δ 66.2处的峰为与苯环相连的OCH₂碳原子的信号峰; δ 62.4处的峰为与羰基相连的OCH₂上亚甲基碳原子的信号峰; δ 40.1处的峰为吡唑环上与N相连CH₃碳原子的信号峰; δ 13.1处的峰对应于SCH₃碳原子的信号峰.对于化合物7n,δ 8.76处的单峰为吡唑环5-位氢的吸收峰; δ 7.60处的宽峰为NHNH上两个氢的吸收峰; δ 7.30处的三重峰为CHF₂上一个氢的吸收峰; δ 7.09处的双重峰为苯环上两个氢的吸收峰; δ 6.87处的双重峰为苯环上两个氢的吸收峰; δ 4.22～4.49间的多重峰分别为与酯基和苯氧基相连的两个CH₂上四个氢的吸收峰; δ 4.00处的单峰对应于吡唑烷环NCH₃上三个氢的吸收峰; δ 2.51处的单峰为与双键相连的SCH₃上三个氢的吸收峰; δ 2.23处的单峰对应于苯环4-位CH₃上三个氢的吸收峰; δ 65.8处的峰为与苯环相连的OCH₂碳原子的信号峰; δ 62.0 处的峰为与羰基相连的OCH₂上亚甲基碳原子的信号峰; δ 39.5处的峰为吡唑环上与N相连CH₃碳原子的信号峰; δ 20.1处的峰为苯环4-位CH₃碳原子的信号峰; δ 12.7处的峰对应于SCH₃碳原子的信号峰.

1.3 化合物的抗肿瘤活性

表2 目标化合物7a～7q的体外抗肿瘤活性 Table2. Cytotoxicity of target compounds 7a～7q at 20 μmol/L

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Compd.	Percentage of inhibition/%
Compd.	Hela	A549	HT29	SGC7901	HepG2
7a	0	0	0	0	0
7b	28	39	18	25	7
7c	15	39	15	15	28
7d	28	100	19	28	25
7e	16	36	17	18	5
7f	100	100	58	0	73
7g	72	79	0	92	32
7h	100	28	0	28	20
7i	0	87	0	0	0
7j	18	34	18	29	0
7k	48	77	0	0	28
7l	45	100	0	20	17
7m	26	81	0	58	8
7n	0	0	0	0	0
7o	18	92	57	95	68
7p	0	92	0	0	0
7q	8	0	0	0	15
Taxinol	100	100	100	100	100

表2 目标化合物7a～7q的体外抗肿瘤活性
Table2. Cytotoxicity of target compounds 7a～7q at 20 μmol/L

目标化合物7a～7q对人宫颈癌(Hela)、人肺癌(A549)、人结肠癌(HT29)、人胃癌(SGC7901)和人肝癌(HepG2)细胞株的体外抗肿瘤活性结果如表 2所示. 从表 2可以看出,在测试浓度为20 μmol/L时,部分目标化合物对五种癌细胞表现出一定的抑制效果,但无明显的规律.当R¹=CF₃时,甲基取代物7a对五种癌细胞均未显示出抑制活性; 在取代苯基化合物中,2,4-Cl₂取代物7f,3,4-Cl₂取代物7g和2,4-(CH₃)₂取代物7h对Hela细胞的抑制率相对较高,分别为100%,72%和100%,其中化合物7f和7h与对照药紫杉醇的活性相当; 4-Cl取代物7d,化合物7f和7g对A549细胞的抗肿瘤作用相对较好,其抑制率分别为100%,100%和79%,其中化合物7d和7f与对照药紫杉醇的活性接近; 此外,化合物7g对SGC7901细胞的抑制率达到92%,化合物7f对HepG2细胞的抑制率相对较高,为73%. 当R¹=CHF₂时,甲基取代物7i对A549细胞的抑制率达87%,在取代苯基化合物中,2-Cl取代物7k,4-Cl取代物7l,4-OCH₃取代物7m,2,4-Cl₂取代物7o和2,4-(CH₃)₂取代物7p对A549细胞的抑制活性相对较高,分别为77%,100%,81%,92%和92%; 其中化合物7l对A549细胞的抑制效果与对照药紫杉醇相近; 另外,化合物7o对SGC7901和HepG2细胞的抑制效果相对较好,其抑制率分别为95%和68%. 从以上分析数据可以看出,化合物7f和7o对所测试癌细胞的抑制效果相对较高,对HepG2细胞进行了进一步的抗肿瘤活性研究. 其试验结果表明化合物7f和7o对HepG2细胞的IC₅₀值分别为1.85和0.06 μmol/L,尤其化合物7o要高于对照药紫杉醇的活性(IC₅₀=1.34 μmol/L). 该类型化合物的结构衍生与抗肿瘤活性研究正在进行中.

2 结论

本文采用活性基团拼接方法,成功制备了17个新型含氟甲基吡唑结构的氰基丙烯酸酯类化合物. 初步的体外抗肿瘤活性测试结果显示,部分目标化合物对人宫颈癌、人肺癌、人结肠癌、人胃癌或人肝癌细胞具有一定的抗肿瘤作用,其中化合物7f和7o对所测试癌细胞的抑制活性相对较好,具有进一步研究的价值. 这为今后进一步从事氰基丙烯酸酯类衍生物的结构优化与生物活性研究提供了重要的实验数据.

3 实验部分

3.1 仪器与试剂

X-4型数字显示熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司),温度计未经校正; Yanaco-CHN CORDER MT-3自动元素分析仪; Bruker AM-400型核磁共振仪,以CDCl₃或DMSO-d₆为溶剂,TMS为内标; LCQ-Advantage型质谱仪; 柱层析硅胶为H型(青岛海洋化工厂,200～300目). 所用试剂均为分析纯. 中间体1参照文献^[28]方法制备,含氟甲基吡唑中间体2的合成方法参照文献^[29]进行,中间体氰基乙酸-2-甲(取代苯)氧基乙酯(5)和中间体2-氰基-3,3-二甲硫基丙烯酸取代酯(6)参照文献^[30]方法合成.

3.2 3-三氟甲基(二氟甲基)-1-甲基吡唑-4-酰肼(3)的合成

以二氟甲基取代物的合成为例: 在一250 mL反应瓶中,加入10 mmol中间体2及60 mL乙醇,室温搅拌下向其中滴加60 mmol的80%水合肼. 滴毕,将反应混合物缓慢升温至回流. TLC跟踪,待原料点消失后停止加热. 稍稍冷却后,析出大量白色固体,抽滤,所得固体用无水乙醇重结晶得白色固体,产率62%. m.p. 152～154 ℃; ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ: 3.96 (s,3H,NCH₃),6.84 (t,J=54.4 Hz,1H,CHF₂),7.55 (s,1H,NH),7.96 (s,1H,pyrazole-H). Anal. calcd for C₆H₈F₂N₄O: C 37.90,H 4.24,N 29.46; found C 37.72,H 4.36,N 29.63. 采用类似的方法合成了三氟甲基取代物.

3.3 目标化合物7的合成

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸(2-甲氧基)乙酯(7a): 白色固体,产率58%. m.p. 194～195 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆) δ: 2.51 (s,3H,SCH₃),3.30 (s,3H,OCH₃),3.62 (t,J=4.8 Hz,2H,CH₂),4.03 (s,3H,NCH₃),4.31 (t,J=4.4 Hz,2H,CH₂),7.60 (s,2H,NHNH),8.88 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆) δ: 13.1,40.0,58.6,62.9,70.4,92.1,112.2,120.1,122.2,139.8,154.5,155.3,160.7,162.9. Anal. calcd for C₁₄H₁₆F₃N₅O₄S: C 41.28,H 3.96,N 17.19; found C 41.43,H 3.81,N 17.02.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-二氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(4-甲基苯氧基)]乙酯(7n): 白色固体,产率56%. m.p. 178～180 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO- d₆) δ: 2.23 (s,3H,ArCH₃),2.51 (s,3H,SCH₃),4.00 (s,3H,NCH₃),4.22～4.49 (m,4H,2×CH₂),6.87 (d,J=8.4 Hz,2H,ArH),7.09 (d,J=8.0 Hz,2H,ArH),7.30 (t,J=53.6 Hz,1H,CHF₂),7.60 (brs,2H,NHNH),8.76 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆)δ: 12.7,20.1,39.5,62.0,65.8,91.4,109.8,111.9,112.1,114.5,129.5,129.8,138.2,154.0,154.9,156.1,161.5,162.3. Anal. calcd for C₂₀H₂₁F₂N₅O₄S: C 51.61,H 4.55,N 15.05; found C 51.80,H 4.38,N 14.93.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-二氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸(2-苯氧基)乙酯(7j): 白色固体,产率73%. m.p. 181～183 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆) δ: 2.51 (s,3H,SCH₃),4.00 (s,3H,NCH₃),4.28～4.52 (m,4H,2×CH₂),6.91～7.00 (m,3H,ArH),7.17～7.44 (m,3H,ArH and CHF₂),8.76 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆)δ: 13.2,40.0,62.5,66.2,91.9,110.3,112.4,114.9,11 5.1,121.3,130.0,138.6,154.5,155.4,158.7,162.0,162.8; MS (ESI) m/z: 452 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₁₉H₁₉F₂N₅O₄S: C 50.55,H 4.24,N 15.51; found C 50.72,H 4.08,N 15.33.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-二氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸(2-甲氧基)乙酯(7i): 白色固体,产率56%. m.p. 197～198 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆)δ: 2.51 (s,3H,SCH₃),3.30 (s,3H,OCH₃),3.62 (t,J=4.4 Hz,2H,CH₂),3.99 (s,3H,NCH₃),4.29 (t,J=4.4 Hz,2H,CH₂),7.30 (t,J=53.6 Hz,1H,CHF₂),8.74 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆)δ: 13.1,39.9,58.6,62.9,70.3,91.9,107.9,110.3,112.6,138.6,154.5,155.3,161.9,162.9. Anal. calcd for C₁₄H₁₇F₂N₅O₄S: C 43.18,H 4.40,N 17.99; found C 43.02,H 4.59,N 18.16.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(2,4-二甲基苯氧基)]乙酯(7h): 白色固体,产率72%. m.p. 206～208 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆)δ: 2.11 (s,3H,ArCH₃),2.19 (s,3H,ArCH₃),2.49 (s,3H,SCH₃),4.02 (s,3H,NCH₃),4.21 (t,J=4.4 Hz,2H,CH₂),4.53 (t,J=4.4 Hz,2H,CH₂),6.82～6.93 (m,3H,ArH),7.62 (brs,2H,NHNH),8.89 (s,1H,pyrazole- H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆)δ: 13.1,16.3,20.6,40.0,62.5,66.6,92.0,100.0,112.0 ,112.1,126.3,127.5,129.6,131.7,139.9,154.5,154.6,154.7,155.4,160.8,162.9. Anal. calcd for C₂₁H₂₂F₃N₅O₄S: C 50.70,H 4.46,N 14.08; found C 50.53,H 4.65,N 14.27.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(2-氯苯氧基)]乙酯(7c): 白色固体,产率66%. m.p. 199～200 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆)δ: 2.50 (s,3H,SCH₃),4.03 (s,3H,NCH₃),4.36 (t,J=4.0 Hz,2H,CH₂),4.56 (t,J=4.0 Hz,2H,CH₂),6.95～7.43 (m,4H,ArH),8.88 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆) δ: 13.1,40.0,62.2,67.4,92.0,112.1,114.7,122.1,122.4,128.8,130.5,139.9,154.1,154.6,155.3,160.8,162.8. Anal. calcd for C₁₉H ₁₇ClF₃N₅O₄S: C 45.29,H 3.40,N 13.90; found C 45.13,H 3.58,N 13.75.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(2,4-二氟苯氧基)]乙酯(7e): 白色固体,产率65%. m.p. 194～195 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆)δ: 2.50 (s,3H,SCH₃),4.03 (s,3H,NCH₃),4.31～4.52 (m,4H,2×CH₂),6.99～7.03 (m,1H,ArH),7.23～7.30 (m,2H,ArH),8.88 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆) δ: 13.1,40.0,62.4,68.3,91.9,105.1,105.3,105.6,111.2,111.5,1 12.1,116.9,139.9,143.3,154.5,155.4,160.8,162.9. Anal. calcd for C₁₉H₁₆F₅N₅O₄S: C 45.15,H 3.19,N 13.86; found C 45.02,H 3.38,N 14.03.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-二氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(4-氯苯氧基)]乙酯(7l): 白色固体,产率65%. m.p. 195～197 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆) δ: 2.50 (s,3H,SCH₃),4.00 (s,3H,NCH₃),4.28 (t,J=4.4 Hz,2H,CH₂),4.50 (t,J=4.4 Hz,2H,CH₂),7.01 (d,J=8.8 Hz,2H,ArH),7.17～7.44 (m,3H,ArH and CHF₂),7.60 (brs,1H,NH),8.75 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆)δ: 13.2,40.0,62.3,66.7,91.9,108.0,110.3,112.3,116.9,125.0,129.8,138 .7,154.5,155.4,157.6,162.0,162.8. Anal. calcd for C₁₉H₁₈ClF₂- N₅O₄S: C 46.97,H 3.73,N 14.41; found C 46.80,H 3.91,N 14.59.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-二氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(2,4-二甲基苯氧基)]乙酯(7p): 白色固体,产率67%. m.p. 188～190 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆)δ: 2.11 (s,3H,ArCH₃),2.19 (s,3H,ArCH₃),2.51 (s,3H,SCH₃),4.00 (s,3H,NCH₃),4.22 (t,J=4.0 Hz,2H,CH₂),4.52 (t,J=4.0 Hz,2H,CH₂),6.82～6.93 (m,3H,ArH),7.30 (t,J=53.6 Hz,1H,CHF₂),7.62 (brs,2H,NHNH),8.77 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆)δ: 13.2,16.3,20.6,40.0,62.5,66.6,91.9,108.0,110.3,112.0,112.3,126.3,127.5,129.6,131.7,138.7,154.5,154.7,155.4,162.0,162.9. Anal. calcd for C₂₁H₂₃F₂N₅O₄S: C 52.60,H 4.83,N 14.61; found C 52.43,H 5.02,N 14.79.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-二氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(2,4-二氯苯氧基)]乙酯(7o): 白色固体,产率76%. m.p. 180～181 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆)δ: 2.51 (s,3H,SCH₃),4.00 (s,3H,NCH₃),4.39 (t,J=4.4 Hz,2H,CH₂),4.55 (t,J=4.4 Hz,2H,CH₂),7.17～7.58 (m,5H,ArH and CHF₂),8.79 (s,1H,pyrazole- H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆)δ: 13.2,40.0,62.0,67.9,91.9,110.3,112.3,112.6,115.9,123.2,125.3,128.6,129.8,138.7,153.3,154.6,155.3,162.0, 162.7; MS (ESI) m/z: 518 [M-H]^-. Anal. calcd for C₁₉H₁₇Cl₂F₂N₅O₄S: C 43.86,H 3.29,N 13.46; found C 43.72,H 3.43,N 13.61.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(3,4-二氯苯氧基)]乙酯(7g): 白色固体,产率64%. m.p. 199～200 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆)δ: 2.49 (s,3H,SCH₃),4.02 (s,3H,NCH₃),4.33 (t,J=4.0 Hz,2H,CH₂),4.51 (t,J=4.0 Hz,2H,CH₂),7.00～7.53 (m,3H,ArH),8.87 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆) δ: 13.1,40.0,62.2,67.2,91.9,112.1,116.2,117.1,123.2,131.5,132.1,139.9,154.5,155.3,158.2,160.7,162.7. Anal. calcd for C₁₉H₁₆Cl₂F₃- N₅O₄S: C 42.39,H 3.00,N 13.01; found C 42.23,H 3.18,N 13.15.

在一50 mL圆底烧瓶中,加入3 mmol中间体3、3 mmol 2-氰基-3,3-二甲硫基丙烯酸取代酯(6)及20 mL DMF. 加毕,将反应液室温搅拌,TLC跟踪反应进程. 反应结束后,向反应液中加入50 mL水,用80 mL乙酸乙酯萃取,无水硫酸镁干燥. 抽滤,脱溶,残余物经柱层析[V(石油醚):V(乙酸乙酯)=2:1]分离得到目标化合物7a～7q.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(4-氯苯氧基)]乙酯(7d): 白色固体,产率68%. m.p. 210～211 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆)δ: 2.48 (s,3H,SCH₃),4.05 (s,3H,NCH₃),4.30～4.52 (m,4H,2×CH₂),7.01～7.36 (m,4H,ArH),8.90 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆) δ: 13.1,40.0,62.3,66.7,91.9,112.2,116.9,119.8,122.5,125.0,129.7,140.0,154.5,155.3,157.6,160.7,162.8. Anal. calcd for C₁₉H₁₇ClF₃N₅O₄S: C 45.29,H 3.40,N 13.90; found C 45.46,H 3.23,N 13.71.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-二氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(2,4,6-三氯苯氧基)]乙酯(7q): 白色固体,产率66%. m.p. 189～191 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆) δ: 2.51 (s,3H,SCH₃),4.00 (s,3H,NCH₃),4.22 (t,J=4.0 Hz,2H,CH₂),4.52 (t,J=4.0 Hz,2H,CH₂),6.82～6.93 (m,3H,ArH),7.30 (t,J=53.6 Hz,1H,CHF₂),7.62 (brs,2H,NHNH),8.77 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆)δ: 13.2,40.0,63.2,72.1,91.9,100.0,110.3,112.4,112.7,129.4,129.5,129.8,138.7,150.3,154.6,155.3,162.0,162.8. Anal. calcd for C₁₉H₁₆- Cl₃F₂N₅O₄S: C 41.13,H 2.91,N 12.62; found C 41.30,H 2.73,N 12.51.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-二氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(2-氯苯氧基)]乙酯(7k): 白色固体,产率62%. m.p. 182～184 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆)δ: 2.50 (s,3H,SCH₃),4.00 (s,3H,NCH₃),4.36～4.55 (m,4H,2×CH₂),6.95～6.99 (m,1H,ArH),7.17～7.44 (m,4H,Ar-H and CHF₂),7.61 (brs,1H,NH),8.75 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆) δ: 13.2,40.0,62.1,67.4,91.9 ,110.3,112.3,112.6,114.7,122.1,122.3,128.8,130.5,138.7,154.1,154.6,155.3,162.0,162.7. Anal. calcd for C₁₉H₁₈ClF₂N₅O₄S: C 46.97,H 3.73,N 14.41; found C 47.09,H 3.62,N 14.25.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸(2-苯氧基)乙酯(7b): 白色固体,产率70%. m.p. 199～201 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆)δ: 2.50 (s,3H,SCH₃),4.03 (s,3H,NCH₃),4.28 (t,J=4.0 Hz,2H,CH₂),4.53 (t,J=4.0 Hz,2H,CH₂),6.93～7.32 (m,5H,ArH),8.87 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆) δ: 13.1,40.1,62.4,66.2,92.0,112.1,115.1,117.8,121.3,122.5,130.0,139.9,154.5,155.4,158.7,160.7,162.8; MS (ESI) m/z: 4 70 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₁₉H₁₈F₃N₅O₄S: C 48.61,H 3.86,N 14.92; found C 48.43,H 4.05,N 14.80.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-二氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(4-甲氧基苯氧基)]乙酯(7m): 白色固体,产率67%. m.p. 163～164 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆)δ: 2.51 (s,3H,SCH₃),3.70 (s,3H,ArOCH₃),4.00 (s,3H,NCH₃),4.21 (t,J=4.4 Hz,2H,CH₂),4.48 (t,J=4.4 Hz,2H,CH₂),6.86 (d,J=9.2 Hz,2H,ArH),6.92 (d,J=9.2 Hz,2H,ArH),7.31 (t,J=53.6 Hz,1H,CHF₂),8.76 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆)δ: 13.2,40.0,55.8,62.5,66.9,91.9,110.3,112.3,115.1,116.1,138.7,152.7,154.0,154.5,155.3,162.0,162.8. Anal. calcd for C₂₀H₂₁F₂N₅O₅S: C 49.89,H 4.40,N 14.55; found C 49.72,H 4.58,N 14.73.

2-氰基-3-甲硫基-3-(1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-甲酰肼基)丙烯酸[2-(2,4-二氯苯氧基)]乙酯(7f): 白色固体,产率67%. m.p. 200～201 ℃; ¹H NMR (400 MHz,DMSO-d₆)δ: 2.49 (s,3H,SCH₃),4.03 (s,3H,NCH₃),4.38～4.55 (m,4H,2×CH₂),7.23～7.57 (m,3H,ArH),8.88 (s,1H,pyrazole-H); ¹³C NMR (100 MHz,DMSO-d₆) δ: 13.1,39.9,62.0,67.9,91.9,112.1,115.9,123.2,125.3,128.6,129.8,139.9,153.3,154.6,155.3,160.7,162.7; MS (ESI) m/z: 536 [M-H]^-. Anal. calcd for C₁₉H₁₆Cl₂F₃- N₅O₄S: C 42.39,H 3.00,N 13.01; found C 42.55,H 2.87,N 13.19.

3.4 生物活性测试

抗肿瘤活性测试所用细胞株分别为对人宫颈癌(Hela)、人肺癌(A549)、人结肠癌(HT29)、人胃癌(SGC7901)和人肝癌(HepG2)细胞株. 阳性对照药为紫杉醇(Taxinol),紫杉醇注射液(30 mg/5 mL)购自Hospira Australia Pty Ltd公司,根据体积比配制成20 μmol/L的母液.

辅助材料(Supporting Information) 化合物7a～7q的 ¹H NMR和¹³C NMR图谱. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)细胞毒测试法测定了目标化合物的体外抗肿瘤活性,具体方法参照文献^[31]. 取对数生长期的人癌细胞制成1×10⁴个细胞/mL的细胞悬液,接种于96孔板中,在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h. 接着将待测化合物的供试液(10 μL)加入测试孔中,每个浓度设5个平行孔,并使用等量的二甲基亚砜(DMSO)作空白对照,紫杉醇作为阳性对照药,继续在5% CO₂培养箱中培养72 h后,弃上清液,每孔加MTT (2 mg/mL in PBS) 20 μL,继续培养4 h后,吸弃培养基,每孔加入150 μL DMSO,在振动器振荡10 min溶解形成的蓝紫色沉淀,随后用酶标仪在490 nm波长测定OD值,进而算出样品对细胞的抑制率. 此外,以简化概率单位法计算出半数抑制浓度.

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图式1 目标化合物7的合成路线

Scheme 1 The synthetic route of title compounds 7

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表 1 不同反应条件对目标化合物7b合成产率的影响

Table 1. Effects of reaction conditions on the synthesis of the target compound 7b

Entry	Solvent	Reaction condition	Yield/%
1	C₂H₅OH	Reflux for 2 h	56
2	CH₃CN	Reflux for 2 h	45
3	DMF	Room temperature for 2 h	70
4	DMSO	Room temperature for 2 h	41

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表 2 目标化合物7a～7q的体外抗肿瘤活性

Table 2. Cytotoxicity of target compounds 7a～7q at 20 μmol/L

Compd.	Percentage of inhibition/%
Compd.	Hela	A549	HT29	SGC7901	HepG2
7a	0	0	0	0	0
7b	28	39	18	25	7
7c	15	39	15	15	28
7d	28	100	19	28	25
7e	16	36	17	18	5
7f	100	100	58	0	73
7g	72	79	0	92	32
7h	100	28	0	28	20
7i	0	87	0	0	0
7j	18	34	18	29	0
7k	48	77	0	0	28
7l	45	100	0	20	17
7m	26	81	0	58	8
7n	0	0	0	0	0
7o	18	92	57	95	68
7p	0	92	0	0	0
7q	8	0	0	0	15
Taxinol	100	100	100	100	100

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

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沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142