氰化叶绿素类二氢卟吩衍生物的合成及其光动力活性的研究

引用本文: 高娜, 王振, 武进, 刘超, 王进军. 氰化叶绿素类二氢卟吩衍生物的合成及其光动力活性的研究[J]. 有机化学, 2016, 36(3): 580-589. doi: 10.6023/cjoc201506037 shu

Citation: Gao Na, Wang Zhen, Wu Jin, Liu Chao, Wang Jinjun. Synthesis of Cyanided Chlorophyllous Chlorin Derivatives and Study on Their Photodynamic Activities[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2016, 36(3): 580-589. doi: 10.6023/cjoc201506037 shu

氰化叶绿素类二氢卟吩衍生物的合成及其光动力活性的研究

高娜 ^a, ,
王振 ^b, ,
武进 ^b, ,
刘超 ^b, ,
王进军 ^{a,b,*,
,}

a.
烟台大学文经学院食品与生物工程系烟台 264005
b.
烟台大学化学化工学院烟台 264005

通讯作者: 王进军, E-mail: wjj1955@163.com

基金项目:
国家自然科学基金 21272048

山东省黄金工程技术研究中心(2011年度)

摘要: 以焦脱镁叶绿酸-a甲酯为起始原料, 选择硝酸铊和空气为氧化剂对其进行氧化, 分别在二氢卟吩周环上的3, 12和15位上引进了甲酰基和甲酰甲基, 与盐酸羟胺肟化后, 在N, N-二甲基甲酰胺和三氯三嗪的促进下脱水并顺利地转化为氰基; 利用丙二腈与二氢卟吩环上羰基的瑙文格尔反应建立了二氰亚甲基结构, 进一步的结构修饰则在色基上完成了多氰基取代.通过叶绿素降解产物周环上的不同位置实施氰基化, 合成了一系列未见报道的氰基取代的叶绿素类二氢卟吩衍生物, 其化学结构均经UV、IR、¹H NMR及元素分析予以证实; 同时也讨论了叶绿素类二氢卟吩氰基化的反应机理, 并对部分新化合物的体外光动力活性进行了测试.

关键词:

English

Synthesis of Cyanided Chlorophyllous Chlorin Derivatives and Study on Their Photodynamic Activities

Gao Na ^a, ,
Wang Zhen ^b, ,
Wu Jin ^b, ,
Liu Chao ^b, ,
Wang Jinjun ^{a,b,*,
,}

a.
Department of Food & Biological Engineering, Wenjing College, Yantai University, Yantai 264005
b.
College of Chemistry and Chemical Engineering, Yantai University, Yantai 264005

Corresponding author: Wang Jinjun, wjj1955@163.com

Received Date: 30 June 2015
Revised Date: 16 November 2015
Fund Project:
the National Natural Science Foundations of China

the Project of Shandong Applied Reasearch Centre of Gold Nanotechnology(2011)

Abstract: Pyropheophorbide-a methyl ester was used as a starting material, and its oxygenations were carried out by thaillum nitrate and air as oxidizing agent to introduce the formyl group and the formylmethyl group at 3-, 12-or 15-postion of chlorin periphery, respectively. After oximation these aldehyde groups were converted into cyano group under the reaction mediated from N, N-dimethylformamide and 2, 4, 6-trichloro-1, 3, 5-triazine. Dicyanomethylene moiety was established by Knoevenagel reaction of malononitrile with formyl group and 13¹-carbounyl group on the exocyclic ring. Mulcyano-substitutions on the chromophore were accomplished by further structure modifications. A series of unreported chlorins related to chlorophyll substituted with cyano-group were synthesized making use of cyanation at different positions on the periphery of chlorophyll degradation products. Their chemical structures were characterized by elemental analysis, UV, IR and¹H NMR spectra. The reaction mechanisms on the cyanation for the chlorophyllous chlorins were discussed and in vitro photodynamic activities of some new compounds were determined.

Key words:

选择硝酸铊和空气对焦脱镁叶绿酸-a甲酯(1)实施氧化, 分别得到3-甲酰甲基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(2)、15-甲酰基二氢卟吩-f二酯(3)和12-甲酰基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(4).在室温条件下, 二氢卟吩醛2在甲醇溶液中与盐酸羟胺搅拌反应1 h, 以72%的产率得到二氢卟吩醛肟(5); 选择N, N-二甲基甲酰胺作为反应溶剂, 并与三氯三嗪(TCT)协同促成脱水反应, 将3-位肟基转变为氰基, 分离出48%的3-氰甲基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(6). 3成肟后不经分离, 直接进行相应的脱水反应, 以26%的总收率得到15-氰基二氢卟吩-f二酯(7); 二氢卟吩醛4与盐酸羟胺在N-甲基吡咯烷酮中相互作用, 一步完成肟氰转换, 并收集到29%的12-氰基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(8) (Scheme 1).

在含有三乙胺的四氢呋喃溶液中, 二氢卟吩醛4与丙二腈顺利地发生瑙文格尔反应(Knoevenagel reaction), 以理想的产率生成二氰基取代的叶绿素衍生物9 (75%); 尝试在含有甲醇钠的甲醇溶液中对外接环羰基继续实施二氰亚甲基化, 结果分离出四氰基取代的二氢卟吩10 (28%)和二氰基取代的二氢卟吩11 (8%); 如果先行将外接环羰基与丙二腈进行缩合, 很容易得到13¹-二氰亚甲基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(12), 直接在碱性条件下对其进行空气氧化, 期望在周环上建立新的甲酰基结构, 但只从复杂的混合物中分离出少量的二氰基取代的叶绿素衍生物13 (18%)和14 (4%) (Scheme 2).

在叶绿素类光动力治疗(photodynamic therapy, 简称PDT)药物的合成研究中, 许多定量构效关系(QSAR)的研究表明, 叶绿素类二氢卟吩环上取代基的几何形状、电荷密度以及连接的位置对PDT活性都将产生深刻的影响, 特别是特定的官能结构往往对四吡咯大环分子的理化、光物理和光生物性质起到至关重要的作用, 而这些数据正是表征光动力抗癌活性的重要参数^{[1, 2]}.因此, 在叶绿素周环上引进和建立活性反应区域是设计理想PDT光敏剂的基本合成策略和重要的先期工作^{[3, 4]}.根据碳氮叁键的直线结构特征、非对称的电荷密度以及活泼的化学反应性质, 无论从空间结构、电子效应还是结构转换上考虑, 氰基单元的存在都有可能使得四吡咯大环发生不同程度的变化.本文基于课题组和他人的前期研究基础^[5～7], 选择焦脱镁叶绿酸-a甲酯(MPPa, 1)为起始原料, 通过化学转换, 在四吡咯周环上的不同位置上构建了碳氮叁键, 合成出一系列未见报道的氰基取代的焦脱镁叶绿酸-a甲酯衍生物, 为寻找新型PDT光敏剂提供了具有更多反应位点的合成前体.

图图式2 双腈基取代叶绿素a衍生物的合成

Figure 图式2. Synthesis of di-nitrile substituted chlorophyll a derivatives

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图图式1 单腈基取代叶绿素a衍生物的合成

Figure 图式1. Synthesis of mono-nitrile substituted chlorophyll a derivatives

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1 结果与讨论

1.1 叶绿素降解产物周环上的氰基形成过程

肟醛基的贝克曼重排经常作为合成腈类化合物的经典方法, 其结构转换需要脱去一分子水, 因此, 如何促进羟基的离去则是完成碳氮叁键形成的关键.霍夫曼重排一般需要较高的反应温度、较强的酸性和无水的反应介质, 因而该反应往往导致大量的副产物生成, 极大地受限于在敏感性反应底物中的应用.所以, 寻找温和的反应条件完成贝克曼重排, 一直是有机合成领域中的热点研究内容.考虑到叶绿素衍生物对酸、热和光等环境的敏感性, 基于本室与他人有关贝克曼重排的前期工作^[8～10], 选择三氯三嗪和N, N-二甲基甲酰胺(DMF)共同促进的反应条件, 在室温条件下, 对叶绿素降解产物的醛或酮肟实施重排, 以期得到相应的酰胺基或者氰基取代的新型叶绿素衍生物.

以二氢卟吩肟5为例, 三氯三嗪和DMF共同促进肟氰转换的反应过程如图 1所示:首先, DMF与三氯三嗪发生亲核取代反应生成亚胺盐三嗪醚a, 所取代的氯负离子再进攻a中的碳氮双键形成中间体b, 再经电子转移裂分成氯代亚胺盐c和三嗪氧负离子d.如果遵循贝克曼的重排过程, 醛肟5与c随即发生亲核加成, 生成质子化O-取代肟中间体A, 离去质子后形成B, 处于反位的烃基迁移后给出亚胺碳正离子C, 再与水分子作用得到贝克曼重排产物D.然而, 本反应并未形成大环色基参与重排的C(3)-甲酰氨甲基取代的二氢卟吩, 而是得到氢原子发生迁移的3-氰甲基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(6).由于氢迁移时大环色基与重排部分一直保持着π-体系共轭, 因而占有较大空间的四吡咯大环没有参与迁移.所以, 氰基的形成应该是质子化O-取代肟中间体A经历了脱水过程, 即三嗪氧负离子d捕获中间体A中的3a-位质子转化成三嗪e, 再经电子转移形成碳氮叁键; 与此同时, O-取代肟结构中的氮氧键断裂, 离去一分子DMF和HCl而生成化合物6 (图 1框格中所示).

12-甲酰基向氰基转换则起始于二氢卟吩醛4在NMP中与盐酸羟胺的缩合反应, 形成的醛肟E和N-甲基吡咯酮季铵盐互变异构体f, 其氢质子迁移至醛肟氧原子上实施质子化, 而氯负离子则俘获质子化醛肟F中亚胺碳上的质子并促成脱水, 分别给出12-氰基取代的焦脱镁叶绿酸8和N-甲基吡咯烷酮.

图1 焦脱镁叶绿酸的周环上醛基向氰基的转化过程

Figure 1. The transformation process of the peripheric formoyl to cyano-group linked with methyl pyropheophorbide

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1.2 二氢卟吩中C-吡咯子环所连酰基的氰基化

羰基与丙二腈的瑙文格尔缩合可以有效地建立一个二氰亚甲基结构, 作者也曾利用3-位甲酰基和E-环酮基得到具有特殊光物理性质的二氰基和四氰基取代的叶绿素衍生物^[9].本文基于相同的反应, 在12-位上同样引进了二氰亚甲基, 并尝试与丙二腈继续反应来进一步实施氰基化, 结果意外地得到四氰基取代和二氰基取代的二氢卟吩10和11, 其形成过程如图 2所示:在含有丙二腈的甲醇钠/甲醇溶液中, 化合物9部分地完成E-环13¹-位二氰亚甲基化的同时, 12-位上的二氰亚甲基与丙二腈发生了迈克尔加成, 生成的加成物G脱去一分子氢氰酸后转化成中间体H, 再异构成12-位上三氰基取代的更为稳定的中间体I, 最后与甲氧负离子发生亲核取代反应而分别给出10和11.

图2 焦脱镁叶绿酸外接环上和12-位的氰基化和空气氧化历程

Figure 2. The cyanation and allomerization process on the exocyclic ring and at 12-position of pyropheophorbide

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为了获取多氰基取代的叶绿素类二氢卟吩, 选择氢氧化锂催化的反应条件, 对化合物12实施空气氧化以期在13²-位和12-位上建立新的羰基结构.与MPPa相比, 化合物12的空气氧化需要较长的反应时间, 反应结果也比较混杂, 最后, 从难于分离的混合物中只得到13²-氧代焦脱镁叶绿酸13和12-甲氧甲酰基焦脱镁叶绿酸14.其碳氧双键的形成过程如前文所述^[11], 首先, 在碱性条件下形成负碳离子J和K, 再与空气氧分子相互作用氧化成13和二氢卟吩醛L, 其12-位甲酰基受到氢氧负离子的亲核进攻后形成四面体中间体M, 离去氢负离子并与体系中的羰基化合物N继续发生反应(类似于坎尼查罗反应(Cannizzaro reaction), 再经酸化和甲基化而形成化合物15.

1.3 氰基化叶绿素类二氢卟吩衍生物的体外光动力活性

卟啉类光敏剂的PDT抗癌疗效在某种程度上决定于周环上不同取代基团的空间和电子效应.考虑到碳氮叁键结构的特殊性, 氰基化对叶绿素类二氢卟吩的光动力活性势必形成一定的影响, 分别选择1, 4, 6～12为待测化合物.以中位meso-四羟苯基二氢卟吩(mTHPC)和临床光动力抗癌药物光敏素(Photofrin)为对照品, 在光照条件下, 采用噻唑蓝(MTT)比色法对上述化合物对小鼠肉瘤S-180细胞的体外光动力活性进行测定.以所测化合物浓度的对数为因变量, 以细胞抑制率为应变量作求得半抑制率(IC₅₀).

表1 叶绿素类二氢卟吩对小鼠肉瘤-180细胞的半抑制率(IC₅₀) Table1. IC₅₀ results of chlorophyllous chlorins on mouse sarcoma S-180 cell line

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Comd.	Photofin	mTHPD	1	4	6	7	8	9	10	11	12
IC₅₀/(μmol•L^-1) ^a	0.776	0.061	0.389	0.239	0.187	0.052	0.328	0.072	0.048	0.247	0.596
^a 所测光敏剂及对照在只加光敏剂无光照以及只光照无光敏剂条件下对小鼠肉瘤-180细胞的半抑制率(IC₅₀)均大于所测最高浓度(10 μmol•L^-1).

表1 叶绿素类二氢卟吩对小鼠肉瘤-180细胞的半抑制率(IC₅₀)
Table1. IC₅₀ results of chlorophyllous chlorins on mouse sarcoma S-180 cell line

从表 1可以看出, 所有测试的二氢卟吩对小鼠肉瘤S-180细胞都具有较强的光动力活性, 其IC₅₀值均低于0.600 μmol/L, 对病毒细胞的抑制能力远高于第一代临床的光动力抗癌药物Photofrin.除了化合物12以外, 其他二氢卟吩的PDT活性均高于作为叶绿素最初降解产物的焦脱镁叶绿酸-a甲酯(1).尽管大部分测试化合物的PDT活性低于目前临床应用效果最好光敏药物mTHPC, 但12-位二氰亚甲基焦脱镁叶绿酸9的相应活性与其较为接近, 而15-位连有氰基的二氢卟吩7和四氰基取代的化合物10的相应抑制效力甚至高于mTHPC.

当在周环上引进氰基以后, 所得大环分子对小鼠肉瘤S-180细胞的抑制率形成不同的变化趋势.与1相比, 13¹-二氰亚甲基二氢卟吩12的光动力活性有所下降, 而12-位二氰亚甲基叶绿素衍生物对小鼠肉瘤S-180细胞的则表现出较高的抑制力; 结合四氰基二氢卟吩10所具显示出的较高PDT活性, 反映出12-位氰基化比13²-位氰基化更有益于提高大环分子的PDT活性.参比E-环开链结构的15-氰基二氢卟吩-f二甲酯7和具有较大极性的多氰基取代焦脱镁叶绿酸10所表现出的较高光动力活性, 外接环结构保持不变的二氢卟吩(1、4、8和12)的半抑制率IC₅₀则相对较低.测试结果表明, 所连接的取代基团的极性越高, 其光动力抗癌活性越强.例如, 13¹-二氰亚甲基焦脱镁叶绿酸12的IC₅₀值为0.596 μmol/L, 而具有更大极性的氧化同系物10的相应测定值则降至0.048 μmol/L; 二氢卟吩醛4的极性要高于其二氰亚甲基化产物8, 前者的PDT肿瘤抑制活性也比后者要高.

2 结论

利用不同氧化剂氧化和空气氧化反应, 在叶绿素降解产物周环的不同位置上引进甲酰基团, 与盐酸羟胺肟化后, 在不同的反应条件下可以顺利地将环上醛基转化为氰基; 通过C-吡咯子环所连带的碳氧双键与丙二腈的瑙文格尔缩合, 在12-位和五元外接环上建立了二氰亚甲基结构, 其进一步的结构转换能够形成新的多氰基取代的四吡咯大环产物.氰基结构的引入对大环分子的光动力活性能够产生明显的影响, 同时, 利用所连带氰基的结构转换, 为获取新型叶绿素类二氢卟吩衍生物提供了更加广泛的合成途径.

3 实验部分

3.10 体外光动力药理活性的测定

3.1 仪器与试剂

元素分析用Perkin-Elmer 2400型元素分析仪测定; IR用Perkin-Elmer 1730型红外分光光度仪测定(KBr压片); UV-Vis用UV-160A型紫外分光光度计测定;¹H NMR用Brucker ARX-400型核磁共振仪测定, 内标为TMS.所用试剂均为分析纯或化学纯.焦脱镁叶绿酸-a甲酯(1)按文献[12]制备.

3.2 15-甲酰基二氢卟吩-f二酯(3)和12-甲酰基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(4)的合成

将536 mg (0.978 mmol)焦脱镁叶绿酸甲酯-a (1)溶解于280 mL四氢呋喃中, 再加入由氢氧化锂饱和的15 mL甲醇溶液, 室温搅拌3 h; 加入200 mL冰水, 搅拌下滴加浓盐酸, 调节pH为2～3, 加入200 mL二氯甲烷分层, 用二氯甲烷萃取水相(40 mL×2), 合并有机层, 水洗, 用无水硫酸钠干燥, 蒸馏除去溶剂.然后重新溶解于350 mL含有5%浓硫酸的甲醇溶液, 室温搅拌过夜.先后加入300 mL水和300 mL二氯甲烷分层, 分出有机相并水洗两次, 干燥后除去溶剂, 将剩余物通过柱层析分离[洗脱剂: V(乙酸乙酯):V(正己烷)=1:4]从较大极性色带中分离出46 mg黄色固体3 (0.078 mmol, 8%)和104 mg绿色固体4 (0.186 mmol, 19%).化合物3和4的分析数据和物理常数与文献[11]一致.

3.3 (E/Z)-3-羟胺亚乙基-3-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(5)的合成

在50 mL二氯甲烷和25 mL甲醇混合液中溶解198 mg MPPa 1 (0.361 mmol), 在0 ℃下将溶解于30 mL甲醇的150 mg三水硝酸铊迅速加入到反应液中, 并在此温度下搅拌反应15 min, 然后加入30 mL亚硫酸氢钠甲醇饱和溶液, 室温下搅拌20 min, 滴加2 mL浓盐酸酸化, 将大量的白色沉淀过滤, 滤液用二氯甲烷萃取(20 mL×3), 分出有机层水洗, 干燥后减压浓缩至干, 然后重新溶解于15 mL 80%的甲酸溶液中, 室温搅拌6 h, 加入20 mL水和35 mL二氯甲烷, 分出有机层, 水层用二氯甲烷萃取(15 mL×3), 合并有机层并用水洗涤, 无水硫酸钠干燥, 减压浓缩, 硅胶柱层析分离[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1], 得到148 mg暗红色固体2 (0.260 mmol, 72%).将所得固体溶解于10 mL甲醇中, 再加入溶有40 mg盐酸羟胺的10 mL甲醇, 搅拌下滴加0.1 mL浓盐酸, 常温搅拌反应1 h, 先后加入20mL二氯甲烷和20 mL水分层, 水相用二氯甲烷萃取(15 mL×3), 合并有机层, 水洗后用无水硫酸钠干燥, 减压除去溶剂, 剩余物经硅胶柱层析[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=2:1], 得到53 mg黑绿色固体5, 产率42%. m.p. 188～191℃; UV-vis (CH₂Cl₂) λ_max [ε/(L•mol^-1•cm^-1)]: 408 (1.87×10⁴), 503 (1.50×10³), 533 (1.31×10³), 603 (1.12×10³), 660 (7.11×10³) nm;¹H NMR (CDCl₃) δ: -1.11 (br s, 1H, NH), 0.65 (br s, 1H, NH), 1.59 (t, J=7.6 Hz, 3H, 8-CH₃), 1.79 (d, J=7.2 Hz, 3H, 18-CH₃), 1.98～2.08 (m, 1H, 17a+17b-H), 2.23～2.35 (m, 1H, 17a+17b-H), 2.42～2.60 (m, 2H, 17a+17b-H), 2.97, 3.19, 3.28, 3.66 (each s, each 3H, CH₃+OCH₃), 3.57 (q, J=7.6 Hz, 2H, 8a-H), 4.05 (d, J=9.4 Hz, 1H, 17-H), 4.34 (q, J=7.2 Hz, 1H, 18-H), 4.83 (d, J=1.5 Hz, 2H, 3a-H), 4.99 (d, J=20.8 Hz, 1H, 13²-H), 5.15 (d, J=20.8 Hz, 1H, 13²-H), 8.41 (s, 1H, 3b-H), 8.85, 8.95, 10.15 (each s, each 1H, meso-H);¹³C NMR (400 Hz, CDCl₃) δ: 195.86, 173.43, 170.28, 169.00, 161.68, 154.89, 152.11, 150.92, 150.87, 148.65, 144.65, 138.82, 136.58, 133.27, 131.34, 125.00, 106.66, 103.55, 99.08, 93.83, 99.83, 93.89, 52.00, 51.75, 49.67, 48.11, 31.00, 29.79, 23.24, 19.91, 19.23, 17.28, 11.96, 10.84; IR (KBr) ν: 3324 (N—H), 2925 (C—H), 1739, 1696 (C=O), 1602 (C=C), 1500 (chlorin skeleton), 1451, 1263, 1089, 1041, 903 cm^-1; EI-MS m/z: 580.4 (M+H⁺). Anal. calcd for C₃₄H₃₇N₅O₄: C 70.45, H 6.43, N 12.08; found C 70.39, H 6.32, N 12.20.

3.4 3-氰甲基-3-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(6)的合成

在2 mL DMF中溶解480 mg三氯三嗪, 室温搅拌30 min(体系的颜色由无色逐渐变为乳红色), 然后与含有133 mg二氢卟吩醛肟5 (0.230 mmol)的5 mL DMF合并, 室温搅拌24 h.先后加入15 mL水和25 mL二氯甲烷促使反应体系分层, 分出有机相, 水相用二氯甲烷萃取(15 mL×3), 合并有机相并水洗, 无水硫酸钠干燥, 浓缩后用硅胶柱层析分离[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=4:1], 得62 mg黑色固体6 (0.106 mmol), 产率48%. m.p. 188～191℃, UV-vis (CH₂Cl₂) λ_max [ε/(L• mol^-1•cm^-1)]: 316 (1.84×10³), 406 (1.53×10⁴), 504 (9.18×10²), 534 (8.35×10²), 608 (7.65×10²), 664 (1.19×10⁴) nm;¹H NMR (CDCl₃) δ: -1.88 (br s, 1H, NH), 0.16 (br s, 1H, NH), 1.69 (t, J=7.6 Hz, 3H, 8-CH₃), 1.81 (d, J=7.2 Hz, 3H, 18-CH₃), 2.25～2.33 (m, 1H, 17a+17b-H), 2.53～2.61 (m, 2H, 17a+17b-H), 2.66～2.74 (m, 1H, 17a+17b-H), 3.25, 3.39, 3.62, 3.65 (each s, each 3H, CH₃+OCH₃), 3.66 (q, J=7.6 Hz, 2H, 8a-H), 4.31 (d, J=8.6 Hz, 1H, 17-H), 4.53 (q, J=7.2 Hz, 1H, 18-H), 4.81 (s, 2H, 3a-H), 5.12 (d, J=19.8 Hz, 1H, 13²-H), 5.27 (d, J=19.8 Hz, 1H, 13²-H), 8.59, 9.20, 9.51 (each s, each 1H, meso-H);¹³C NMR (400 Hz, CDCl₃) δ: 200.09, 173.61, 170.95, 160.83, 155.21, 150.58, 148.565, 145.07, 141.45, 138.10, 136.38, 136.09, 135.88, 131.72, 130.59, 129.31, 129.22, 122.63, 112.32, 104.15, 93.13, 53.31, 50.99, 31.88, 31.78, 29.86, 23.50, 19.58, 17.92, 17.54, 12.23, 11.68; IR (KBr) ν: 3445 (N—H), 2958, 2835 (C—H), 1736, 1689 (C=O), 1655 (C=C), 1527 (chlorin skeleton), 1400, 1286, 1189, 1094 cm^-1; EI-MS m/z: 561.7 (M+H⁺). Anal. calcd for C₃₄H₃₅N₅O₃: C 72.71, H 6.28, N 12.47; found C 72.59, H 6.32, N 12.30.

3.5 15-氰基二氢卟吩-f二甲酯(7)的合成

在10 mL甲醇中溶解70 mg二氢卟吩醛3 (0.118 mmol), 搅拌下加入研成粉末的40 mg盐酸羟胺, 继续搅拌5 min, 滴加0.1 mL浓盐酸后常温搅拌反应1 h; 先后加入20 mL二氯甲烷和20 mL水, 分出有机相并水洗两次, 减压除去溶剂, 剩余物重新溶解于5 mL DMF中, 然后倒入溶有480 mg三氯三嗪的2 mL DMF中, 室温搅拌24 h.先后加入15 mL水和25 mL二氯甲烷促使反应体系分层, 分出有机层, 水层用二氯甲烷萃取(15 mL×3), 合并有机相并水洗, 无水硫酸钠干燥, 浓缩后用硅胶柱层析分离[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=4:1], 得18 mg黑色固体7 (0.031 mmol), 产率26%. m.p. 191～194 ℃; UV-Vis (CH₂Cl₂) λ_max [ε/(L• mol^-1•cm^-1)]: 385 (5.23×10³), 422 (1.07×10⁴), 512 (9.42×10²), 561 (5.01×10³), 688 (9.34×10³) nm;¹H NMR (CDCl₃) δ: -1.15 (br s, 2H, NH), 1.65 (t, J=7.6 Hz, 3H, 8a-CH₃), 1.79 (d, J=7.2 Hz, 3H, 18-CH₃), 2.24～2.32 (m, 1H, 17a+17b-H), 2.53～2.62 (m, 2H, 17a+17b-H), 2.67～2.75 (m, 1H, 17a+17b-H), 3.18, 3.40, 3.57, 3.59, 4.37 (each s, each 3H, CH₃+OCH₃), 3.64 (q, J=7.6 Hz, 2H, 8a-H), 4.51 (q, J=7.2 Hz, 1H, 18-H), 4.75 (dd, J=9.0, 3.0 Hz, 1H, 17-H), 6.14 (d, J=11.6 Hz, 1H, cis-3b-H), 6.28 (d, J=17.8 Hz, 1H, trans-3b-H), 7.94(dd, J=17.8, 11.6 Hz, 3a-H), 8.71, 9.52, 9.63(each s, 2H, meso-H); IR(KBr) v: 33419 (N—H), 2915, 2847 (C—H), 1733, 1691 (C=O), 1604 (C=C), 1497 (chlorin skeleton), 1437, 1365, 1199, 1111, 981 cm^-1; EI-MS m/z: 592.3 (M+H⁺). Anal. calcd for C₃₅H₃₇N₅O₄: C 71.05, H 6.30, N 11.84; found C 71.21, H 6.19, N 11.69.

3.6 12-氰基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(8)的合成

在8 mL N-甲基吡咯烷酮中溶解179 mg二氢卟吩醛4 (0.319 mmol), 搅拌下加入预先研细的51 mg盐酸羟胺(0.739 mmol), 120 ℃下搅拌8 h.先后加入15 mL水和25 mL二氯甲烷促使反应体系分层, 分出有机相, 水相用二氯甲烷萃取(15 mL×3), 合并有机相并水洗, 无水硫酸钠干燥, 浓缩后用硅胶柱层析分离[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=4:1], 得52 mg黑色固体6(0.093 mmol), 产率29%. m.p. 188～191 ℃; UV-Vis (CH₂Cl₂) λ_max [ε/(L•mol^-1•cm^-1)]: 401 (1.48×10⁴), 518 (9.02×10²), 564 (8.66×10²), 614 (8.68×10²), 670 (1.32×10⁴) nm;¹H NMR (CDCl₃) δ: -0.49 (br s, 1H, NH), 0.72 (br s, 1H, NH), 1.43 (t, J=7.6 Hz, 3H, 8-CH₃), 1.81 (d, J=7.2 Hz, 3H, 18-CH₃), 2.13～2.23 (m, 1H, 17a+17b-H), 2.33～2.43 (m, 2H, 17a+17b-H), 2.54～2.68 (m, 1H, 17a+17b-H), 2.80, 3.25, 3.66 (each s, each 3H, CH₃+OCH₃), 3.16 (q, J=7.6 Hz, 2H, 8a-H), 4.03 (td, J=9.4, 2.0 Hz, 1H, 17-H), 4.29 (dq, J=7.4, 2.0 Hz, 1H, 18-H), 4.85 (d, J=19.8 Hz, 1H, 13²-H), 5.01 (d, J=19.8 Hz, 1H, 13²-H), 6.15 (d, J=11.6 Hz, 1H, cis-3b-H), 6.19 (d, J=17.8 Hz, 1H, trans-3b-H), 7.70 (dd, J=17.8, 11.6 Hz, 1H, 3a-H), 8.18, 8.51, 8.63 (each s, each 1H, meso-H);¹³C NMR (400 Hz, CDCl₃) δ: 187.07, 173.45, 170.94, 150.82, 149.68, 144.92, 141.16, 137.38, 136.39, 135.73, 131.36, 129.19, 128.97, 128.93, 122.64, 112.90, 106.88, 104.43, 99.83, 93.89, 51.65, 51.59, 31.92, 31.23, 29.64, 29.35, 23.59, 22.68, 19.47, 17.44, 14.10, 12.21, 12.11, 11.22; IR (KBr) ν: 3449 (N—H), 2924 (C—H), 1742, 1708 (C=O), 1686 (C=C), 1560 (chlorin skeleton), 1457, 1341, 1082, 1040, 971 cm^-1; EI-MS m/z: 560.3 (M+H⁺). Anal. calcd for C₃₄H₃₃N₅O₃: C 72.97, H 5.94, N 12.51; found C 72.82, H 6.02, N 12.37.

3.7 12-二氰亚甲基-12-去甲基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(9)的合成

将80 mg 12-甲酰基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(4) (0.142 mmol)溶解于10 mL四氢呋喃中, 加入0.3 mL三乙胺后, 再慢慢滴加溶解于5 mL四氢呋喃的40 mg丙二睛, 5 min内加完, 避光条件下室温搅拌, TLC监测反应进程, 20 min反应结束, 向反应体系加入20 mL水和20 mL二氯甲烷, 分出有机层, 水层用二氯甲烷萃取(15 mL×3), 合并有机层, 水洗后用无水硫酸钠干燥, 减压浓缩, 剩余物经硅胶柱层析分离[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=4:1], 得到65 mg绿色固体9 (0.107 mmol).产率75%. m.p. 241～242 ℃; UV-Vis (CH₂Cl₂) λ_max [ε/(L• mol^-1•cm^-1)]: 401 (9.91×10⁴), 504 (7.93×10³), 624 (8.92×10⁴), 658 (1.19×10⁴), 699 (2.48×10⁴) nm;¹H NMR (CDCl₃) δ: 0.09 (br s, 1H, NH), 0.68 (br s, 1H, NH), 1.48 (t, J=7.6 Hz, 3H, 8-CH₃), 1.78 (d, J=7.2 Hz, 3H, 18-CH₃), 2.11～2.21 (m, 1H, 17a+17b-H), 2.28～2.40 (m, 2H, 17a+17b-H), 2.51～2.62 (m, 1H, 17a+17b-H), 2.94, 3.23, 3.66 (each s, each 3H, CH₃+OCH₃), 4.03 (q, J=7.6 Hz, 2H, 8a-H), 4.23 (q, J=7.2 Hz, 1H, 18-H), 4.05 (d, J=8.4 Hz, 1H, 17-H), 4.90 (d, J=20.0 Hz, 1H, 13²-H), 5.05 (d, J=20.0 Hz, 1H, 13²-H), 6.15 (d, J=11.6 Hz, 1H, cis-3b-H), 6.20 (d, J=17.8 Hz, 1H, trans-3b-H), 7.72 (dd, J=17.8, 11.6 Hz, 1H, 3a-H), 8.53 (s, 1H, 12-H), 8.21, 8.64, 8.69 (each s, each 1H, meso-H); IR (KBr) v: 3443 (N—H), 2957 (C—H), 1731, 1698 (C=O), 1623 (C=C), 1560 (chlorin skeleton), 1462, 1232, 1170, 1031, 916 cm^-1; EI-MS m/z: 611.3 (M+H⁺). Anal. calcd for C₃₇H₃₄N₆O₃: C 72.77, H 5.61, N 13.76; found C 72.81, H 5.51, N 13.59.

3.8 13²-二氰亚甲基-12-(1'-甲氧甲基-2', 2'-二氰基乙烯基)-13²-去氧-12-去甲基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(10)和12-(1'-甲氧甲基-2', 2'-二氰基乙烯基)-12-去甲基焦脱镁叶绿酸-a甲酯(11)的合成

将129 mg 12-β, β-二氰亚甲基焦脱镁叶绿酸(9) (0.211 mmol)溶解于15 mL含有20 mg甲醇钠的甲醇中, 搅拌下加入130 mg丙二腈(0.002 mol), 于35 ℃氮气保护下避光搅拌, 3 h反应结束, 加入25 mL二氯甲烷和15 mL水, 分出有机层, 水层用二氯甲烷萃取(20 mL×3), 合并有机相, 用无水硫酸钠干燥, 减压浓缩, 剩余物用硅胶柱层析[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1]分离, 得42 mg绿色固体10 (0.059 mmol, 28%)和11 mg墨绿色固体11 (0.017 mmol, 8%).

11: m.p. 237～239℃; UV-Vis (CH₂Cl₂) λ_max [ε/(L•mol^-1•cm^-1)]: 410 (1.27×10⁵), 505 (3.31×10⁴), 556 (2.54×10⁴), 617 (2.16×10⁴), 674 (6.73×10⁴) nm;¹H NMR (CDCl₃) δ: -0.73 (br s, 1H, NH), 0.50 (br s, 1H, NH), 1.63 (t, J=7.6 Hz, 3H, 8a-CH₃), 1.78 (d, J=7.2 Hz, 3H, 18-CH₃), 2.23～2.38 (m, 2H, 17a+17b-H), 2.51～2.71 (m, 2H, 17a+17b-H), 3.52 (q, J=7.6 Hz, 2H, 8a-H), 2.76, 3.14, 3.33, 3.64 (each s, each 3H, CH₃+OCH₃), 4.20 (d, J=8.4 Hz, 1H, 17-H), 4.39 (q, J=7.2 Hz, 1H, 18-H), 5.08 (d, J=18.4 Hz, 13²-H), 5.24 (d, J=18.4 Hz, 1H, 13²-H), 5.44 (s, 2H, 12-1'-CH₂), 6.17 (d, J=11.4 Hz, 1H, cis-3b-H), 6.26 (d, J=17.8 Hz, 1H, trans-3b-H), 7.89 (dd, J=17.8, 11.4 Hz, 1H, 3a-H), 8.39, 9.12, 9.20 (each s, each 1H, meso-H);¹³C NMR (400 Hz, CDCl₃) δ: 203.01, 197.56, 173.51, 171.36, 161.10, 155.49, 150.74, 148.98, 145.07, 141.51, 137.84, 136.41, 136.09, 135.86, 131.76, 131.09, 130.04, 129.15, 128.31, 128.09, 126.41, 122.57, 109.10, 104.08, 97.20, 93.11, 56.67, 51.70, 50.96, 50.13, 39.12, 31.02, 30.00, 25.82, 23.43, 19.45, 17.44, 12.11, 11.21; IR (KBr) v: 3454 (N—H), 2858 (C—H), 1739, 1700 (C=O), 1618 (C=C), 1461 (chlorin skeleton), 1448, 1380, 1253, 1172, 1083, 1010, 801 cm^-1; EI-MS m/z: 656.2 (M+H⁺). Anal. calcd for C₃₉H₃₈N₆O₄: C 71.54, H 5.85, N 12.84; found C 71.41, H 5.69, N 12.89.

10: m.p. 241～244 ℃; UV-Vis (CH₂Cl₂) λ_max [ε/(L•mol^-1•cm^-1)]: 389 (8.53×10⁴), 433 (1.04×10⁵), 454 (9.46×10⁴), 590 (2.81×10⁴), 646 (3.74×10⁴), 706 (1.04×10⁵) nm;¹H NMR (CDCl₃) δ: -0.28 (br s, 1H, NH), 0.70 (br s, 1H, NH), 1.58 (t, J=7.6 Hz, 3H, 8a-CH₃), 1.77 (1.73) (d, J=7.2 Hz, 3H, 18-CH₃), 2.18～2.42 (m, 2H. 17a+17bH), 2.55～2.70 (m, 2H. 17a+17b-H), 3.45 (q, J=7.6 Hz, 2H, 8a-H), 2.78 (2.75), 3.10, 3.29, 3.69 (3.65) (each s, each 3H, CH₃+OCH₃), 4.19 (4.17) (d, J=9.0 Hz, 1H, 17-H), 4.33 (q, J=7.4 Hz, 1H, 18-H), 5.41 (5.36) (s, 2H, 12-1'-CH₂), 5.70 (5.64) (d, J=20.0 Hz, 1H, 13²-H), 5.80 (5.55) (d, J=20.0 Hz, 1H, 13²-H), 6.17 (d, J=11.6, 1H, cis-3b-H), 6.24 (d, J=18.0, 1H, trans-3b-H), 7.84 (dd, J=18.0, 11.6 Hz, 1H, 3a-H), 8.32 (8.31), 8.88 (8.87), 9.02 (each s, each 1H, meso-H); ¹³C NMR (400 Hz, CDCl₃) δ: 173.62, 148.71, 143.43, 135.80, 135.37, 132.46, 131.90, 130.77, 130.25, 129.39, 129.36, 128.80, 126.40, 123.81, 121.88, 104.92, 101.43, 93.40, 51.85, 51.40, 48.75, 31.01, 30.09, 23.66, 23.60, 19.27, 17.41, 14.13, 11.90, 10.98; IR (KBr) v: 3409 (N—H), 2960 (C—H), 1729, 1700 (C=O), 1647 (C=C), 1550 (chlorin skeleton), 1462, 1376, 1211, 1143, 1053 cm^-1; EI-MS m/z: 703.3 (M+H⁺). Anal. calcd for C₄₂H₃₈N₈O₃: C 71.78, H 5.45, N 15.94; found C 71.89, H 5.39, N 16.06.

3.9 13¹-二氰亚甲基-13²-氧代-13¹-去氧焦脱镁叶绿酸-a甲酯(13)和13¹-二氰亚甲基-12-甲氧甲酰基-12-去甲基-13¹-去氧焦脱镁叶绿酸-a甲酯(14)的合成

14: m.p. 227～229 ℃; UV-Vis (CH₂Cl₂) λ_max [ε/(L•mol^-1•cm^-1)]: 410 (9.87×10⁴), 505 (2.08×10⁴), 556 (1.58×10⁴), 617 (3.95×10³), 674 (4.24×10³) nm;¹H NMR (CDCl₃) δ: 0.05 (br s, 1H, NH), 0.70 br s, 1H, NH), 1.65 (t, J=7.6 Hz, 3H, 8-CH₃), 1.74 (d, J=7.2 Hz, 1H, 18-CH₃), 1.98～2.06 (m, 1H, 17a+17b-H), 2.15～2.36 (m, 2H, 17a+17b-H), 2.50～2.67 (m, 1H, 17a+17b-H), 3.56 (q, J=7.6 Hz, 2H, 8a-H), 3.07, 3.25, 3.63, 4.35 (each s, each 3H, OCH₃+CH₃), 4.08 (d, J=9.0 Hz, 1H, 17-H), 4.27 (q, J=7.2 Hz, 1H, 18-H), 4.97 (d, J=20.0 Hz, 1H, 13²-H), 5.13 (d, J=20.0 Hz, 1H, 13²-H), 6.14 (d, J=11.6 Hz, 1H, cis-3b-H), 6.22 (d, J=17.6 Hz, 1H, trans-3b-H), 7.79 (dd, J=17.6, 11.6 Hz, 1H, 3a-H), 8.20, 8.87, 10.08 (each s, each 1H, meso-H); IR (KBr) v: 3436 (N—H), 2924, 2854 (C—H), 1738, 1698 (C=O), 1622 (C=C), 1585 (chlorin skeleton), 1483, 1373, 1283, 1014, 912, 804 cm^-1; EI-MS m/z: 640.7 (M+H⁺). Anal. calcd for C₃₅H₃₆N₆O₄: C 71.23, H 5.66, N 13.12; found C 71.37, H 5.81, N 13.07.

13: m.p. 252～255℃; UV-Vis (CH₂Cl₂) λ_max [ε/(L•mol^-1•cm^-1)]: 397 (1.13×10⁵), 483 (2.94×10³), 553 (1.02×10³), 654 (2.13×10⁴), 716 (3.84×10⁴) nm;¹H NMR (CDCl₃) δ: -1.98 (br s, 1H, NH), 0.51 (br s, 1H, NH), 1.70 (t, J=7.6 Hz, 3H, 8-CH₃), 1.88 (d, J=7.2 Hz, 3H, 18-CH₃), 1.95～2.07 (m, 1H, 17a+17b-H), 2.18～2.43 (m, 2H, 17a+17b-H), 2.67～2.80 (m, 1H, 17a+17b-H), 3.35, 3.50, 3.51, 3.62 (each s, each 3H, CH₃+OCH₃), 3.75 (q, J=7.6 Hz, 2H, 8a-H), 5.11 (d, J=8.0 Hz, 1H, 17-H), 4.63 (q, J=7.6 Hz, 1H, 18-H), 6.30 (dd, J=11.6, 1.0 Hz, 1H, cis-3b-H), 6.36 (dd, J=17.8, 1.0 Hz, 1H, trans-3b-H), 8.08 (dd, J=17.8, 11.6 Hz, 1H, 3a-H), 8.94, 9.50, 9.80 (each s, each 1H, meso-H); IR (KBr) v: 3429 (N—H), 2914 (C—H), 1742, 1700 (C=O), 1604 (C=C), 1529 (chlorin skeleton), 1422, 1388, 1304, 1126, 1010, 975 cm^-1; EI-MS m/z: 612.4 (M+H⁺). Anal. calcd for C₃₇H₃₄N₆O₃: C 72.77, H 5.61, N 13.76; found C 72.61, H 5.41, N 13.59.

取220 mg MPPa (1) (0.401 mmol)溶解于20 mL无水乙醇中, 加入过量的丙二睛(200 mg)和0.5 mL三乙胺, 氮气保护下于80 ℃条件下搅拌反应4 h, 减压除去大部分溶剂后加入100 mL水, 用二氯甲烷萃取(100 mL×3), 合并有机层, 水洗后用无水硫酸钠干燥, 减压浓缩, 剩余物用硅胶柱层析[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1]分离出作为主要产物12的蓝绿色色带, 浓缩后重新溶解在20 mL四氢呋喃中, 将反应体系温度降低至0 ℃, 加入氢氧化锂溶液(400 mg LiOH溶解在20 mL甲醇和5 mL水中), 室温搅拌6 h, 用25%的硫酸溶液调至Ph值为2, 用CH₂Cl₂萃取反应液(15 mL×3), 合并有机层, 水洗后用无水硫酸钠干燥, 减压浓缩, 剩余物用硅胶柱层析[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1]分离, 得43 mg黄绿色固体13 (0.072 mmol, 18%)和10 mg墨绿色固体14 (0.016 mmol, 4%).

3.10.2 测定方法(MTT比色检测法)

辅助材料(Supporting Information)所有新化合物的核磁共振氢谱数据.这些材料可以免费从本刊网站http://sioc-journal.cn/上下载.

在37 ℃、5% CO₂、饱和湿度下, 小鼠肉瘤S-180细胞贴壁培养于含10 mL完全培养液(α-MEM, 含10%新生牛血清, L-谷氨酸盐, 青霉素以及链霉素)的细胞培养瓶中.细胞接种于含完全培养基的96孔细胞培养板中, 每孔细胞密度为5×10³个/孔. 37 ℃恒温培养过夜后各孔分别加入不同浓度的光敏剂, 使其最终浓度分别为10, 1, 0.1, 0.05以及0.01 μmol•L^-1, 在暗处37 ℃继续恒温培养24 h.在光处理前用不含药物的完全培养基替换孔中的培养基, 然后用670～700 nm的光照射细胞20 min, 总光剂量为8.4 J.细胞在暗处于37 ℃继续恒温培养48 h.在培养结束前4 h, 分别在每孔中加入10 μL 4.0 mg/mL的3-[2'-(4', 5'-二甲基噻唑)]-2, 5-二苯基四唑溴化物(MTT)磷酸缓冲溶液. 4 h后移除培养基和MTT, 加入100 μL DMSO溶解甲暨结晶.用酶标仪(Titertek Multiscan Plus MK II; Miles Inc.)测定各孔在560 nm的吸光度.每组实验重复三次, 标准误差均值(SEMs)小于10%, 每次实验设5个重复孔.以不加光敏剂和非光照条件下的细胞为空白对照, 以光敏剂三次重复实验所得吸光度平均值对光敏剂浓度作图得到各光敏剂的IC₅₀值.结果分析及各化合物的IC₅₀值见表 1.

3.10.1 待测样品和对照品

分别选择化合物1、4, 6～12和14为待测化合物, 选择临床光动力抗癌药物光敏素(Photofrin)和中位meso-四羟苯基二氢卟吩(mTHPC)为对照品.将待测样品和对照品用含20%增溶剂聚氧乙烯蓖麻油的水溶液溶解.

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  Liu, C.; Dobhal, M. P.; Ethirajan, M.; Missert, J. R.; Pandey, R. K.; Balasubramanian, S.; Sukumaran, D. K.; Zhang, M.; Kadish, K. M.; Ohkubo, K.; Fukuzumi, S. J. Am. Chem. Soc, 2008, 130, 14311.
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  (纪建业, 殷军港, 张千, 刘超, 祁彩霞, 王进军, 有机化学, 2014, 34, 2047.)
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图式1 单腈基取代叶绿素a衍生物的合成

Scheme 1 Synthesis of mono-nitrile substituted chlorophyll a derivatives

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图式2 双腈基取代叶绿素a衍生物的合成

Scheme 2 Synthesis of di-nitrile substituted chlorophyll a derivatives

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图 1 焦脱镁叶绿酸的周环上醛基向氰基的转化过程

Figure 1 The transformation process of the peripheric formoyl to cyano-group linked with methyl pyropheophorbide

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图 2 焦脱镁叶绿酸外接环上和12-位的氰基化和空气氧化历程

Figure 2 The cyanation and allomerization process on the exocyclic ring and at 12-position of pyropheophorbide

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表 1 叶绿素类二氢卟吩对小鼠肉瘤-180细胞的半抑制率(IC₅₀)

Table 1. IC₅₀ results of chlorophyllous chlorins on mouse sarcoma S-180 cell line

Comd.	Photofin	mTHPD	1	4	6	7	8	9	10	11	12
IC₅₀/(μmol•L^-1) ^a	0.776	0.061	0.389	0.239	0.187	0.052	0.328	0.072	0.048	0.247	0.596
^a 所测光敏剂及对照在只加光敏剂无光照以及只光照无光敏剂条件下对小鼠肉瘤-180细胞的半抑制率(IC₅₀)均大于所测最高浓度(10 μmol•L^-1).

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142