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一氧化氮响应性高分子荧光探针的构筑及其细胞内成像应用
English
Construction of Nitric Oxide (NO)-Responsive Fluorescent Polymer and Its Application in Cell Imaging
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Key words:
- nitric oxide
- / responsive
- / fluorescent probe
- / imaging
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1. 引言
信号分子在包括免疫、神经和血管系统在内的人类系统中起着重要的作用[1-3].其中一氧化氮(NO)因其与阿尔茨海默病、癌症和高雪氏病等多种疾病的关系而受到越来越多的关注[4-6]. NO作为第一个被发现的信使分子, 在肌肉松弛、免疫系统控制、记忆、血压调节和学习等方面发挥着重要作用[7-10].在活细胞中, NO是在诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的催化下, 由L-精氨酸转化为L-瓜氨酸的过程中产生的.然而, 它极不稳定, 仅在低浓度下存在, 且在不同浓度范围会显示出不同的药理学活性, 如较低浓度时对环磷酸鸟苷(cGMP)通路影响而产生舒张血管的作用, 当浓度升高会产生受损机体组织的修复功能, 若继续增加浓度则会产生细胞凋亡行为[11].因此, NO的检测和监测对微生物的控制和机体的健康具有重要意义[12, 13].为了更好地了解和预防相关疾病, 活细胞中NO的检测和监测是非常必要的.
对NO的检测已有一些方法.其中最常用的方案是基于邻二氨基芳烃和NO之间的反应生成三氮唑基团, 这导致荧光团的电子分布变化而产生荧光发射信号的改变[14].利用这一机理, 香豆素在无NO会有光致电子转移而产生荧光淬灭, 有NO时则产生荧光恢复, 用一锅法实现了对缺氧和NO双重分析物的检测[15].为了提高穿透能力, 设计了双光子荧光探针, 可以同时吸收两个近红外光子, 减少部分背景荧光[16]. NO还可作为金属中心配合物多元氧化态变化的还原剂, 利用过渡金属配合物构建了不同的NO传感器[17-21].
研究学者们虽然取得了良好的效果, 但在研究过程中仍存在一些问题.如在实验过程中, 酸性条件和细胞内物质会干扰有机染料的荧光信号, 溶酶体中的水解酶也限制了其稳定性[22].有机小分子探针的溶解性也阻碍了其在水相中的广泛应用, 且合成难度大, 选择性有限.因此, 迫切需要新型的针对NO的检测探针.
Kim等[23]合成了带正电荷的N-(2-氨基苯基)-8-巯基八酰胺(NAM)修饰的金纳米粒子(AuNPs). NO的引入诱导了苯并三唑的形成并导致8-NAM-AuNP和带有负电荷的苯并三唑水解产物的产生. NO诱导的电荷反转作用有助于巨噬细胞吞噬组装体, 因此, 进一步的光热治疗也是可行的.我们课题组[24]开发的聚N-(4-氨基苯基)甲基丙烯酰胺(p-NAPMA)聚合物利用其中含有的苯基重氮基团具有紫外光敏感性, 在紫外光辐照下可生成邻苯二胺衍生物, 实现了NO和紫外光(UV)的双重响应.杨志谋课题组[25]以邻苯二氨基为封端基团, 构建了一个不引入诱导水凝胶转化的四肽超分子水凝胶体系. Nishikawa等[26]设计了一种基于N-烷氧基丙烯酸邻苯二胺的蛋白质标记的NO传感支架.
这些基于高分子聚合物可控设计的理念进行NO响应性聚合物的开发与利用是比较有成效的, 然而鉴于NO在体内的重要性, 对可以进行体内原位检测和监测的NO响应性聚合物的构筑是很有必要的.通过侧链修饰及共聚合的方式将具有NO响应性的基元修饰在大分子上, 利用大分子在溶液中的组装特性产生具有响应性的胶束结构.这种胶束组装的纳米颗粒可在水溶液中分散实现水溶液体系的NO监测同时纳米颗粒的产生又可有效避免外排作用的发生提高检测效率.
在本工作中我们采用可逆加成断裂链转移自由基聚合方法(RAFT)合成了具有良好pH和NO双响应性的双亲水性嵌段共聚物POEGMA-b-P(APUEMA-co- NBD), 其中OEGMA、APUEMA和NBD分别为寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、基于邻苯二胺的NO反应性单体和7-硝基苯呋咱衍生物.由于聚合物中含有的APUEMA单体单元存在一个自由胺基, 其能够通过光诱导电子转移(PET)过程使染料荧光淬灭, 而在NO存在情况下消除了此过程, 因此可以产生荧光打开的响应效果, 响应示意图和聚合物合成路线如图式 1和图式 2所示.
图式 1
图式 1. POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)在NO作用下响应示意图.Scheme 1. Illustration of POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD) responsiveness to NO.图式 2
2. 结果与讨论
2.1 单体响应性与聚合物结构表征
通过邻苯二胺与甲基丙烯酸异氰基乙酯的反应, 合成了一种含伯胺的APUEMA单体. 1H和13C NMR分析表明APUEMA单体被成功地制备出来(图 1a, 1b).也获得了不含邻苯二胺基的2-(3-苯基脲基)甲基丙烯酸乙酯(PUEMA)作为对照(图S1).为了研究APUEMA和PUEMA对NO的响应性, 在不同NO浓度下, 对单体水溶液进行了UV/Vis光谱监测, 发现APUEMA水溶液在258 nm和295 nm处出现两个吸收峰, 并随着NO浓度的提高紫外吸收峰的强度也逐渐增强(图 4a, 4b).然而, 加入NO后, PUEMA水溶液的吸收强度没有明显变化, 表明PUEMA对NO没有响应性(图 4c).据报道邻苯二胺基团在温和条件下可以与NO反应生成苯并三唑, 并具有较高的转化率.以柱层析法纯化APUEMA和NO的反应产物, 1H和13C NMR结果显示产物具有脲基官能化的苯并三唑残留(图 2a, 2b).然后, 通过RAFT聚合, 合成了一种性能良好的双亲水嵌段共聚物POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD).根据1H NMR谱图, POEGMA和PAPUEMA的聚合度(DPs)均为13(图 3).从GPC的结果可以看到POEGMA-b-P(APUEMA-co- NBD)嵌段共聚物具有单分散性, 分子量(Mn)为11.7 kDa, 多分散性(Mw/Mn)为1.28(图S2). GPC结果表明, POEGMA-b-P(PUEMA-co-NBD)嵌段共聚物可以通过可控聚合获得, 其Mn和Mw/Mn分别为22.8 kDa和1.10(图S3).
图 1
图 2
图 3
图 4
2.2 聚合物的pH性能表征
采用电位滴定法、动态光散射法和荧光光谱法研究了嵌段共聚物POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)的pH响应特性.测定了APUEMA单体和POEGMA-b- P(APUEMA-co-NBD)嵌段聚合物的pKa值分别为3.36和2.15, 表明POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)的PAPUEMA部分在酸性介质中具有亲水性, 在中性介质中具有疏水性(图S4). POEGMA-b-P(APUEMA-co- NBD)嵌段共聚物的水溶液在pH 2.0时直径较小, 约为5.0 nm, 说明嵌段共聚物能以单链状态溶解于水中.将溶液pH值改为7后, 动态光散射记录的流体力学直径增加到约10 nm(图 5a). TEM结果显示, 在pH 7.4时, POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)嵌段共聚物水溶液的胶束呈球形结构(图 5b).胶束的形成是由于PAPUEMA部分的去质子使其由亲水性向疏水性的转变引起的自组装.此外, 当pH值从2增加到7时, 嵌段共聚物溶液的荧光强度迅速降低, 这归因于通过光诱导电子转移(PET)机制, 去质子的PAPUEMA部分作为PNBD的荧光猝灭剂而产生荧光淬灭效应(图 5c, 5d).
图 5
图 5. (a) POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)水溶液在不同pH下的动态光散射图, (b) POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)水溶液在pH7.4条件下的透射电子显微镜图, (c) POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)水溶液(1.0 g/L)随pH变化的荧光光谱图, (d) POEGMA-b-P(APUEMA- co-NBD)水溶液的归一化荧光强度随pH的变化曲线, 插图为POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)水溶液在pH 2.0和pH 7.0条件下的宏观照片.Figure 5. (a) Typical DLS profile of POEGMA-b-P(APUEMA- co-NBD) aqueous solution at different pH values, (b) transition electron microscopy (TEM) image of the POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD) aqueous solution at pH 7.4, (c) normalized pH-dependent fluorescence spectra and (d) fluorescence intensity changes of POEGMA-b- P(APUEMA-co-NBD) aqueous solution. The inset macroscopic image in (d) shows the aqueous solution of POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD) at pH 2.0 or pH 7.0.2.3 聚合物的NO响应性能表征
用DLS和荧光光谱法检测了嵌段共聚物POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)的NO响应性.在pH 2.0时, NO充入24 h后, 嵌段共聚物水溶液的直径从5 nm增加到约150 nm(图 6a). PAPUEMA与NO反应后生成的疏水性脲基官能化苯并三唑部分, 可能导致两亲性嵌段共聚物的自组装和胶束的膨胀, 从而产生大尺寸的聚集体.在pH 7.0时, 暴露于NO 24 h后, 嵌段共聚物胶束的直径从10 nm增加到约100 nm(图 6b).结果表明, 与PAPUEMA相比, 脲官能化的苯并三唑部分具有更高的疏水性, 加入NO后胶束的溶胀度增大. POEGMA-b- P(APUEMA-co-NBD)嵌段共聚物水溶液在pH 2.0或pH 7.0时的透光率随着NO的加入降低符合DLS结果(图S5).此外, 在pH值为2.0的嵌段共聚物溶液中, 加入NO后0.5 h荧光强度迅速提高, 说明NO引发的胶束自组装降低了环境极性.然后, 随着进一步NO的添加, 荧光强度降低(图 7a, 7b).在pH 7.0条件下, 加入NO后, 嵌段共聚物胶束的荧光强度增加了15倍, 这主要归因于PAPUEMA和PNBD之间的PET效应减弱(图 7c, 7d).结果表明, pH值的变化或NO的加入均可引发嵌段共聚物POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)的自组装和形态转变.
图 6
图 7
图 7. POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)水溶液与NO反应后在pH 2.0 (a, b)和pH 7.0 (c, d)条件下随时间的荧光光谱图(a, c)和随时间的荧光强度变化图(b, d)Figure 7. Normalized time-dependent fluorescence spectra (a, c) and fluorescence intensity (b, d) of POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD) aqueous solution at pH 2.0 (a, b) and pH 7.0 (c, d) after reaction with NO.2.4 聚合物的细胞内表征
在正常MRC-5细胞中进行了嵌段共聚物POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)和POEGMA-b- P(PUEMA-co-NBD)的体外研究.即使在100 μg/mL的嵌段共聚物浓度下, 两种嵌段共聚物也只是显示出可忽略的细胞毒性(图S6).由共聚焦显微镜图片可以看到, 单纯的聚合物POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)在细胞中无明显荧光, 当NO存在时会有很明显的荧光出现, 展现turn-on检测效果且对NO具有实时检测性.在对比聚合物POEGMA-b-P(PUEMA-co-NBD)中即使没有NO也有强烈的荧光, 说明了没有邻苯二氨基的自由氨基的存在, PET效应无法实现, 因此荧光正常显现, 如图 8所示.
图 8
图 8. MCF-7细胞与纳米粒子孵育后的共聚焦显微镜图. (a) POEGMA- b-P(APUEMA-co-NBD)纳米粒子, (b) NO预处理和POEGMA-b- P(APUEMA-co-NBD)纳米粒子, (c) POEGMA-b-P(PUEMA-co-NBD)纳米粒子.Figure 8. Confocal laser scanning microscopy images of MCF-7 cells after incubation with nanoparticles. (a) POEGMA-b-P(APUEMA- co-NBD) nanoparticles, (b) POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD) nanoparticles with NO pretreatment, (c) POEGMA-b-P(PUEMA-co-NBD) nanoparticles.3. 结论
综上所述, 我们合成了具有pH和NO响应特性的双亲水嵌段共聚物POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD).嵌段共聚物POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)溶液的自组装和形态转变可以通过提高pH值或加入NO来实现, 由于NO的加入可以调节组装体的荧光强度, 因此嵌段共聚物POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)可以作为检测细胞内NO的传感器进行使用.
4. 实验部分
4.1 试剂与仪器
邻苯二胺、盐酸(2 mol/L HCl的乙醚溶液)、甲基丙烯酸异氰基乙酯、4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CPPA)和2, 2'-偶氮二异丁腈(AIBN)均购于Aldrich.聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(数均聚合度300)在使用前先用阻聚剂移除柱纯化并在-20 ℃下储存.亚硝酸钠(NaNO2)和盐酸溶液(37%)均购买于Ajax Finechem并直接使用.根据文献报道的方法合成了4-(2-甲基丙烯酰氧乙基氨基)-7-硝基-2, 1, 3-苯并噁二唑(NBD).将2.0 mol/L HCl水溶液缓慢滴入含有饱和NaNO2溶液的玻璃瓶中, 可产生NO.制备饱和NO溶液(1.8 mmol/L, 20 ℃), 并使用文献的方法测定最终浓度.
4.2 实验合成过程
制备POEGMA大分子链转移剂和POEGMA-b- P(APUEMA-co-NBD)双亲水嵌段共聚物所采用的合成方案如图式 2所示.
4.2.1 APUEMA单体的合成
根据我们报道的方法合成了去质子化的APUEMA单体.邻苯二胺(2.7 g, 25 mmol)溶解于20 mL无水乙腈中.将甲基丙烯酸异氰基乙酯(3.88 g, 25 mmol)溶解于20 mL无水乙腈中并逐滴添加.将混合物在室温下进一步搅拌过夜.之后, 在真空下去除乙腈, 残余物用过量的乙醚沉淀.采用柱层析法分离纯化不溶性固体.得到的去质子化APUEMA单体为白色固体(4.9 g, 18.6 mmol). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.20~6.98 (m, 2H), 6.83~6.68 (m, 3H), 6.06 (s, 1H), 5.56 (s, 1H), 5.20 (t, 1H, J=6.0 Hz), 4.21 (t, J=5.5 Hz, 2H), 3.99 (s, 2H), 3.50 (q, J=5.7 Hz, 2H), 1.90 (s, 3H). 13C NMR (CDCl3) δ: 167.30, 157.44, 142.42, 136.02, 127.59, 127.39, 125.94, 123.31, 118.98, 116.68, 63.68, 39.20, 18.26.
4.2.2 中性pH下用NO处理APUEMA单体
APUEMA单体(78 mg, 0.3 mmol)溶解于去离子水/乙腈(20 mL, V/V=1:1)中.通入NO气体1 h, 然后在真空下去除乙腈.将水溶液冷冻干燥, 以二氯甲烷为洗脱剂, 采用柱层析法纯化最终产物, 产物为白色固体(78 mg, 收率约85%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.20 (d, J=8.3 Hz, 1H), 8.04 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.64~7.51 (m, 1H), 7.41 (dd, J=8.4, 6.0 Hz, 1H), 6.09 (s, 1H), 5.55 (s, 1H), 4.36 (dd, J=5.8, 4.9 Hz, 3H), 3.82 (dd, J=4.8, 5.9 Hz, 2H), 1.89 (s, 2H). 13C NMR (CDCl3): 167.22, 149.38, 146.26, 135.78, 131.62, 130.03, 126.39, 125.50, 120.05, 113.87, 63.07, 39.65, 18.29.
4.2.3 RAFT聚合法合成POEGMA大分子链转移剂
将OEGMA (6.0 g, 20 mmol)、CPPA (280 mg, 1 mmol)、AIBN (16.4 mg, 0.1 mmol)和甲苯(12 mL)装入聚合小瓶用磁子搅拌.将混合物脱气30 min, 然后置于70 ℃的油浴中开始聚合. 6 h后, 聚合反应在冰水浴中淬灭并用过量的乙醚沉淀.二氯甲烷中溶解后, 进行溶解-沉淀循环重复三次. POEGMA大分子RAFT试剂在离心5000 r/min, 5 min的条件下分离, 并在真空烘箱中在室温下干燥过夜.获得红色粘稠液体, 通过核磁共振氢谱测定聚合度为13.
4.2.4 用POEGMA大分子链转移剂合成POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)双亲水性嵌段共聚物
采用RAFT法合成POEGMA-b-P(APUEMA-co- NBD)双亲水性嵌段共聚物.将POEGMA大分子RAFT试剂(0.41 g, 0.1 mmol)、APUEMA (0.526 g, 2 mmol)、NBD (5.8 mg, 0.02 mmol)、AIBN (2 mg, 12 μmol)和DMF (4.0 mL)装入带有磁子的聚合瓶中.将混合物脱气30 min, 然后置于70 ℃的油浴中开始聚合. 16 h后, 聚合反应在冰水浴中淬灭, 并通过丙酮透析纯化.新鲜丙酮每4 h更换一次. 24 h后, 利用过量的乙醚再对嵌段共聚物进行沉淀.得到的POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)二嵌段共聚物为黄色固体.
4.3 POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)双亲水性嵌段共聚物的自组装
以二嵌段共聚物为原料, 通过pH调节或共溶剂法制备了自组装胶束.溶液pH调整法:聚合物(10 mg)溶于10 mL去离子水中, pH值调整为2.0.用去离子水(pH 6.8)对酸性溶液进行彻底透析, 直至溶液pH值约为6.5.将所得溶液稀释至所需浓度以供进一步研究.
共溶剂法:将聚合物(5 mg)溶解在1 mL DMF和去离子水(1 mL)中, 并在1 h内通过注射器泵缓慢添加去离子水(1.0 mL).将混合物进一步搅拌1 h, 并加入8.0 mL去离子水.将聚合物溶液用去离子水透析24 h (MWCO 3.5 kDa), 每隔6 h更换一次新鲜去离子水.最后, 将胶体分散液稀释至所需浓度以供进一步实验.
4.4 聚合物表征
4.4.1 核磁共振(NMR)谱
所有的核磁共振氢谱和碳谱都从Bruker-AC300F(300 MHz)谱仪上记录.以氘代氯仿(CDCl3)、氘代DMSO和氘代丙酮为溶剂.
4.4.2 体积排除色谱法(SEC)
使用溴化锂(0.03%, w/V)及2, 6-二丁基-4-甲基苯酚(BHT)(0.05%, w/V)处理过的N, N-二甲基乙酰胺(DMAC)作为溶剂进行测试.使用岛津模块化系统对聚合物样品进行SEC分析, 该系统包括DGU-12A脱气器、SIL-10AD自动注射器、5.0 μm粒径保护柱(50 mm×7.8 mm)、4个300 mm×7.8 mm线性酚醛树脂凝胶柱(微球尺寸: 5.0 μm; 孔径: 105、104、103和500 Å )和RID-10A差分折射率检测器.使用CTO-10A烘箱将色谱柱温度保持在50 ℃, 使用LC-10AT泵将流速保持在1 mL/min.使用分子量范围为500至106 g/mol的商用窄分子量分布聚苯乙烯标准品绘制分子量校准曲线.在洗脱液中制备2~3 mg/mL的聚合物溶液, 并在注入前通过0.45 μm过滤膜过滤.
4.4.3 动态光散射(DLS)
DLS的测量是使用运行DTS软件的Malvern Zetasizer纳米系列, 使用波长为633 nm的4 mW He-Ne激光器和雪崩光电二极管(APD)探测器进行的.散射光检测角度为173°.温度稳定在设定温度的±0.1 ℃.在测量之前, 通过0.45 μm孔径过滤膜过滤聚合物样品的水溶液以去除灰尘.为了评估尺寸分布, 用累积量法拟合自相关函数.
4.4.4 透射电子显微镜(TEM)
在200 kV加速电压下, 用透射电子显微镜观察了星形聚合物的尺寸和形貌.聚合物聚集体沉积在300目多孔膜铜栅(Pro Sci Tech)上.
4.4.5 荧光测量
荧光发射光谱在Perkin-Elmer荧光光谱仪上以“En Spire”模式固定于470 nm激发波长进行测定.
4.4.6 紫外可见吸收测量
紫外-可见光谱在Varian Cary 300紫外-可见分光光度计上进行测试, 使用光程为10 mm的石英比色皿作为容器.
4.4.7 浊度测量
采用岛津紫外2600分光光度计, 在波长为700 nm、光程10 mm的石英比色皿中测定了POEGMA-b- P(APUEMA-co-NBD)水溶液在NO处理前后的透光率.所有测量的聚合物浓度为1.0 g/L.
5. 体内实验
用0, 100和500 μmol/L的二醇二氮烯鎓盐(NONOate)处理MCF-7细胞2 h后, 将基质移除, 用含有1 μg/mL的RNO-的新鲜基质润洗细胞并孵育30 min后移除并拍照.对MCF-5细胞, 用0和500 μmol/L的NONOate处理2 h后, 将基质移除, 用含有1 μg/mL的RNO-的新鲜基质润洗细胞并孵育30 min后移除并拍照.每批次处理均拍照至少10张并用Image J软件进行荧光强度表征.
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图 5 (a) POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)水溶液在不同pH下的动态光散射图, (b) POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)水溶液在pH7.4条件下的透射电子显微镜图, (c) POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)水溶液(1.0 g/L)随pH变化的荧光光谱图, (d) POEGMA-b-P(APUEMA- co-NBD)水溶液的归一化荧光强度随pH的变化曲线, 插图为POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)水溶液在pH 2.0和pH 7.0条件下的宏观照片.
Figure 5 (a) Typical DLS profile of POEGMA-b-P(APUEMA- co-NBD) aqueous solution at different pH values, (b) transition electron microscopy (TEM) image of the POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD) aqueous solution at pH 7.4, (c) normalized pH-dependent fluorescence spectra and (d) fluorescence intensity changes of POEGMA-b- P(APUEMA-co-NBD) aqueous solution. The inset macroscopic image in (d) shows the aqueous solution of POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD) at pH 2.0 or pH 7.0.
图 7 POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD)水溶液与NO反应后在pH 2.0 (a, b)和pH 7.0 (c, d)条件下随时间的荧光光谱图(a, c)和随时间的荧光强度变化图(b, d)
Figure 7 Normalized time-dependent fluorescence spectra (a, c) and fluorescence intensity (b, d) of POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD) aqueous solution at pH 2.0 (a, b) and pH 7.0 (c, d) after reaction with NO.
图 8 MCF-7细胞与纳米粒子孵育后的共聚焦显微镜图. (a) POEGMA- b-P(APUEMA-co-NBD)纳米粒子, (b) NO预处理和POEGMA-b- P(APUEMA-co-NBD)纳米粒子, (c) POEGMA-b-P(PUEMA-co-NBD)纳米粒子.
Figure 8 Confocal laser scanning microscopy images of MCF-7 cells after incubation with nanoparticles. (a) POEGMA-b-P(APUEMA- co-NBD) nanoparticles, (b) POEGMA-b-P(APUEMA-co-NBD) nanoparticles with NO pretreatment, (c) POEGMA-b-P(PUEMA-co-NBD) nanoparticles.
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