English

• 1.   引言

  弗林蛋白酶(Furin)是一种前蛋白转化酶(proproprotein convertases, PCs), 位于反式高尔基体网络(TGN)中^[1].人们对它的结构和功能展开了深入地研究, 发现它对内分泌途径中许多重要的、具有特定基序的前体蛋白和多肽进行剪切和加工, 使之具有生物学活性以参与到一系列的生理和病理过程中^[2].因此, 弗林蛋白酶展示出重要的生物学功能, 并与许多疾病的发生发展有着密切的关联.大量研究表明癌症的发生和发展与弗林蛋白酶表达水平呈正相关; 与正常细胞相比, 弗林蛋白酶在卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等癌症中的表达水平明显增强^[3].此外, 之前的研究指出, 弗林蛋白酶的高表达伴随着肿瘤血管的显著减少, 这暗示着弗林蛋白酶可能与肿瘤缺氧呈正相关^[4].缺氧是一种常见的肿瘤发生促进剂, 通常是由于它影响了血管生成和侵袭相关介质的基因表达, 其中一些介质是弗林蛋白酶的天然底物.缺氧促进弗林蛋白酶的表达是通过缺氧诱导因子-1 (hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)的调节, HIF-1是一种转录复合物, 在细胞缺氧适应中起着关键作用.因此, 弗林蛋白酶可以作为除硝基还原酶之外的另一种缺氧生物标记物^[5].所以, 对肿瘤细胞中的弗林蛋白酶进行灵敏、特异地检测和成像, 可以极大地促进肿瘤的诊断和治疗, 并将推动癌症的发生和转移机制研究, 也有助于揭示弗林蛋白酶在缺氧中的作用.

  荧光成像技术具有灵敏度好、选择性高、空间分辨率高、实时成像等固有优势, 已在各种生物靶标分析中得到广泛地应用^[6-10].荧光探针, 由于具有结构可塑性和信号输出可调性, 是荧光成像分析各种生物靶标的有力工具.其中, 小分子荧光酶底物探针是实时成像活细胞中酶活性的理想工具^[11].目前只有几种基于近红外染料或单光子染料的小分子荧光探针用于弗林蛋白酶的检测和成像^[12-16].然而, 这些探针的斯托克斯位移较小, 容易导致荧光自猝灭和瑞丽散射干扰; 或激发波长较短, 导致组织穿透深度较浅.双光子(two-photon)荧光探针以两个近红外光子作为激发光源, 因而生物背景荧光低、组织穿透深度深, 已被广泛应用于各种生物靶标的检测和成像^[17-21].因此, 开发新型的双光子荧光探针用于双光子成像活细胞和组织中的弗林蛋白酶活性具有重要意义和挑战.

  在本工作中, 我们首次构建了一种弗林蛋白酶激活的双光子荧光探针(Nap-F), 并用于细胞和肿瘤组织中的弗林蛋白酶活性选择性地成像.我们选取经典的双光子染料1, 8-萘酰亚胺作为荧光团, 再将弗林蛋白酶特异性肽链序列RVRR通过连接体与荧光团整合得到探针Nap-F(图 1).探针Nap-F是基于分子内电荷转移(ICT)机理设计的, 荧光团的C-4酚羟基与连接体以氨基甲酸酯连接起来, 使得C-4酚羟基的供电子能力显著减弱, ICT过程被抑制, 探针本身在飞秒激光820 nm激发或单光子420 nm激发下, 在545 nm处的荧光均很弱.而探针Nap-F在被弗林蛋白酶剪切后, 迅速发生分子内自消除反应, 进而释放出荧光团, 得以实现单双光子激发下弗林蛋白酶的“增强”型检测.得益于探针结构上的三个胍基, 探针具有很好的水溶性; 此外, 由于连接体的结构特性, 探针具有很好的稳定性, 在不含弗林蛋白酶的检测体系中, 能够稳定存放至少3 d.探针经弗林蛋白酶转化后, 在545 nm处显示出约25倍荧光增强, 且对弗林蛋白酶具有很好的特异性和灵敏度.我们将探针Nap-F用于成像不同细胞间弗林蛋白酶表达的差异性, 显示探针具有区分癌细胞和正常细胞的能力.此外, 基于缺氧条件下HIF-1与弗林蛋白酶含量之间密切相关性, 我们利用Nap-F成功地观察到CoCl₂固定HIF-1后弗林蛋白酶表达水平的变化, 并进一步探讨缺氧生理环境与细胞癌变的关系.最后, 由于Nap-F的优良双光子光学性质, 该探针也成功地用于肿瘤组织中弗林蛋白酶活性的成像.

  图 1

  

  图 1.  探针Nap-F的结构和其响应机理示意图

  Figure 1.  The response mechanism of Nap-F to furin

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  2.   结果与讨论

  2.1   探针的设计与合成

  近年来, 一些荧光探针被报道并证实了弗林蛋白酶在生理和病理过程中的重要作用.然而, 以往的探针大多采用单光子染料设计, 限制了其在深部组织成像中的应用.因此, 我们选用4-羟基-1, 8-萘酰亚胺为双光子荧光团, 以肽序列Ac-Arg-Val-Arg(Ac-RVRR)为弗林蛋白酶特异性切割底物^{[22, 23]}, 构建探针Nap-F. Nap-F中的自消除连接物(2-氨甲基哌啶)不仅可以减少酶识别的空间位阻, 而且可以稳定探针的结构, 以减少探针的自水解, 消除假阳性信号^[24-26].用不同的肽序列(Ac-RRRV)合成了不能被弗林蛋白酶剪切的对照探针Nap-C(图S1), 以证实Nap-F对弗林蛋白酶的特异性.探针Nap-F和Nap-C的合成如图S2所示, 新化合物的结构通过核磁氢谱(¹H NMR)和质谱(MS)进行了表征.

  2.2   体外响应以及选择性测试

  以酶解法裂解约2×10⁸ 个MDA-MB-468细胞, 得到的细胞裂解液作为弗林蛋白酶的来源.如图 2A所示, 在不加入细胞裂解液的情况下, 以420 nm激发Nap-F和Nap-C的缓冲溶液, 都只检测到微弱的荧光发射; 而加入细胞裂解液后, 细胞裂解液中的弗林蛋白酶激活探针Nap-F, 溶液的荧光强度明显增强, 而Nap-C溶液中的荧光强度没有明显变化.且溶液的荧光强度随时间增长逐渐增强, 在5 h内达到饱和(图 2B); 此外, 如图 2C所示探针Nap-F与不同体积的细胞裂解液在37℃下孵育5 h后, 溶液的荧光增强倍数与细胞裂解液的体积成正相关性, 这表明Nap-F具有定量分析弗林蛋白酶活性的能力(图 2C).且前90 min内, 体系的荧光增强了近10倍, 与之前报道的文献相比, 探针Nap-F展现出更快的响应速度.我们还研究了Nap-F在细胞培养基(DMEM)中的稳定性, 结果是探针即使在细胞培养基中放置3 d也没有检测到明显的荧光增强, 而在加入细胞裂解液后, 检测到明显的信号增强(图 2D).这说明Nap-F在细胞培养基中非常稳定, 不会发生自水解以产生假阳性信号.综上结果表明探针Nap-F适用于缓冲溶液中弗林蛋白酶的检测, 在活细胞中有进一步的应用前景.

  图 2

  

  图 2.  Nap-F的荧光响应曲线. (A) Nap-F和Nap-C在MDA-MB-468细胞裂解液存在或不存在时的荧光响应光谱; (B) Nap-F的时间响应曲线; (C) Nap-F与不同体积的MDA-MB-468细胞裂解液的荧光响应曲线; (D) Nap-F在PBS体系中放置1, 2, 3 d, 及与100 µL细胞裂解液反应5 h后荧光光谱. λ_ex: 420 nm, λ_em: 450~650 nm.

  Figure 2.  (A) Emission spectrum of Nap-F (5 µmol/L) and Nap-C (5 µµmol/L) in the absence/presence of MDA-MB-468 cell lysate; (B) The time-course response of Nap-F after incubation with 100 µL cell lysate for 0~300 min; (C) Nap-F in the presence of various volumes of above cell lysate. (D) The fluorescence intensity of Nap-F after incubation in PBS for 0~3 d or after incubation with 100 µL cell lysate for 5 h. λ_ex: 420 nm, λ_em: 450~650 nm.

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  接下来, 我们考察了Nap-F对弗林蛋白酶的选择性, 以确定Nap-F是否适用于复杂的生物体系.如图S3所示, 只有MDA-MB-468细胞裂解液的加入引起显著的荧光增强.这表明Nap-F对弗林蛋白酶具有高度的特异性, 这是因为探针骨架中的特异性底物序列(Ac-RVRR).探针Nap-F展现出良好的选择性, 有助于探索弗林蛋白酶在生物和生理过程中的作用.我们将探针和细胞裂解液反应产物简单纯化后, 质谱结果表明反应产物确是化合物3, HPLC结果也证明了探针的反应机理(图S4, S5).

  2.3   活细胞荧光成像

  首先, 我们用标准MTS法测试了探针Nap-F对MDA-MB-468细胞活性的影响.如图S6所示, 在0~20 µmol/L的探针浓度范围内, 探针Nap-F对培养细胞的细胞毒性较低, 说明Nap-F适合于生物成像.鉴于其在缓冲溶液中展现出来的良好性能, 我们接下来将Nap-F应用于活细胞中弗林蛋白酶活性的荧光成像. HeLa、HepG2、MDA-MB-468和Lovo细胞分别与探针Nap-F (5 µmol/L)在37 ℃下孵育30 min, 用DPBS洗涤后再进行荧光成像.如图 3A和图S7所示, 在HeLa、HepG2和MDA-MB-468细胞中观察到明亮的荧光信号, 但Lovo细胞中荧光信号很弱, 这是因为HeLa、HepG2和MDA-MB-468细胞系过度表达弗林蛋白酶, 而Lovo细胞是一种弗林蛋白酶缺陷的人类结肠腺癌细胞^{[15, 23]}.在另一组对照实验中, MDA-MB-468细胞与对照探针Nap-C共孵育, 荧光成像结果显示在MDA-MB-468细胞中检测不到荧光信号(图 3B).结果表明, 在单光子和双光子显微镜下, 探针Nap-F能够选择性检测活体细胞内弗林蛋白酶活性并成像.

  图 3

  

  图 3.  (A) Nap-F (5 µmol/L)在不同细胞中的双光子荧光成像; (B) Nap-C在MDA-MB-468细胞中的双光子荧光成像; λ_ex: 820 nm, λ_em: 450~600 nm, 比例尺: 20 μm.

  Figure 3.  (A) Two-photon fluorescent imaging of HeLa, HepG2, MDA-MB-468 cells after being incubated with Nap-F (5 µmol/L) for 30 min; (B) Two-photon fluorescent imaging of MDA-MB-468 cells after being incubated with Nap-C (5 µmol/L) for 30 min. λ_ex: 820 nm, λ_em: 450~600 nm, scale bar: 20 μm.

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  缺氧是实体肿瘤的共同特征, 缺氧环境通过HIF-1的固定化, 极大地促进血管的生成.在正常氧气浓度条件下, HIF经脯氨酰羟化酶羟基化后, 被肿瘤抑制蛋白识别并泛素化, 导致其被降解; 但在缺氧条件下, 这一过程被抑制, HIF在细胞核中持续积累, 起转录因子的作用, 反过来促进多种促血管生成因子的表达, 如血管内皮生长因子(VEGFs)、血管生成素(ANGPTs)、血小板衍生生长因子(PDGFBs), 以促进新血管的形成.这些涉及血管生成过程的各种促血管生成因子是不成熟的前体蛋白, 需要通过弗林蛋白酶等前体蛋白转换酶的作用将他们转变为成熟的形式, 以发挥其功能.我们以CoCl₂ 诱导细胞内HIF-1的固定化, 以构建细胞缺氧的生理环境^[27].如图 4 A, B所示, 用100 µmol/L CoCl₂对HepG2细胞进行预处理, 随着预时间(0~48 h)的延长, 细胞内荧光信号逐渐增强.此外, 在另一组实验中, 我们采用不同浓度的CoCl₂ (0~100 µmol/L)对细胞进行预处理48 h.结果显示, 随着CoCl₂浓度的增加, 细胞中的荧光信号逐渐增强(图 4 C, D).因此, 我们可以得出结论:随着细胞缺氧程度的加剧, 细胞内弗林蛋白酶的活性逐渐升高, 从而更多的染料被释放出来, 表现为荧光信号的逐渐增强.因此, 探针Nap-F能够用于肿瘤细胞缺氧检测.目前大多数缺氧荧光探针是基于硝基还原酶等设计的, 而这类探针容易受到肿瘤细胞还原性物质, 如GSH, 和细菌感染的干扰, 而探针Nap-F能够有效克服这些问题, 或许能够成为一种高保真的肿瘤缺氧探针.

  图 4

  

  图 4.  (A) 细胞缺氧、HIF-1与弗林蛋白酶的内在联系示意图; HepG2细胞缺氧成像, 细胞经CoCl₂预处理后, 与探针Nap-F (2 µmol/L)共孵育30 min后成像, (B)保持CoCl₂ 浓度为100 µmol/L, 诱导HIF-1固定化不同时间后(0~48 h)的细胞成像; (C)采用不同浓度CoCl₂ (0~100 µmol/L)诱导HIF-1固定化48 h后的细胞成像; (D) 图 4 B, C各图的平均荧光强度, 将0 h或者0 µmol/L的图的荧光强度定义为1.0. λ_ex: 820 nm, λ_em: 450-600 nm.

  Figure 4.  (A) Intrinsic Relationship between Hypoxia, Furin, and Tumors; (B) Two-photon fluorescent imaging of HepG2 cells after being pretreated with 100 µmol/L CoCl₂ for different time followed by co-incubated with Nap-F (2 µmol/L) for 30 min; (C) Two-photon fluorescent imaging of HepG2 cells after being pretreated with different concentration of CoCl₂ for 48 h followed by co-incubated with Nap-F (2 µmol/L) for 30 min; (D) Average intensity in different incubation time found in Figure 4B, C; that of t＝0 h or 0 µmol/L average intensity was defined as 1.0. λ_ex: 820 nm, λ_em: 450~600 nm.

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  2.4   肿瘤组织成像

  最后, 为了展示双光子荧光探针在深层组织成像的优势, 我们将探针Nap-F应用于肿瘤组织成像.在Z扫描模式下, 双光子荧光信号强度随扫描深度的变化如图 5所示.结果表明, 探针Nap-F能够很好的染色肿瘤组织, 并且成功实现双光子荧光成像肿瘤组织中的弗林蛋白酶活性, 成像深度范围为30~140 μm.这一系列成像结果不仅证明了探针Nap-F具有优异的双光子性质, 也表明了其具有深层组织成像的能力.

  图 5

  

  图 5.  肿瘤组织30~140 μm范围的双光子荧光成像; 4T-1肿瘤组织与探针Nap-F (20 µmol/L)在37 ℃下共孵育2 h后成像, λ_ex: 820 nm, λ_em: 450~600 nm, 比例尺: 100 μm.

  Figure 5.  Two-photon fluorescence imaging of 4T-1 tumor tissues after co-incubated with Nap-F (20 µmol/L), the images showed the different depths of tumor tissue from 40 to 140 µmol/L. λ_ex: 820 nm, λ_em: 450~600 nm, scale bar: 100 μm.

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  3.   结论

  在本工作中, 我们构建了一个新型双光子荧光探针Nap-F用于细胞内弗林蛋白酶的检测与双光子成像. Nap-F是由经典双光子荧光染料1, 8-萘酰亚胺、弗林蛋白酶特异性多肽序列RVRR和自消除连接体整合而成.同时, 通过改变底物序列顺序(RRRV), 我们还合成了对比探针Nap-C.在缓冲溶液体系中, 我们证实了探针Nap-F对弗林蛋白酶具有高度的特异性, 能够定量检测弗林蛋白酶的活性.此外, 探针表现出很好的稳定性, 在不含目标物的检测体系中放置3 d仍未见假阳性信号.采用飞秒激光820 nm激发下, Nap-F能有效降低生物背景, 并提高组织穿透深度, 适用于细胞和组织的双光子成像.探针成功地实现了对几种活细胞中弗林蛋白酶的双光子成像, 揭示了癌细胞和表达缺陷细胞中弗林蛋白酶含量的差异, 表明弗林蛋白酶可作为监测肿瘤发生、发展的靶标分子.更重要的是, 我们将该探针用于CoCl₂固定HIF-1构建的肿瘤细胞缺氧模型成像, 实验结果表明弗林蛋白酶的表达与肿瘤细胞缺氧程度存在正相关性. Nap-F能够解决基于硝基还原酶的缺氧探针假阳性等问题, 有望成为一种高保真的肿瘤缺氧探针.双光子肿瘤组织成像结果表明Nap-F具有很好的组织穿透深度. Nap-F有望应用于生物医学样品中弗林蛋白酶的检测, 成为监测肿瘤发生、转移和诊断的有力工具.

  4.   实验部分

  4.1   探针的合成

  探针的合成路线如支持信息图S2所示.双光子荧光染料3按照文献报道方法合成^[28]. ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 11.92 (s, 1H), 8.55~8.51 (d, J＝8.52 Hz, 1H), 8.48~8.44 (d, J＝8.45 Hz, 1H), 8.37~8.33 (d, J＝8.34 Hz, 1H), 7.79~7.73 (t, J＝7.75 Hz, 1H), 7.20~7.16 (d, J＝7.16 Hz, 1H), 4.06~4.02 (t, J＝4.02 Hz, 2H), 1.65~1.62 (t, J＝1.60 Hz, 2H), 1.40~1.34 (m, 2H), 0.99~0.96 (t, J＝0.94 Hz, 3H); ¹³C NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ: 164.07, 163.40, 160.66, 133.89, 131.46, 129.57, 129.24, 125.93, 122.79, 122.21, 113.04, 110.37, 39.54, 30.21, 20.29, 14.16. MS (ESI) m/z: 268.14 (calcd for C₁₆H₁₅NO₃ [M-H]^－ 269.11).

  Pbf保护的AcRVRR序列和化合4均按照我们已报道的方法(多肽固相合成法)合成^{[12, 13]}, Pbf保护的AcRVRR质谱结果为MS (ESI) m/z: 1383.58 (calcd for C₆₄H₉₇N₁₃O₁₅S₃ [M+H]⁺ 1383.64). 化合4质谱结果为MS (ESI) m/z: 1480.54 (calcd. for C₇₀H₁₀₉N₁₅O₁₄S₃ [M+H]⁺ 1479.74).

  将化合物3 (105.3 mg, 0.39 mmol)和三光气(500.0 mg, 1.68 mmol)加入250 mL双颈圆底烧瓶中, 在氮气保护下经注射器加入25 mL干燥二氯甲烷.将瓶子放在冰浴中, 然后通过注射器加入0.5 mL DIPEA.将反应液在冰浴中反应1 h, 然后在室温下继续搅拌12 h.然后减压蒸发有机溶剂至干燥, 以氢氧化钠溶液作为尾气装置吸收光气.用注射器向反应瓶中加入溶于20 mL干燥二氯甲烷中的化合物4 (500.0 mg, 1.68 mmol)和DIPEA (0.5 mL), 室温搅拌10 h后, 减压浓缩反应混合物, 得到固体残渣.将固体残留物重新溶解在二氯甲烷/三氟乙酸(V_二氯甲烷:V_三氟乙酸＝1:99)中的混合溶液中, 再加入三异丙基硅烷(TIPS, 100μL), 室温下搅拌3 h, 减压蒸馏去掉溶剂, 通过高效液相色谱法(HPLC)提纯产物, 产量: 171.5 mg (67%).探针Nap-F的质谱结果为MS (ESI) m/z: 1019.53 (calcd for C₄₈H₇₄N₁₆O₉ [M+H]⁺ 1018.58). 对照探针Nap-C的合成方法与Nap-F一致, 仅换用序列为RRRV的多肽序列即可.

  4.2   缓冲溶液中的响应性能考察

  本实验中以MDA-MB-468细胞裂解提取液作为弗林蛋白酶来源.将MDA-MB-468细胞接种生长到90%细胞密度时进行裂解实验.将培养皿中培养基吸出并弃置, 用DPBS漂洗细胞三次并保证尽可能少的DPBS残留液; 随后加入200 μL RIPA裂解液, 置于摇床低速均匀摇晃10~15 min, 使细胞充分裂解.裂解结束后, 收集裂解液, 并以13000 r/min转速进行离心, 取上层澄清悬浮液, 放置在－80 ℃保存.实验中所需的其他细胞裂解液与上述操作相同.

  将探针Nap-F和Nap-C配制成1×10^－4 mol/L的DMSO储备液, 4 ℃下避光保存备用.紫外光谱及荧光光谱测定均在标准缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl, pH＝7.4, 1 mmol/L Ca²⁺, 5 mmol/L Mg²⁺, 0.1% Triton X-100)中进行, 反应温度为37 ℃.激发波长设置为420 nm, 发射波长接收范围设置为450~650 nm, 狭缝宽度均为3 nm.选择性实验中用到的测试物用二次水溶解稀释成所需浓度.测量时, 探针最终浓度为5 µmol/L.

  4.3   高效液相色谱(HPLC)分析

  用体积分数为1‰的TFA水溶液和乙腈溶液作为实验流动相; 实验所用色谱分离柱为反向分离柱.对化合物3, Nap-F以及Nap-F与细胞裂解的反应体系依次进行分离和定性分析.本实验采用梯度洗脱来实现各成分间的分离; 通过调节流动相H₂O/CH₃CN的体积比, 从9:1到4:6, 从而达到较好的分离效果.利用紫外检测系统收集样品中吸光度位于390 nm处的实时信息.

  4.4   细胞毒性实验

  采用MTS (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)法评估探针Nap-F的细胞毒性.将MDA-MB-468细胞以每孔1×10⁴个细胞接种于96孔板, 24 h后用不同浓度(2.5~20 µmol/L)的Nap-F共孵育24 h.随后, 弃去孔中培养基, 并以200 μL DPBS洗涤小孔三次, 再向每孔中加入20 μL MTS和80 μL培养基, 并在37℃恒温培养箱中孵育2 h.用酶标仪测量490 nm处的吸光度, 进而计算细胞的存活率.

  4.5   细胞成像实验

  将HeLa、HepG2、Lovo和MDA-MB-468四种细胞分别接种至光学培养皿中并培养至密度约为80%.用DPBS漂洗细胞, 换用新鲜培养基后, 加入Nap-F于37 ℃恒温培养箱中与其共孵育30 min, 用DPBS洗涤三次, 然后于荧光共聚焦显微镜上进行细胞成像.探针的成像浓度为5 µmol/L, 单、双光子荧光共聚焦成像激发波长分别为设置为405和820 nm, 发射接收波长分别为500~600 nm和450~600 nm.

  在CoCl₂构建的细胞缺氧模型成像实验中, 先将HepG₂细胞接种至光学培养皿中培养至密度约为80%, 然后用DPBS漂洗细胞, 为了诱导细胞内HIF-1不同程度的固定化, 以不含FBS的新鲜DMEM培养基培养细胞, 与100 µmol/L的CoCl₂共同孵育0, 4, 8, 12, 24和48 h; 或与不同浓度的CoCl₂ (0, 10, 25, 50, 75和100 µmol/L)共孵育48 h, 然后更换培养基10%并加入探针Nap-F (最终浓度为2 µmol/L)继续孵育30 min, 再进行细胞成像.仪器参数与上述细胞成像参数一致.

  4.6   肿瘤组织成像实验

  将1×10⁵个4T-1细胞分散在100 μL的DPBS中, 注射到五周大的雄性BALB/c鼠(SJA Co., Ltd. Changsha, China)左上肢. 4周后, 肿瘤长到600 mm³大小, 然后剥出肿瘤, 冰冻24 h, 制备切片.待冷冻的肿瘤组织恢复至室温后, 与20 µmol/L Nap-F在37 ℃下共孵育2 h, 用DPBS漂洗切片3次, 随后于进行荧光成像, 用Z-扫描模式收集不同组织深度处的荧光图像.组织成像的激发波长与发射波长与上述细胞成像一致.

  
  
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  图 1  探针Nap-F的结构和其响应机理示意图

  Figure 1  The response mechanism of Nap-F to furin

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  图 2  Nap-F的荧光响应曲线. (A) Nap-F和Nap-C在MDA-MB-468细胞裂解液存在或不存在时的荧光响应光谱; (B) Nap-F的时间响应曲线; (C) Nap-F与不同体积的MDA-MB-468细胞裂解液的荧光响应曲线; (D) Nap-F在PBS体系中放置1, 2, 3 d, 及与100 µL细胞裂解液反应5 h后荧光光谱. λ_ex: 420 nm, λ_em: 450~650 nm.

  Figure 2  (A) Emission spectrum of Nap-F (5 µmol/L) and Nap-C (5 µµmol/L) in the absence/presence of MDA-MB-468 cell lysate; (B) The time-course response of Nap-F after incubation with 100 µL cell lysate for 0~300 min; (C) Nap-F in the presence of various volumes of above cell lysate. (D) The fluorescence intensity of Nap-F after incubation in PBS for 0~3 d or after incubation with 100 µL cell lysate for 5 h. λ_ex: 420 nm, λ_em: 450~650 nm.

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  图 3  (A) Nap-F (5 µmol/L)在不同细胞中的双光子荧光成像; (B) Nap-C在MDA-MB-468细胞中的双光子荧光成像; λ_ex: 820 nm, λ_em: 450~600 nm, 比例尺: 20 μm.

  Figure 3  (A) Two-photon fluorescent imaging of HeLa, HepG2, MDA-MB-468 cells after being incubated with Nap-F (5 µmol/L) for 30 min; (B) Two-photon fluorescent imaging of MDA-MB-468 cells after being incubated with Nap-C (5 µmol/L) for 30 min. λ_ex: 820 nm, λ_em: 450~600 nm, scale bar: 20 μm.

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  图 4  (A) 细胞缺氧、HIF-1与弗林蛋白酶的内在联系示意图; HepG2细胞缺氧成像, 细胞经CoCl₂预处理后, 与探针Nap-F (2 µmol/L)共孵育30 min后成像, (B)保持CoCl₂ 浓度为100 µmol/L, 诱导HIF-1固定化不同时间后(0~48 h)的细胞成像; (C)采用不同浓度CoCl₂ (0~100 µmol/L)诱导HIF-1固定化48 h后的细胞成像; (D) 图 4 B, C各图的平均荧光强度, 将0 h或者0 µmol/L的图的荧光强度定义为1.0. λ_ex: 820 nm, λ_em: 450-600 nm.

  Figure 4  (A) Intrinsic Relationship between Hypoxia, Furin, and Tumors; (B) Two-photon fluorescent imaging of HepG2 cells after being pretreated with 100 µmol/L CoCl₂ for different time followed by co-incubated with Nap-F (2 µmol/L) for 30 min; (C) Two-photon fluorescent imaging of HepG2 cells after being pretreated with different concentration of CoCl₂ for 48 h followed by co-incubated with Nap-F (2 µmol/L) for 30 min; (D) Average intensity in different incubation time found in Figure 4B, C; that of t＝0 h or 0 µmol/L average intensity was defined as 1.0. λ_ex: 820 nm, λ_em: 450~600 nm.

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  图 5  肿瘤组织30~140 μm范围的双光子荧光成像; 4T-1肿瘤组织与探针Nap-F (20 µmol/L)在37 ℃下共孵育2 h后成像, λ_ex: 820 nm, λ_em: 450~600 nm, 比例尺: 100 μm.

  Figure 5  Two-photon fluorescence imaging of 4T-1 tumor tissues after co-incubated with Nap-F (20 µmol/L), the images showed the different depths of tumor tissue from 40 to 140 µmol/L. λ_ex: 820 nm, λ_em: 450~600 nm, scale bar: 100 μm.

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