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新型抗糖尿病铬(Ⅲ)配合物的合成和生物活性及机理探究

董金龙 ,  沈腊珍 ,  文斌 ,  宋珍 ,  冯俊杰 ,  梁钢 ,  刘斌 ,  杨斌盛

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引用本文: 董金龙, 沈腊珍, 文斌, 宋珍, 冯俊杰, 梁钢, 刘斌, 杨斌盛. 新型抗糖尿病铬(Ⅲ)配合物的合成和生物活性及机理探究[J]. 化学学报, 2020, 78(11): 1260-1267. doi: 10.6023/A20070285 shu
Citation:  Dong Jinlong, Shen Lazhen, Wen Bin, Song Zhen, Feng Junjie, Liang Gang, Liu Bin, Yang Binsheng. Synthesis of A Novel Anti-diabetes Chromium(Ⅲ) Complex and Investigation of Its Biological Activity and Mechanism[J]. Acta Chimica Sinica, 2020, 78(11): 1260-1267. doi: 10.6023/A20070285 shu

新型抗糖尿病铬(Ⅲ)配合物的合成和生物活性及机理探究

  • a.

    太原师范学院化学系 晋中 030619

  • b.

    山西大学分子科学研究所 化学生物学与分子工程教育部重点实验室 太原 030006

  • c.

    山西医科大学第一医院病理科 太原 030001

    • 通讯作者: 董金龙, E-mail: dongjinlong20123@163.com; 杨斌盛, yangbs@sxu.edu.cn
  • 基金项目:

    项目受国家自然科学基金（Nos.21571117，21701121）、山西省自然科学基金（No.201801D121064）、山西高校科技项目（No.2019L0818）和太原师范学院大学生创新创业项目（No.CXCY1905）资助

摘要: 为了寻找新型的抗糖尿病分子，以苯乙双胍为前体，制备了苯乙双胍铬（Ⅲ）配合物.通过元素分析、摩尔电导率、电喷雾质谱、红外光谱、紫外可见光谱和核磁共振波谱对配合物的结构进行了表征，并研究了配合物在不同温度、不同pH值下溶液的稳定性、与H2O2的反应性和形貌.同时，构建了糖尿病C57小鼠模型，研究了其生物活性和毒性.结果证明，配合物对其活性指标均有好的抑制作用，保留了苯乙双胍的降糖性质，对机体是无毒的，并且通过MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐）实验说明配合物的生物相容性较好，实现了金属配合物降糖与控脂的多功能化应用.在此基础上，通过光谱法研究了配合物与胰高血糖素的相互作用，表明配合物对胰高血糖素是静态猝灭以较强的作用力结合，条件结合常数为1.29×105 L·mol-1，结合位点数约为1，初步提出了配合物的新的降糖机制.

English

  • 1.   引言

    糖尿病是一种导致严重并发症的慢性疾病, 影响全球超过4.25亿人[1].随着人们生活质量的提高、饮食结构的改变和体力劳动的减少, 二型糖尿病(T2DM)成为继癌症、心血管疾病之后的第三大慢性非传染性疾病, 其发病率在全球呈逐年递增的趋势[2-4]. T2DM极大地影响着人们的健康, 已成为当今威胁人类健康的重要疾病, 因此, 有效地对之予以防治具有十分重要的意义.

    早在20世纪50年代, Mertz和Schwartz提出铬(Ⅲ)是葡萄糖耐量因子(glucose tolerance factor, GTF)的中心活性组分, GTF可增强组织对胰岛素的敏感性, 促进体内葡萄糖转化为其它物质[5, 6].值得注意的是, 随着年龄的增长三价铬离子会慢慢随体液流失, 进而导致GTF分子结构的不完整, GTF的生物学效应也会减弱甚至丧失[7], 因此, 外源性的补充铬(Ⅲ)对机体糖代谢具有较重要的意义.目前, 市场上销售的铬酵母片、吡啶甲酸铬等各种营养铬(Ⅲ)产品, 种类繁多, 非常畅销.无机铬(Ⅲ)吸收较差, 而三价铬可以与多种氨基酸、有机物、药物等形成配合物, 例如:吡啶甲酸铬、烟酸铬、苯丙氨酸铬、柠檬酸铬、水杨酸铬等, 提高吸收率的同时, 可以发挥多种生物学效应, 并且有利于改善糖耐量、调节血脂和预防心脑血管等疾病[8-10].因此, 开发新型功能性营养补铬(Ⅲ)产品具有战略性的意义.

    本课题组在水杨酸铬(Ⅲ)研发的基础上[11-14], 选用双胍类降血糖药苯乙双胍为配体, 与Cr(Ⅲ)配位制备了新型苯乙双胍铬(Ⅲ)配合物, 对其结构进行了表征并研究了其稳定性和抗氧化性; 进一步通过链脲佐菌素诱导C57小鼠致糖尿病鼠模型, 进行了12周的药物干预实验研究了其生物活性, 取得了较好的降糖效果.在此研究基础上, 为更进一步探究该化合物的降糖机制, 采用与糖尿病病因相关的胰高血糖素(glucagon)为靶点[15], 研究了配合物与胰高血糖素的相互作用, 旨在为其在糖尿病中的辅助治疗提供新的方案, 未来也有可能实现铬(Ⅲ)配合物临床药物开发和应用的突破, 本工作研究思路如图 1所示.

    图 1

    图 1.  研究思路框图
    Figure 1.  Conceptual framework
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    2.   结果与讨论

    2.1   配合物的表征与结构

    配合物的合成是通过盐酸苯乙双胍在强碱环境中, 与三氯化铬按物质的量比3:1在室温下进行反应, 生成了红色固体, 经过乙醚乙醇洗涤生成较纯的红色配合物. C、H、N含量通过EURO EA3000元素分析仪测定, 由分子式CrC30H45N15Cl3计算结果(%): C 46.55, H 5.86, N 27.14;实验结果(%): C 46.08, H 5.91, N 27.03, 理论计算值与实验值基本一致; 摩尔电导率测试值为131.7 μs·cm-1 (10-3 mol·L-1, DMSO), 表明配合物是多电荷的物质; 电喷雾质谱图上(见图S1) ESI-MS (m/z):理论计算结果: 222.4462 [M/3]+, 实验检测结果: 222.1349 [M/3]+, 二者结果基本吻合.

    红外图谱(IR, 见图S2), 在苯乙双胍图上高频区3318~3164 cm-1处强的单、双峰分别是NH2, NH伸缩振动所致, 与Cr(Ⅲ)发生配位形成配合物后, 在3333 cm-1处呈现出一个宽且尖的峰, 这是由于Cr(Ⅲ)与NH配位发生了缔合作用, 而且在这个区域未出现H2O的特征峰; 配合物图上在1511, 1583和1664 cm-1处的吸收峰, 推断Cr(Ⅲ)与NH上的N进行了配位; 最后, 配合物图上指纹区420 cm-1处出现两个新的伸缩振动是Cr—N的配位键[16].

    配合物的1H NMR和13C NMR图谱见支撑信息图S3和S4.因为三价铬Cr的顺磁性, 1H NMR图上在δ 7.22~7.59呈现出宽峰, 是配体苯环上的H; δ 5.44和2.78处的强峰分别是胺基和甲基上的H; δ 2.51和3.35的强峰是氘代DMSO的峰.在13C NMR图上, δ 55.47, 79.75, 126.69和128.90处的三个弱峰依次归属配体上的甲基、苯环和胺基上的C.

    图 2(a)是配合物的紫外-吸收图谱, 苯乙双胍在210和236 nm处有两个紫外吸收, 而配合物在220 nm右侧有一个约232 nm的肩峰, 这是Cr(Ⅲ)与苯乙双胍配位后发生轻微的蓝移, 谱带的移动证明配体上的电子云向Cr(Ⅲ)的空d轨道发生移动; 此外, 381和500 nm处的两个宽吸收峰是配合物Cr(Ⅲ)的d-d跃迁峰, 与Cr(H2O)63+跃迁峰406和574 nm对比[14], 分别发生了25和74 nm的蓝移, 可推断Cr(Ⅲ)与双胍上的NH发生了双齿配位.同时, 381和500 nm的两个跃迁峰被分别归属于4A2g→4T2g (F)和4A2g→4T1g (P), 这也证明了三价铬的假八面体[CrN6]构型[17, 18].

    图 2

    图 2.  (a) 苯乙双胍和配合物的吸收光谱, (b)配合物结构
    Figure 2.  (a) Absorption spectra of Phf and CrPhf, (b) structure of CrPhf. [Phf]=2.0×10-5 mol·L-1, [CrPhf]=4.0×10-5 mol·L-1, [CrPhf(dd)]=2.0×10-3 mol·L-1
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    综上, 经过元素分析、电导率、电喷雾质谱、红外、核磁和紫外的细致分析, 拟推断苯乙双胍铬(Ⅲ)的结构式:一个铬(Ⅲ)与三个苯乙双胍配位形成稳定的Cr[Phf]3+的多电荷离子, 三个Cl-作为平衡离子, 如图 2(b)所示, 而此结构与杨小平等[10]研究的苯丙氨酸铬的结构相近.

    2.2   配合物的稳定性

    配合物的稳定性与其体内细胞的摄取、分布、作用机制、代谢和生物活性及毒性等药理学性质紧密相关, 所以研究配合物的稳定性对探究其生物活性和机制非常重要. pH值和温度对溶液中配合物稳定性的影响是研究生物活性比较重要的两个因素条件.通过生理pH值和不同温度条件下的吸收光谱的变化推测配合物在生物体内是否发生解离或水解, 这样可以为深入探究配合物降糖降脂的作用机制和体内的转运情况, 提供理论指导.实验是模拟三个生理环境, 现配制的配合物, 静置在pH 2.2(胃液)、7.4(体液)和8.0(小肠)溶液中, 或在25~60 ℃不同温度下(pH=7.4的PBS缓冲溶液)分别放置15 min后, 测定紫外-可见吸收光谱, 结果如图 3所示.

    图 3

    图 3.  配合物在不同条件下的吸收光谱
    Figure 3.  Absorption spectra of complex under different conditions
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    从图 3上看, 配合物在pH从2.2到8.0的变化过程中, 紫外区和d-d跃迁峰发生明显的红移, 可能是配合物在从胃到小肠过程中慢慢发生了解离; 而配合物在不同温度影响下, 紫外区的吸光度值随着温度的升高而增大且轻微红移, 而d-d跃迁峰的变化不是很大, 说明配合物在温度高于37 ℃开始发生解离.因此, 在研究其生物活性和其与蛋白、多肽结合作用时, 需要在体温条件下进行实验.

    2.3   配合物的热分解性

    热分解性对于研究配合物的固态稳定性是又一重要性质, 配合物的热分解在Netzsch STA 2500 Regulus综合热分析仪上进行, 热失重变化结果如图 4所示.

    图 4

    图 4.  配合物的热重分析
    Figure 4.  Thermogravimetric analysis of complex
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    图 4热重和量热曲线可以看出, 配合物在100 ℃后开始分解, 并且热分解分5个过程完成, 说明配合物的固态稳定性也非常好.

    2.4   配合物与双氧水的作用

    众所周知, Cr(Ⅵ)有毒害可致癌[19], 因此, 在设计有机铬(Ⅲ)补充剂时, 对其氧化性的研究成为必需.已有诸多文献报道Cr(Ⅲ)配合物在细胞外会被部分氧化为Cr(Ⅴ)或Cr(Ⅵ)[19, 20], 因为Lay等[21, 22]提出了铬(Ⅲ)降糖作用机制是在生理条件下Cr(Ⅲ)被H2O2或ClO-氧化成Cr(Ⅴ)或Cr(Ⅵ), 然后在二硫苏糖醇(DTT)还原剂作用下抑制了蛋白质酪氨酸磷酸脂酶(PTPs)的活性或是阻止了其表达, 从而推断Cr(Ⅲ)的抗糖尿病性质可能与Cr(Ⅴ)和Cr(Ⅵ)离子有间接关系.本研究根据体内特征模拟了三个生理条件: pH为7.4缓冲溶液(PBS), 细胞培养液(DMEM)和人血清白蛋白(HSA), 分别配置浓度为1.0×10-4 mol·L-1的配合物溶液, 各自移取1 mL于EP管中, 加入2 µL H2O2 (30%), 静置在(37±0.5) ℃水浴中、反应3.5 h, 取出后摇匀, 加入1 mL 1, 5-二苯卡巴肼(0.01 g·mL-1, 乙醇)指示剂, 再加入20 µL浓H2SO4, 溶液立即从无色变成了紫色(介质做空白), 在548 nm下测其吸光度A[23], 结果如图 5所示, 结果表明, 在未添加H2O2时, 在各介质中, 仅少量Cr(Ⅲ)被空气氧化为Cr(Ⅵ), 比较稳定.而添加了H2O2后, Cr(Ⅲ)在各个生理条件下都被氧化为Cr(Ⅵ)离子, 这与Lay等的实验结果相一致.

    图 5

    图 5.  配合物在不同介质中加和不加H2O2氧化后的吸收光谱
    Figure 5.  Absorption spectra of complex oxidized by H2O2 (with and wihout) in different media
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    2.5   配合物的SEM和XRD

    由于配合物经过多次结晶都得不到单晶, 因此, 测试了配合物的扫描电镜SEM和X粉末衍射XRD, 结果如图 6所示.

    图 6

    图 6.  配合物的扫描电镜(a), 配体和配合物X粉末衍射图谱(b, c)
    Figure 6.  SEM photo of complex (a), XRD patterns of ligand and complex (b, c)
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    从扫描电镜图 6(a)上看, 配合物有比较好的均匀性, 得到了较清晰的大颗粒, 但形状不规则无形状.粉末衍射图 6(b, c)上, 配体峰形规则说明具有透明有序的晶型, 而形成的铬(Ⅲ)配合物后, 就一个大包峰表明失去了配体的晶形完全变为非晶态的化合物, 这也揭示出该配合物不易获得可单晶测试的晶体.

    2.6   配合物的降糖活性

    本工作以二甲双胍为阳性对照物, 无机盐CrCl3和配合物对糖尿病模型鼠进行12周的干预实验, 结果见表 1.生化及代谢检测结果:与对照组相比, 模型组及干预组空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)显著增高, 差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组相比, 干预组FPG, FINS, TG显著降低, 差异有统计学意义(P＜0.05);与阳性对照物二甲双胍组比较, 无机盐CrCl3干预后的活性指标降低变化不是很显著, 而配合物干预后的生物活性各项指标改善较明显, 差异有统计学意义(P＜0.05); HDL和LDL的变化, 没有显著的规律; 糖尿病与正常组小鼠的体重(BW)相比有显著的增加, 但是干预组并未对小鼠的BW造成明显的改变, 具体结果见表 1.整体上, 配合物对糖尿病小鼠的生理指标的改善效果与预期的一样, 这个可能与配合物设计的结构和性质有较大的关系, 具体的药理作用机制还有待进一步的实验论证.同时, 结果也与二甲双胍铬的活性降糖结果一致[24].

    表 1

    表 1  各组小鼠生化及代谢指标结果
    Table 1.  Results of biochemical and metabolic indexes of rats in each group
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    Week Normal Diabetic CrCl3-treated Met-treated 1-treated
    BM/g 0 19.24±1.16 23.62±2.05 24.14±2.14 21.59±2.93 22.92±1.86
    4 22.45±1.55 30.5±2.40 29.42±1.62 28.64±0.82 29.28±1.86
    8
    12    		 29.35±1.48
    32.26±1.28    		 40.82±2.18
    48.26±3.00    		 37.89±3.01
    44.94±3.01    		 37.28±2.63
    43.08±3.11    		 39.17±1.77
    44.64±1.73
    FBG/ (mmol·L-1) 0 6.07±0.32* 11.59±0.39# 11.18±0.61# 13.47±0.57# 12.45±0.62#
    4 5.54±0.23* 11.50±0.52# 9.92±0.28#* 9.95±0.52# 9.83±0.40#
    8
    12    		 5.60±0.20*
    5.64±0.21*    		 11.37±0.35#
    11.70±0.58#    		 8.84±0.30#*
    8.76±0.35#*    		 8.62±0.38#
    7.72±0.34#    		 8.96±0.51#
    7.88±0.34#
    FINS/ (pmol·L-1) 0 12.36±1.50* 19.13±1.21# 19.80±0.54# 18.78±1.60# 19.97±0.67#
    4 11.49±0.52* 21.71±0.52# 17.23±0.91#* 19.64±0.58#* 18.22±0.65#
    8
    12    		 11.25±0.34*
    11.55±0.38*    		 21.11±0.66#
    19.89±0.46#    		 17.22±0.86#*
    15.99±0.76#*    		 18.40±0.58#*
    14.87±0.72#*    		 17.20±0.54#
    15.28±0.59#
    TC/ (mmol·L-1) 0 1.92±0.15* 4.66±0.64# 4.28±0.32# 4.41±0.74# 4.45±0.34#
    4 1.74±0.12* 4.17±0.32# 3.77±0.19# 3.90±0.26# 3.34±0.20#
    8
    12    		 1.92±0.093*
    1.95±0.083*    		 4.68±0.23
    4.14±0.24#    		 3.50±0.24#*
    3.66±0.28#    		 3.68±0.20#
    3.51±0.20#    		 3.08±0.19#
    2.88±0.22#
    TG/ (mmol·L-1) 0 0.55±0.050 1.63±0.22 2.02±0.19 1.77±0.22 1.79±0.12
    4 0.50±0.043* 1.92±0.21# 1.87±0.20* 1.70±0.22# 1.49±0.11#
    8
    12    		 0.52±0.026*
    0.53±0.029*    		 2.04±0.21#
    2.41±0.23#    		 1.63±0.14*
    1.69±0.24*    		 1.72±0.11#
    1.67±0.15*    		 1.29±0.12#
    1.21±0.13#
    HDL/ (mmol·L-1) 0 1.31±0.09* 0.90±0.099# 0.87±0.062# 0.82±0.070# 0.91±0.07#
    4 1.24±0.092* 0.80±0.064# 0.98±0.059# 0.86±0.081# 0.96±0.053#
    8
    12    		 1.19±0.086*
    1.21±0.081*    		 0.75±0.040#
    0.79±0.033#    		 0.86±0.049#
    0.90±0.050#    		 0.86±0.080#
    0.84±0.080#    		 0.89±0.056#
    0.94±0.052#
    LDL/ (mmol·L-1) 0 0.75±0.064 0.87±0.050 0.85±0.095 0.80±0.061 1.02±0.06
    4 0.68±0.027* 0.99±0.064# 0.76±0.052* 0.81±0.050# 0.83±0.053#
    8
    12    		 0.70±0.024*
    0.71±0.028*    		 1.09±0.062#
    0.99±0.054#    		 0.81±0.066*
    0.84±0.040#    		 0.81±0.050#
    0.8±0.036#    		 0.81±0.05#
    0.80±0.034#

    2.7   配合物的毒性评价

    2.7.1   口服毒性

    药物分子口服毒性的评价通常是研究药物在体内生物活性的第一步.经过12周的化合物干预后, 没有出现小鼠死亡.实验结束后根据病理切片实验方法, 取出小鼠胰腺、肝和肾部分组织经过染色处理后使用双目光学显微镜观察其组织病理变化并拍照, 结果如图 7.

    图 7

    图 7.  CrCl3、Met和配合物干预后的胰腺、肝和肾脏部分病理组织图像
    Figure 7.  Histopathological images of pancreas, kidney and liver sections treated CrCl3, Met and complex
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    在图 7中, 对照组与各实验组小鼠胰腺组织切面呈现出正常的胰腺腺泡和导管细胞结构, 而且内分泌结构和许多收集小管也是正常的.关于胰腺的组织水肿和炎症反应没有观察到.配合物干预组的胰腺上可以看到一些粘液, 是胰腺导管分泌的蛋白液, 属于正常分泌物.小鼠肾脏的组织切片也全部呈现为正常结构的间质组织, 既无炎症反应, 也没有肾间质纤维化的反应.最后, 小鼠的肝脏中央静脉、肝细胞索、汇管区等结构清晰, 同时也没有观察到轻度单核细胞的过滤和肝细胞结构的轻度损伤.从病理切片实验结果看, 铬和其配合物对胰腺、肝脏和肾脏均没有影响, 初步估计苯乙双胍铬配合物对生物机体是无伤害的.

    2.7.2   MTT分析

    使用酶标分析仪测试了细胞的活性, 其结果如图 8. 1% DMSO被作为对照, CrCl3、Phf和三个浓度的CrPhf.结果证明, 除了高浓度配合物作用后的存活率低于80%以下, 其它两个浓度的细胞的存活率都高于95%, 表明配合物CrPhf对MCF-7 cells是无毒的且生物相容性也是很好的.

    图 8

    图 8.  配合物对细胞的毒性作用.通过MTT试验, 苯乙双胍Phf (10 μmol·L-1)和配合物CrPhf (1, 10, 100 μmol·L-1)对MCF-7癌细胞(2.5×104 cells/mL)作用的细胞毒性评价, 体积比为1% DMSO作为对照(P＜0.05), 结果是通过6次平行实验的±标准偏差.
    Figure 8.  Cytotoxic effect of complex on cell lines. The cytotoxicity of Phf (10 μmol·L-1) and complex (1, 10, 100 μmol·L-1) were evaluated on MCF-7 cell lines (2.5×104 cells/mL) by the MTT assay for 24 h. 1% DMSO (V/V) was used as a control experiment (P < 0.05). Results are mean±SD of six independent experiments.
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    2.8   配合物与胰高血糖素作用

    为了探索配合物的生物降糖机制, 我们选取胰高血糖素(glucagon)为对象, 通过荧光光谱法研究与配合物的结合作用. Glucagon是一种由胰脏胰岛α-细胞分泌的激素, 与胰岛素的生物学功能恰好相反, 因此又称抗胰岛素. Glucagon经过cAMP-PK系统, 激活肝细胞的磷酸化酶, 加速糖原分解.若glucagon分泌过剩了, 就会表现出高血糖症, 因此有效抑制glucagon的过量分泌, 可能有助于防止糖尿病的发病.临床已公认, 糖尿病是由于α细胞分泌glucagon的过量和胰岛β细胞分泌胰岛素的不足所共同导致, glucagon成为治疗Ⅱ型糖尿病的新靶点[15]. Glucagon的分子结构中含有1个色氨酸和2个酪氨酸残基使其具有内源性荧光, 而色氨酸残基的内源荧光通常被用作蛋白分子与化合物作用的有效光谱探针.

    在温度(37±0.5) ℃, 设定激发和发射光栅狭缝宽均为5 nm, 用280 nm激发glucagon的荧光光谱, glucagon(浓度为1.0×10-5 mol·L-1)荧光发射峰位置在347 nm左右附近, 每次10 µL化合物(1.0×10-4 mol·L-1)对glucagon滴定, 结果如图 9和图S5所示.从图上看, glucagon在347 nm的荧光发射峰强度随着化合物的逐渐滴加呈现出规律性地猝灭, 且最大峰位置无明显移动.从内插图可以看出, [CrCl3]和[CrPhf]对glucagon的荧光猝灭平衡时的化学计量比约为2:1, 说明Cr(Ⅲ)对glucagon有一定的结合作用, 形成了不发荧光的glucagon-配合物复合物后, glucagon荧光发生猝灭.

    图 9

    图 9.  化合物对胰高血糖素荧光光谱(内插图:在347 nm处荧光强度变化)
    Figure 9.  Fluorescence spectra of glucagon at different concentrations of complex (Insert: the changes of fluorescence at 347 nm)
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    各种大分子蛋白质、多肽等荧光体与荧光猝灭剂分子间的猝灭机理可由Stern-Volmer方程(1)和(2)进行阐述; 若化合物与glucagon结合形成不发荧光的基态复合物, 根据公式(3)可以得到化合物与glucagon复合物的结合常数, 公式推导见文献25, 26, 则有:

    $ \begin{array}{l} F_{0} / F=1+K_{\mathrm{q}} \tau_{0}[\mathrm{Q}]=1+K_{\mathrm{sv}}[\mathrm{Q}] \end{array} $

    		(1)

    $ K_{\mathrm{sv}}=K_{\mathrm{q}} \tau_{0} $

    		(2)

    $ {[\mathrm{~S}]_{\mathrm{t}} /[\mathrm{P}]_{\mathrm{b}}=F_{0} /\left([\mathrm{P}]_{\mathrm{t}} F\right) K+n} $

    		(3)

    式中, F0和F分别为不加和加入化合物猝灭剂时, glucagon的荧光强度; [Q]代表猝灭剂浓度; Ksv为Stern-Volmer动态猝灭常数, 通过F0/F对[Q]作图拟合得到; Kq为生物大分子的猝灭速率常数; τ0为生物大分子在没有添加猝灭剂时的荧光平均寿命; 利用图 9中化合物对glucagon荧光猝灭的变化数值, 分别作出glucagon的Stern-Volmer曲线(图 10(a, b)和图S6(a)), 并对实验数据线性拟合得到KSV, 接着根据公式(2)计算得到Kq, 结果见表 2; [S]t为化合物的总浓度, [P]t表示glucagon的总浓度, [P]b为结合有化合物的glucagon浓度, n为结合位点数, K为化合物与glucagon的结合常数, 以[S]t/[P]b对F0/([P]t F)作图, 见图 10(c, d)和图S6(b), 由图中直线的斜率倒数可得结合常数K, 结果见表 2.

    图 10

    图 10.  在37 ℃下化合物滴定胰高血糖素的Stern-Volmer曲线(a, b)和Scatchard图(c, d)
    Figure 10.  Stern-Volmer (a, b) and Scatchard (c, d) plots of fluorescence quenching of glucagon by compound at 37 ℃
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    已知荧光猝灭剂对生物大分子的最大猝灭值Kq为2.0×1010 L·mol-1·s-1, 从表 2的数据看, CrCl3, Cr(NH3)6和CrPhf两个化合物对glucagon的Kq都远大于2.0×1010 L·mol-1·s-1, 由此推断, 化合物对glucagon的作用主要是化合物中的Cr(Ⅲ)与glucagon结合而发生静态猝灭.

    表 2

    表 2  化合物与胰高血糖素在37 ℃时的猝灭常数和结合常数
    Table 2.  Quenching and binding constant K of compound with glucagon at 37 ℃
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    配合物 Ksv/(L·mol-1) Kq/(L·mol-1·s-1) K/(L·mol-1)
    [CrCl3] 7.09×105 7.09×1013 0.96×105
    [CrPhf] 10.28×105 10.28×1013 1.29×105
    [Cr(NH3)6] 8.83×105 8.83×1013 1.32×105

    表 2中配合物CrPhf和Cr(NH3)6与glucagon的结合常数大于105, 而无机盐CrCl3与glucagon小于1.0×105 L·mol-1, 表明配合物与glucagon有较强结合能力, 可能是由于配合物在转化吸收的过程中形成了中间体Cr(NH3)6, 更易与glucagon相结合作用.

    2.9   配合物降糖机理

    经过以上的综合分析, 拟推断苯乙双胍铬的生物降糖机制还有可能如图式 1所示的作用机理.苯乙双胍铬从进入胃部到小肠的过程中, 逐渐发生解离, 中间形成了六氨合铬(Ⅲ)离子Cr(NH3)6, 然后可以与过剩的胰高血糖素进行结合作用形成了胰高血糖素与铬的复合物, 从而有效降低血糖含量达到缓解Ⅱ型糖尿病症的目的.同时, 苯乙双胍本身就具有降糖的活性, 那么二者的结合应该可以达到协同生物学效应.

    图式 1

    图式 1.  苯乙双胍铬在体内可能的作用机理
    Scheme 1.  The proposed mechanism of CrPhf in vivo
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    3.   结论

    以具有抗糖尿病功效的药物苯乙双胍为配体, 制备了苯乙双胍铬(Ⅲ)配合物, 对其结构进行了表征, 并研究了配合物的稳定性、与H2O2的反应性和形貌.构建了糖尿病C57小鼠模型, 研究了其生物活性和毒性.在此基础上, 通过光谱法研究了配合物与胰高血糖素的结合作用, 得到结合常数值为1.29×105 L·mol-1, 结合位点约为1.推断配合物与胰高血糖素按1:1结合形成复合物, 从而抑制了过剩glucagon的表达, 达到降糖的目的.说明配合物在Ⅱ型糖尿病的预防和治疗产生了有益的效果, 对机体组织也是无毒的.配合物的设计不但保留了苯乙双胍的降糖活性, 而且也丰富了金属配合物的多功能化应用, 进而为新型双胍类药物的研发开辟了新思路.同时, 配合物CrPhf的研发也有可能为糖尿病的辅助治疗提供一个新方向.

    4.   实验部分

    4.1   苯乙双胍铬(Ⅲ)配合物的合成

    称取18.614 g (≈90 mmol)苯乙双胍(Phf)于圆底烧瓶, 加入0.410 g (≈100 mmol) NaOH, 再加入150 mL CH3OH, 室温下快速搅拌、滤掉固体NaCl; 然后在慢速搅拌下将8.014 g (≈30 mmol) CrCl3·6H2O的水溶液慢慢滴入到Phf的滤液中, 在室温下继续搅拌1 h, 逐渐得到大量红色固体, 停止搅拌, 静置2 h, 过滤, 用少量乙醇、乙醚洗涤后, 自然晾干得到红色粉末固体, 产率约49.2% (以Cr量计算).

    4.2   T2DM小鼠动物模型的建立、实验分组及生化指标的测试

    在山西医科大学动物中心购置20~30 g健康C57小鼠60多只, 其中50多只用高脂高糖饲料喂养四周, 然后向每只小鼠的尾静脉注射链脲霉素(STZ, 50 mg· kg-1体重), 继续用高糖高脂饲料再喂养四周, 通过尾部采血检测每只小鼠的空腹血糖(FBG), 所有小鼠FBG水平大于11.1 mmol·L-1, 建模成功.

    将50只糖尿病鼠随机分为4组, 与12只正常小鼠单笼饲养, 标准屏蔽环境, 相对湿度55%, 昼夜交替.在实验期间所有的小鼠可以自由喝水及进食, 干预组小鼠每日早上以口服方式按1.0 mg Cr/kg(小鼠体重)剂量灌胃给药, 对照组及模型组每日空腹灌胃生理盐水1.5 mL.小鼠实验为期12周, 每四周全自动生化仪检测每只小鼠的空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL), 同时记录小鼠的体重(BW)变化.实验经伦理委员会批准, 实验过程中严格人道对待动物.

    4.3   实验动物组织病理学检查

    经过药物干预实验后, 每组实验动物各取两只12 h禁食禁饮后被CO2窒息法处死, 接着小鼠的肝、肾和胰腺被迅速摘除, 用生理盐水清洗, 全自动脱水机脱水后

    烘干, 切5 μm片并HE染色后蜡封, 待用.按照临床实验方法, 在显微镜下观察切片组织器官结构、损伤、病变和感染的情况.


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  • 图 1  研究思路框图

    Figure 1  Conceptual framework

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    图 2  (a) 苯乙双胍和配合物的吸收光谱, (b)配合物结构

    Figure 2  (a) Absorption spectra of Phf and CrPhf, (b) structure of CrPhf. [Phf]=2.0×10-5 mol·L-1, [CrPhf]=4.0×10-5 mol·L-1, [CrPhf(dd)]=2.0×10-3 mol·L-1

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    图 3  配合物在不同条件下的吸收光谱

    Figure 3  Absorption spectra of complex under different conditions

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    图 4  配合物的热重分析

    Figure 4  Thermogravimetric analysis of complex

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    图 5  配合物在不同介质中加和不加H2O2氧化后的吸收光谱

    Figure 5  Absorption spectra of complex oxidized by H2O2 (with and wihout) in different media

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    图 6  配合物的扫描电镜(a), 配体和配合物X粉末衍射图谱(b, c)

    Figure 6  SEM photo of complex (a), XRD patterns of ligand and complex (b, c)

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    图 7  CrCl3、Met和配合物干预后的胰腺、肝和肾脏部分病理组织图像

    Figure 7  Histopathological images of pancreas, kidney and liver sections treated CrCl3, Met and complex

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    图 8  配合物对细胞的毒性作用.通过MTT试验, 苯乙双胍Phf (10 μmol·L-1)和配合物CrPhf (1, 10, 100 μmol·L-1)对MCF-7癌细胞(2.5×104 cells/mL)作用的细胞毒性评价, 体积比为1% DMSO作为对照(P＜0.05), 结果是通过6次平行实验的±标准偏差.

    Figure 8  Cytotoxic effect of complex on cell lines. The cytotoxicity of Phf (10 μmol·L-1) and complex (1, 10, 100 μmol·L-1) were evaluated on MCF-7 cell lines (2.5×104 cells/mL) by the MTT assay for 24 h. 1% DMSO (V/V) was used as a control experiment (P < 0.05). Results are mean±SD of six independent experiments.

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    图 9  化合物对胰高血糖素荧光光谱(内插图:在347 nm处荧光强度变化)

    Figure 9  Fluorescence spectra of glucagon at different concentrations of complex (Insert: the changes of fluorescence at 347 nm)

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    图 10  在37 ℃下化合物滴定胰高血糖素的Stern-Volmer曲线(a, b)和Scatchard图(c, d)

    Figure 10  Stern-Volmer (a, b) and Scatchard (c, d) plots of fluorescence quenching of glucagon by compound at 37 ℃

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    图式 1  苯乙双胍铬在体内可能的作用机理

    Scheme 1  The proposed mechanism of CrPhf in vivo

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    表 1  各组小鼠生化及代谢指标结果

    Table 1.  Results of biochemical and metabolic indexes of rats in each group

    Week Normal Diabetic CrCl3-treated Met-treated 1-treated
    BM/g 0 19.24±1.16 23.62±2.05 24.14±2.14 21.59±2.93 22.92±1.86
    4 22.45±1.55 30.5±2.40 29.42±1.62 28.64±0.82 29.28±1.86
    8
    12    		 29.35±1.48
    32.26±1.28    		 40.82±2.18
    48.26±3.00    		 37.89±3.01
    44.94±3.01    		 37.28±2.63
    43.08±3.11    		 39.17±1.77
    44.64±1.73
    FBG/ (mmol·L-1) 0 6.07±0.32* 11.59±0.39# 11.18±0.61# 13.47±0.57# 12.45±0.62#
    4 5.54±0.23* 11.50±0.52# 9.92±0.28#* 9.95±0.52# 9.83±0.40#
    8
    12    		 5.60±0.20*
    5.64±0.21*    		 11.37±0.35#
    11.70±0.58#    		 8.84±0.30#*
    8.76±0.35#*    		 8.62±0.38#
    7.72±0.34#    		 8.96±0.51#
    7.88±0.34#
    FINS/ (pmol·L-1) 0 12.36±1.50* 19.13±1.21# 19.80±0.54# 18.78±1.60# 19.97±0.67#
    4 11.49±0.52* 21.71±0.52# 17.23±0.91#* 19.64±0.58#* 18.22±0.65#
    8
    12    		 11.25±0.34*
    11.55±0.38*    		 21.11±0.66#
    19.89±0.46#    		 17.22±0.86#*
    15.99±0.76#*    		 18.40±0.58#*
    14.87±0.72#*    		 17.20±0.54#
    15.28±0.59#
    TC/ (mmol·L-1) 0 1.92±0.15* 4.66±0.64# 4.28±0.32# 4.41±0.74# 4.45±0.34#
    4 1.74±0.12* 4.17±0.32# 3.77±0.19# 3.90±0.26# 3.34±0.20#
    8
    12    		 1.92±0.093*
    1.95±0.083*    		 4.68±0.23
    4.14±0.24#    		 3.50±0.24#*
    3.66±0.28#    		 3.68±0.20#
    3.51±0.20#    		 3.08±0.19#
    2.88±0.22#
    TG/ (mmol·L-1) 0 0.55±0.050 1.63±0.22 2.02±0.19 1.77±0.22 1.79±0.12
    4 0.50±0.043* 1.92±0.21# 1.87±0.20* 1.70±0.22# 1.49±0.11#
    8
    12    		 0.52±0.026*
    0.53±0.029*    		 2.04±0.21#
    2.41±0.23#    		 1.63±0.14*
    1.69±0.24*    		 1.72±0.11#
    1.67±0.15*    		 1.29±0.12#
    1.21±0.13#
    HDL/ (mmol·L-1) 0 1.31±0.09* 0.90±0.099# 0.87±0.062# 0.82±0.070# 0.91±0.07#
    4 1.24±0.092* 0.80±0.064# 0.98±0.059# 0.86±0.081# 0.96±0.053#
    8
    12    		 1.19±0.086*
    1.21±0.081*    		 0.75±0.040#
    0.79±0.033#    		 0.86±0.049#
    0.90±0.050#    		 0.86±0.080#
    0.84±0.080#    		 0.89±0.056#
    0.94±0.052#
    LDL/ (mmol·L-1) 0 0.75±0.064 0.87±0.050 0.85±0.095 0.80±0.061 1.02±0.06
    4 0.68±0.027* 0.99±0.064# 0.76±0.052* 0.81±0.050# 0.83±0.053#
    8
    12    		 0.70±0.024*
    0.71±0.028*    		 1.09±0.062#
    0.99±0.054#    		 0.81±0.066*
    0.84±0.040#    		 0.81±0.050#
    0.8±0.036#    		 0.81±0.05#
    0.80±0.034#
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    表 2  化合物与胰高血糖素在37 ℃时的猝灭常数和结合常数

    Table 2.  Quenching and binding constant K of compound with glucagon at 37 ℃

    配合物 Ksv/(L·mol-1) Kq/(L·mol-1·s-1) K/(L·mol-1)
    [CrCl3] 7.09×105 7.09×1013 0.96×105
    [CrPhf] 10.28×105 10.28×1013 1.29×105
    [Cr(NH3)6] 8.83×105 8.83×1013 1.32×105
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  • 发布日期:  2020-11-15
  • 收稿日期:  2020-07-02
  • 网络出版日期:  2020-09-03
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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