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• 1.   引言

  肿瘤是一类具有高风险和高死亡率特点的疾病, 对人类健康构成了严重威胁.在我国, 恶性肿瘤已经成为严重威胁居民健康的最主要公共卫生问题之一, 根据最新的统计数据显示, 恶性肿瘤造成的死亡率占居民死因的23.91%.近十年来恶性肿瘤的发病死亡整体呈持续上升态势, 每年由于恶性肿瘤所致医疗花费超过2200亿元.大量研究和预防数据证实, 早期诊断和早期治疗是预防肿瘤和降低肿瘤死亡率的最有效方法.寻找可以进行早期诊断的肿瘤标志物(Tumor marker, TM)并发展其高效检测方法成为人们近期关注的焦点.血清、组织或体液中肿瘤标志物的检测, 对于在临床上发现原发肿瘤、筛选肿瘤高危人群和鉴别诊断肿瘤的发展程度以及判断对肿瘤的治疗效果等都具有重大意义.此外, 肿瘤标志物还可用于肿瘤治疗后的评估预后以及对是否复发进行预判.

  肿瘤标志物是一类可以反映肿瘤存在的物质, 常指特征性存在于恶性肿瘤细胞或由其分泌产生的物质, 也有部分肿瘤标志物是由宿主对肿瘤的刺激反应而产生的.它们一般存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中.目前, 已有超过100种肿瘤标志物应用于癌症的早期检测, 按其性质可分为酶、激素、胚胎抗原、糖蛋白等一类特殊蛋白质.常用的检测方法有酶标记免疫分析技术、放射免疫分析法、免疫放射分析法、胶体金免疫层析法、化学发光免疫分析技术等.

  前列腺癌(Prostatic carcinoma, PCa)是男性泌尿生殖系统中最为常见的恶性肿瘤之一^[1], 它的发病率受地区及种族的影响.在美国, 男性癌症发病率排在第一的便是前列腺癌, 其病死率仅次于肺癌.在20世纪80年代12个欧洲国家被确诊为PCa的男性患者超过8万人.而在我国, PCa的发病率虽远低于欧美国家, 但近年来也呈现出显著的增长趋势^[2], 前列腺癌在男性癌症致死率中排在第八位, 占2.1%.因此, 前列腺癌已引起社会及每个男性的高度重视.

  临床上, 常见的PCa诊断方法包括直肠指检、前列腺特异性抗原数值的判定、经直肠前列腺超声检查、前列腺穿刺活检^[3]及人前列腺癌细胞(PC-3)^[4-6].随着分子生物学技术的不断发展, 肿瘤标志物检测在前列腺癌高危人群筛查、早期诊断及肿瘤发生发展等方面发挥着重要作用^[7].目前较为热门的PCa的肿瘤标志物包括前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、α-甲酰基辅酶A消旋酶(AMACR, P504S)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、钙磷脂结合蛋白3 (ANXA3)等.由于PCa检测的重要性, 前列腺肿瘤标志物的研究已成为热门课题^[8-10].相较于对临床常见诊断方式的综述, 本文侧重于对前列腺特异性抗原及前列腺酸性磷酸酶这两个热门标志物的常见分析检测技术、优势及其研究意义进行综述, 并展望对前列腺特异性抗原与前列腺酸性磷酸酶研究的前景.

  2.   前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen, PSA)

  前列腺特异性抗原是一种主要由正常或有癌变倾向的前列腺细胞产生的33~34 kDa糖蛋白.它是一种丝氨酸蛋白酶, 主要可在血清中检测到, 其半衰期为2~3 d, 为前列腺液和精液的组成成分之一, 可液化精液, 促使精子蠕动^[11]. PSA具有较好的检测阳性率, 且检测较为便捷, 已成为诊断前列腺癌最常见的血清标志物^{[12, 13]}.前列腺癌通常会导致高浓度的PSA释放到循环系统, 甚至导致血清PSA水平增加105倍^[14].因此, 血清PSA测定被广泛应用于前列腺癌患者的早期检测和监测.

  血清PSA值超过4.0 ng/mL通常被认为是阳性^[15].当PSA＞10 ng/mL时, 需要前列腺活组织穿刺检查^[16]; 当PSA为4~10 ng/mL时, 则需要根据PSA的其它衍生指标判断, 如fPSA(fPSA/tPSA)等^[17](fPSA为未结合蛋白的游离PSA, 占总PSA的20%~30%).但临床上PSA的结果判定较为复杂, 由于PSA的测定结果与患者的精神状态(如紧张、焦虑)、疾病(如前列腺炎、前列腺增生)、临床操作等相关^[18].同时, PSA存在判定灰区, 当PSA含量为4~10 ng/mL时, 前列腺活组织穿刺诊断PCa的阳性率仅为25%^[19].因此有些研究工作者通过PSA衍生出其它相关的检测指标, 其中较为常见的有fPSA、fPSA/tPSA^[20].

  短结合肽由于其具有可靠、低成本、耐恶劣环境等优势, 成为一种在生物分析中有前途的传统抗体的替代物. Denmeade等^[21]发现具有HSSKLQ氨基酸序列的特异性肽段可作为检测胞外液中PSA酶活性的底物.目前常见的PSA检测方法有荧光法^[22]、表面等离子体共振法^[23]、电化学法^{[24, 25]}及电化学发光法(又称电化学发光法和ECL法)^[26]等.

  2.1   荧光法

  临床生物标志物检测的金标准是酶联免疫吸附试验(ELISA).然而, 由于其敏感性适中, ELISA通常只在生物标志物水平已经达到临界阈值浓度时才进行检测, 此时疾病已经有了显著的进展.因此, 超灵敏检测是临床生物标志物检测的迫切需要.纳米技术已经在超灵敏生物传感器的设计中发挥着越来越重要的作用, 利用荧光法作为信号转导具有极高的灵敏度并使即时检测成为可能.

  荧光检测的原理是基于光激发某些化合物产生光发射, 通过测定荧光强度的变化达到定量检测的目的.荧光法具有灵敏度高、快速、连续和实时的优点.但由于检测方法的限制, 定量分析需要标样, 并易受其它元素干扰和叠加信号的影响.对于常规荧光免疫测定, 在大多数生物标志物含量极低的状态下会出现由于灵敏度不足而难以监测生物标志物的情况.为了改善低丰度生物标志物检测灵敏度的问题, 大多数荧光分析方法集中在创造新的三维表面以提高捕获抗体的密度, 从而实现信号放大的目的. 2013年, Liu等^[22]提出了一种新的可激活探针, 以提高荧光ELISA检测血清样本中PSA的灵敏度(图 1).该工作以罗丹明B异硫氰酸酯(RBITC)为模型荧光染料, 在每个金纳米粒子(AuNPs)上组装RBITC-AuNP偶联物.装载纳米偶联物的RBITC通过静电相互作用被检测抗体(Ab2)覆盖, 从而保持其对目标抗原的生物活性.当PSA存在时, 偶联物Ab2-RBITC-AuNPs作用于PSA, RBITC的荧光被AuNPs高度猝灭; 当检测系统中加入半胱胺后, 由于竞争作用RBITC从AuNPs表面除去, 使RBITC荧光显著恢复.恢复的荧光强度与血清样品中生物标志物的浓度成正比, 由此可在pg/mL水平检测患者血清中的PSA.这种可激活探针的检测限比传统的荧光免疫测定法低好几个数量级, 从而实现超灵敏检测.该探针的高灵敏度是基于RBITC-AuNPs的高“关-开”效率和AuNPs表面RBITC的负载率.该体系可在早期或根治性前列腺切除术后筛查PSA, 从而提供更好的检测结果.同时在96孔板上进行检测是目前临床实验室最流行的检测形式, 特别是在发展中国家易于适应当前的诊断平台, 更适用于实际的临床情况.

  图 1

  

  图 1.  96孔板上PSA的荧光激活免疫分析原理图^[22]

  Figure 1.  Representation of the fluorescence-activatable immunoassay for PSA performed in 96-well PS plates^[22]

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  此外, 超敏、高特异性适体荧光传感器的开发对前列腺癌的早期诊断也具有重要意义. 2020年, Wang等^[27]基于石墨化氮化碳(g-C₃N₄)量子点(g-CNQDs)与钯三角板(PdTPs)间的荧光共价能量转移开关模型, 实现了对前列腺特异抗原(PSA)传感器的超敏检测.该方案通过在水热条件下制备了PdTPs, 并将其与PSA适配体(PA)进行了顺序修饰, 同时通过PdTPs与g-CNQDs的吡啶N之间的配位键来猝灭g-CNQDs的荧光.在PSA存在的情况下通过削弱PA和g-CNQDs之间的连接, 使PdTPs从g-CNQDs中释放, 导致荧光恢复, 形成了“on-off-on”适体荧光传感器.该方法可用于血清中对PSA进行检测, 具有较宽的线性范围(10 pg/mL~50 ng/mL), 检测限低至4.2 pg/mL).

  2.2   电化学发光法

  ECL法是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应, 主要包括了电化学反应和化学发光这两个过程.常见的电化学发光技术有三联吡啶钌标记、链霉亲和素-生物素、磁性微粒子、电启动的化学发光反应. ECL因其灵敏度高、速度快、易于控制、动态范围广等优点, 在蛋白质检测中受到了广泛的关注. 2013年, Qi等^[28]提出了一种电致化学发光肽(ECL-PB)生物传感器, 用于测定PSA.特定肽段(CHSSKLQK)用作PSA识别分子, Ru(bpy)₃²⁺因其良好的电化学、光化学稳定性和较高的发光率而被用作ECL的发射源.二茂铁羧酸(Fc)作为ECL淬火剂, 降低了Ru(bpy)₃²⁺-TPA(三丙胺)体系的ECL强度. AuNPs由于其良好的电催化活性、较大比表面积、良好的导电性和稳定性被用作放大平台.如图 2所示, 将Nafion和AuNPs的混合物浇铸在玻碳电极表面形成AuNPs/Nafion膜后, 将Ru(bpy)₃²⁺静电吸附到AuNPs/Nafion膜上, 由此形成ECL-PB传感器, 之后以二茂铁羧酸为载体的肽段(Fc-peptide)自组装到AuNPs表面.当PSA存在时, 它会特异性地裂解Fc-peptide, 导致猝灭剂离开电极, 使含TPA磷酸盐缓冲液中的ECL强度增加, 从而在动态浓度范围5 pg/mL~5 ng/mL测量PSA, 检测限为0.8 pg/mL, 该方法具有良好的临床应用前景.

  图 2

  

  图 2.  ECL-PB生物传感器用于PSA测定的原理^[28]

  Figure 2.  Schematic diagram of ECL-PB biosensor for the determination of PSA^[28]

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  2.3   光电化学法

  光电化学(PEC)生物分析是一种很有前景的分析技术, 它是通过记录光电极与被分析物相互作用所引起的光电流响应来检测的方法^[29].由于激发信号与检测信号完全分离, PEC法具有较高的灵敏度和较低的背景.从本质上说, PEC反应描述了一个光电转换过程, 该过程涉及光诱导电子空穴对的分离和转移.在辐照作用下, 价带上的光活性基团的电子可以被激发到导带, 然后转移到电极上, 从而产生一个强大的光电流信号.然而, 电子和空穴自发的快速重组, 会减少光电流.此外光反应过程中电子和空穴的快速积累, 电场有被中和的趋势, 因此如何更新内部电场, 保持电子空穴对的持续分离也是一个巨大挑战.

  2019年, Yu等^[30]以CdTe/TiO₂敏化结构为电极, 以CuS纳米晶为信号放大器, 构建了一种肽基PEC传感器, 用于蛋白质的超灵敏检测.多肽修饰至CdTe/TiO₂电极表面后, 将双链DNA(dsDNA)固定在多肽末端作为载体固定阿霉素-巯基铜纳米晶体(Dox-CuS)缀合物.为验证该PEC传感器的可行性, 作者选择PSA作为检测模型, 在无PSA存在时, CuS纳米晶体可以消耗电子供体并激发光能, 且生物大分子的空间位阻效应阻碍了给电子体到光电极的运动, 减小了光电响应信号, 使PEC传感器处于“signal-off”状态.当PSA存在时, PSA特异性剪切多肽使DNA/Dox-CuS探针从电极表面释放, 产生“signal-on”状态. PEC传感器具有良好的特异性、稳定性和重复性, 在PSA分析中具有很好的应用价值, 其线性范围为0.005~20 ng/mL, 检出限为0.0015 ng/mL.该PEC传感器利用TiO₂-NTs与CdTe量子点之间的能级匹配大大提高了光电转换效率.通过表观空间位阻、激发光的竞争性吸收和电子供体的有效消耗, 显著降低光电流响应. dsDNA作为载体材料增加了Dox-CuS网络控制系统的负载, 达到信号放大的目的, 因此在生物分析、疾病诊断和临床生物医学等方面具有广阔的应用前景.

  2020年, Gao等^[31]首次采用水热法制备了基于纸张的二维WO₃纳米薄片, 实现了电子的快速转移. Cu₂O是一种窄禁带(2.2 eV) p型纳米材料, 具有优异的光电性能, 可以拓宽光吸收范围, 因此被用作较为理想的光电极材料.在可见光的照射下, WO₃和Cu₂O可以产生光致电子空穴对.当没有外力作用时, 由于电子和空穴的随机运动, 它们很容易以极高的速率自发重组.相反, 在BaTiO₃ (BTO)纳米层两侧极性电荷载体(PCC)电场诱导下的持续驱动力, 可以分别诱导WO₃和Cu₂O中电子和空穴的定向迁移, 实现相对较大的光电流响应.如图 3a所示, 在BTO的右侧, 极化的正电荷会吸引Cu₂O的电子, 而空穴则会被排斥.另一方面, WO₃的空穴可以被BTO相应的负电荷所抽离, 而电子则被排斥并沿着WO₃纳米薄片的“高速路”流向外部电路.因此, 如图 3b所示, 除了通过WO₃和Cu₂O的能级匹配来促进载流子的分离外, 引入PCC电场可以提供额外的有效驱动力来实现光电子空穴对的定向迁移.采用标准加入法对基于纸张的真实样品检测传感平台的可行性进行了评估.在加入癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、人类免疫球蛋白(HIgG)和人血清白蛋白(HSA)作为干扰因素的情况下, 只有PSA对该传感器能产生影响, 可引起明显的光电流信号下降, 具有极强特异性.

  图 3

  

  图 3.  (a) PCC电场对WO₃纳米薄片/BTO/Cu₂O光电极空穴对分离的促进作用示意图和(b) WO₃纳米薄片/BTO/Cu₂O光电极的DSCC策略^[31]

  Figure 3.  (a) Schematic diagram of the promoting effect of the PCC electric field on the separation of electron-hole pairs and (b) DSCC strategy of the WO₃ nanoflakes/BTO/Cu₂O photoelectrode^[31]

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  2.4   表面等离子体共振法

  表面等离子体共振(SPR)是生物分子相互作用检测中最常用的无标签光学技术之一, 一般是光在金属薄膜液体界面上全内反射时发生.传感器表面的局部折射率决定了共振角的大小, 由此可实现对生物分子的定量检测.因此SPR技术被认为是一种可替代传统ELISA的快速检测技术.然而, 为了获得临床相关结果, 用血清作为检测介质受限于传感器表面与血清蛋白之间的非特异性相互作用. 2012年, Uludag等^[32]利用一种可消除98%血清蛋白非特异性结合基质的消除缓冲液, 开发了一种新的免疫测定方法并将其应用于SPR传感器平台(图 4).在其检测方案中, 为了能够检测血清中与临床相关浓度的tPSA, AuNPs被用作增强和放大传感器信号. AuNPs是一种比其他纳米粒子更出色的SPR信号增强剂, 由于AuNPs具有良好的生物相容性, 高粒子密度等特点, 因此会引起更高的折射率变化.此外, 由于它们参与了表面等离子体共振, 引起高共振角偏移, 进一步增强了SPR生物传感器的信号.该工作首次建立了通过矩阵缓冲区和AuNPs在高血清浓度中高灵敏检测tPSA的SPR生物传感器, 在血清中对PSA的检测限为0.29 ng/mL.因其具有检测时间短、重复可用性高、实时检测等优点, 该法可用于临床上诊断前列腺癌并应用于前列腺癌治疗和预后的护理.

  图 4

  

  图 4.  利用PSA检测抗体修饰的金纳米颗粒进行夹心免疫分析^[32]

  Figure 4.  Schematic representation of the PSA sandwich assay using PSA detection antibody-modified Au nanoparticles^[32]

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  2.5   比色法

  比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础的定量检测手段.选择适当的显色试剂与待测组分反应, 形成有色化合物, 通过比较或测量有色化合物的颜色深度实现对待测物的定量.比色检测具有成本低、操作方便、仪器要求简单等优点, 相对于其它方法更受青睐.

  2018年Zhou等^[33]利用功能化的介孔硅纳米颗粒(MSNs)包裹pH指示分子(TP), 开发了一种基于比色法的无酶滴定板(图 5).由于二氧化硅纳米颗粒的孔被苯基三甲氧基硅烷功能化, 通过π-π共轭能紧密地包裹TP.为了检测PSA, 用聚乙烯亚胺(PEI)包覆含TP的单分散介孔硅, 有利于带负电荷的PSA二抗附着.当pH呈碱性时, PT即可从孔中出来.合成的双功能单分散介孔硅用于扩增检测板孔中预固定一抗捕获的PSA.该方法具有较宽的动态范围(0.5~8000 pg/mL), LOD可达0.36 pg/mL, 并具有较好的抗干扰能力, 能用于实际样品中检测PSA, 在滴度板中检测保证了高通量并避免了昂贵仪器的使用.此外, 本方法不使用酶, 降低了检测成本, 避免了传统ELISA方法中酶变性、酶活性随温度变化等带来的一系列问题.

  图 5

  

  图 5.  (A) TP@PEI/Ab2-MSNs的合成; (B) 96孔板上基于TP@PEI/ Ab2-MSNs扩增比色法检测PSA的无酶免疫吸附检测步骤^[33]

  Figure 5.  (A) Synthesis of TP@PEI/Ab2-MSNs and (B) steps of the enzyme-free immunosorbent assay of PSA using TP@PEI/Ab2-MSNs for amplified colorimetric detection in a 96-well plate^[33]

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  2.6   基于适配体的液晶传感器法

  液晶传感器可将化学和生物反应转化为具有极高灵敏度的可见光信号, 并将其放大.该传感器的优点是不需要烦琐的操作、分子标签或复杂的仪器, 这使得它们在开发便携式和便宜的现场诊断设备时极具吸引力.目前已有很多报道实现了基于适配体识别的肿瘤标志物检测^{[34, 35]}. 2019年, Qi等^[36]开发了一种基于功能液晶(LC)传感器辅助适配体的目标诱导解离策略(TID)用于同时检测血液中多种肿瘤标志物.该工作将单链DNA (ssDNA)在适配体和ssDNA组成的双链DNA孵育后释放, 由于适配体识别不同目标, 能同时对CEA、AFP、PSA这三种肿瘤标志物进行检测.其原理如图 6a所示, 血液中的靶蛋白首先被磁珠(MBs)捕获, 并通过核酸适配体(apt1)进行功能化.随后, 涂有靶蛋白的MBs被另一个适配体(apt2)和信号DNA组成的双链DNA孵育.由于靶蛋白与MBs上的apt2特异性结合, 信号DNA被释放到水溶液中.因此, 该传感器对信号DNA的检测间接检测了靶蛋白.因为自组装的阳离子表面活性剂单分子层的排列被样品网格上的探针DNA打乱, 晶体在水/LC界面上采用倾斜取向(图 6b).然而, 随着信号DNA混合物的加入, 信号DNA与对应的探针DNA的特异性杂交, 液晶在该界面上的取向趋于稳态(图 6c), 由于修复了阳离子表面活性剂单分子层的破坏, 光学图像也随之由亮(图 6d)变暗(图 6e).这种高效、低成本的多路复用方法结合了MBs易于分离、适配体的高特异性识别、灵敏度高等优点.

  图 6

  

  图 6.  辅助目标诱导的适配体解离功能化LC传感器同时检测血液中多种肿瘤标志物的原理^[36]

  Figure 6.  Principle of simultaneous detection of multiple tumor markers in blood with functional LC sensors assisted with target-induced dissociation of an aptamer^[36]

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  在生物传感器中应用适配体时, 适配体对目标的结合能力是其最重要的特征.在体外实验中, 通常从随机序列库中选择适配体, 这个过程称为SELEX(配体通过指数富集的系统进化), 其基础是适配体的靶标结合能力. SELEX是一种有效的筛选方法, 因其可使用聚合酶链式反应(PCR)进行重复的周期选择. 2010年, Savory等^[37]使用遗传算法(GAs)来提高SELEX预先选择适配体的亲和力.利用遗传算法基于靶标结合能力选择适配体时, SELEX首先对候选寡核苷酸进行预选择, 寡核苷酸序列在硅存在时被放大、交叉并突变.因此, 遗传算法可以重新选择对目标分子亲和力高但未被SELEX筛选到的寡核苷酸. Savory将此方法命名为在硅熟化中利用气体优化适体序列的方法, 通过该方法获得了PSA高结合的DNA适配体, 其PSA的结合能力是预先选择的适配体的48倍, 已用于生物样品中PSA的检测.

  3.   前列腺酸性磷酸酶(Prostate acid phosphatase, PAP)

  酸性磷酸酶(ACP)是一种广泛存在于自然界的一种天然酶, 在许多生理过程中发挥着重要作用.它是水解酶中的一种, 可通过水解多磷酸盐与有机磷酸盐的C—O—P键生成无机磷酸盐, 帮助机体进行磷酸盐代谢.血清中ACP的异常表达与某些生理病理过程有关^[38], 可作为甲状旁腺功能亢进、多发性骨髓瘤、肾癌、前列腺癌等相关疾病的诊断指标^[38-40].

  前列腺酸性磷酸酶(PAP)是一种前列腺外分泌物, 是一种分子量为18 kDa的糖蛋白, 是酸性磷酸酶(ACP)的同工酶, 由前列腺上皮细胞溶酶体产生, 当前列腺病变破坏了血清-前列腺屏障以后PAP浓度会产生不同程度地升高^[41].前列腺癌发生时, 血清中PAP水平明显升高, 且其升高程度与前列腺癌的病情基本呈平行关系.与PSA相比, PAP能够更准确地提示肿瘤的微转移^[41].但与PSA广泛应用于临床不同, 因PAP还可以表达于非前列腺肿瘤(如小肠癌、膀胱腺癌等)中, 因此PAP临床应用较少.目前PAP在临床上多用于检测晚期PCa的转移和评估PCa的治疗效果, 而甚少用于PCa的早期诊断.

  由于大多数生物分析物具有较低的丰度, 研究者们往往采用高分辨率的检测方法或者信号放大技术实现目标物的高灵敏检测.迄今为止, 已经提出了各种检测ACP的方法, 包括化学发光^[42]、电化学^[43]、比色^{[44, 45]}、和荧光法^[46-48]. ACP被认为是在前列腺癌中有重要意义的血清学和组织学疾病标志物.因此, 精确监测ACP水平具有重要的现实意义.

  3.1   光电化学法

  PEC由于其激发信号与检测信号的完全分离, 具有较高的灵敏度和较低的检测背景, 是一种极受欢迎的生物传感方法. TiO₂纳米管阵列(TNAs)具有较大的表面积、良好的光化学稳定性和生物相容性, 已应用于PEC生物传感器的制备^[49-52]. g-C₃N₄是一种优良的可见光活性半导体, 能带隙约为2.7 eV^[53], 具有较高的化学稳定性和电子性质^[54].此外, g-C₃N₄表面的官能团容易沉积在TiO₂表面, 有利于TNA/g-C₃N₄传感器的构建^[55-57], 使TNAs在可见光照射下具有良好的光电流响应. 3, 5-二氨基-1, 2, 4-三唑(DAT)是一种良好的有机配体, 可与Cu(II)、Zn(II)、Co(II)、Fe(II)离子配位^[58-60], 在酸性条件下可被NaNO₂氧化形成DAT重氮盐^[61]. 2020年, Huang等^[62]将DAT重氮盐电化学接枝到TNA/g-C₃N₄表面, 由于DAT有机膜的电子位阻效应, 所构建的TNA/g-C₃N₄/DAT的PEC响应明显降低. ACP催化抗坏血酸-2-磷酸(AAP)水解后, 生成的抗坏血酸(AA)作为还原剂将Fe(III)还原为与DAT配合的Fe(II), 使TNA/g-C₃N₄/DAT的电子导电性显著增强, TNA/ g-C₃N₄/DAT的光电流相应增大.同时, 所制备的AA也可以作为TNA/g-C₃N₄/DAT光阳极的电子给体, 进一步放大TNA/g-C₃N₄/DAT的信号.因此, 该法成功地构建了一种简单、灵敏的ACP活性测定的PEC传感器.

  3.2   比色法

  对于ACP的检测, 比色法以其高效、快速、直观等特点引起了广泛的关注.但检测结果容易受待测物本身颜色和环境pH的影响.常规的ACP比色法直接通过紫外可见吸收光谱甚至肉眼来检测底物的有色水解产物, 而基于酶的比色法得益于信号以指数形式的固有放大和易于检测的信号输出, 使检测具有超常的敏感性和可操作性. 2019年, Chen等^[63]发现还原氧化石墨烯(PdSP@rGO)上的钯方型纳米板表现出一种表面依赖的类氧化活性.由{100}PdSP@rGO包裹的Pd纳米板比{111}刻面更活跃.此外, 二维PdSP@rGO显示出比Pd纳米晶相更强的活性.引入AAP后, {100}PdSP@rGO催化的3, 3, 5, 5-四甲基联苯胺(TMB)显色反应受阻, 颜色褪色, 吸光度下降.以AAP为底物, TMB的显色反应为信号, 实现了ACP活性的比色检测(图 7).该法可以通过简单的混合和读出方式对ACP进行一步检测, 线性范围为0.01~6.0 mU/mL, 检测极限为8.3 μU/mL.

  图 7

  

  图 7.  基于AAP调控的{100}PdSP@rGO催化活性检测ACP活性^[63]

  Figure 7.  ACP activity detection based on AAP controlled catalytic activity of {100}PdSP@rGO^[63]

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  纳米酶是一种模拟酶行为的纳米材料, 由于其在恶劣条件下具有良好的化学稳定性、制备方法简单、与天然酶相比成本较低等优点, 因此在生物医学领域具有广阔的应用前景. 2020年, Lin等^[64]发现MoO₃ NPs具有优异的氧化酶模拟活性, 可以催化无色2, 2-偶氮二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)的氧化反应, 从而得到一个绿色产物(green product).因此, 他们将MoO₃ NPs的氧化酶模拟性质与活性炭催化AAP的水解相结合, 建立了一种检测ACP的新颖、简便的比色法.该方法的原理是将AA作为AAP系统中的产物, 干扰ABTs的氧化, 从而抑制MoO₃ NPs氧化酶模拟性质.该方法测定ACP的线性范围为0.09~7.3 U/L, 检出限为0.011 U/L.这种新的比色法已成功地应用于稀释的人血清样品中ACP的检测和ACP抑制剂的筛选.

  3.3   荧光法

  荧光法具有快速、连续、实时等优点, 但用于ACP检测的荧光检测方法较少, 使用的荧光指标主要集中于有机染料和荧光聚合物^[65].近年来, 基于石墨烯量子点、金纳米团簇、CuInS₂量子点等新型发光纳米材料已发展了一系列定量ACP的方法.然而, 基于这些纳米发光材料的检测大多需要过渡金属离子如Ni(II)、Cu(II)作为媒介, 它们受pH、缓冲溶液的限制, 使传感系统不稳定.

  为了改善这一情况, 2016年Huang等^[46]设计了一种基于铜纳米团簇(CuNCs)疏水相互作用控制的纳米开关, 采用一步法合成的亮红色发光CuNCs作为指标.在酸性条件下, 由于质子形式包覆青霉胺的疏水环境使CuNCs大量聚集, CuNCs发光性能得以增强, 并在其表面形成特定的疏水微环境.具有相似疏水性的对硝基苯酚(p-nitrophenol)在水溶液中由于具有较强的疏水作用而被吸附在CuNCs表面, 这种近距离的接触导致CuNCs的荧光猝灭.而α-环糊精(α-cyclodextrin)和p-nitrophenol之间存在更强的疏水作用, 通过竞争作用可将p-nitrophenol从CuNCs表面移除.因此, 引入α-环糊精可作为CuNCs的荧光开关(图 8).该方法对实际样本(包括血清和精浆)具有足够的敏感性, 能够连续实时监测ACP水平.

  图 8

  

  图 8.  基于疏水作用控制的发光CuNCs纳米开关对ACP活性检测策略示意图^[46]

  Figure 8.  Schematic illustration of detection strategy for ACP activity based on the luminescent CuNCs nanoswitch controlled by hydrophobic interaction ^[46]

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  2018年, Qu等^[66]基于氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)开发了一种用于酪氨酸酶(TYR)和酸性磷酸酶(ACP)活性检测的荧光生物传感器. TYR可以催化酪氨酸生成多巴醌(dopaquinone), 该物质可以有效地猝灭N-GQDs的荧光, 且N-GQDs的荧光猝灭程度与TYR的浓度成正比.在ACP存在下, AAP被水解生成AA, 将多巴醌还原成L-dopa, 导致被多巴醌猝灭的N-GQDs荧光恢复.荧光强度与TYR和ACP浓度在0.43~3.85 U/mL和0.04~0.7 mU/mL范围内呈线性相关, 检出限分别为0.15 U/mL和0.014 mU/mL, 该法能用于实际样品的检测.

  2019年Huang等^[67]用双官能的NH₂-MIL-101 MOFs作为荧光指示剂和仿生催化剂, 检测ACP的活性.该材料克服了MOFs传感系统单一的缺陷, NH₂-MIL-101在456 nm (F456)处具有固有的荧光发射.作为一种过氧化物类纳米酶, 它能催化o-苯二胺(OPD)被H₂O₂氧化生成荧光2, 3-二氨基萘嗪, 最大发射为556 nm (F556). OPD、H₂O₂的混合物中加入NH₂-MIL-101后, F456被淬灭, 而F556增加. ACP传感基于焦磷酸离子(PPi)介导的NH₂-MIL-101/OPD/H₂O₂系统的荧光变化. PPi通过与NH₂-MIL-101的Fe中心特异性结合抑制其催化能力, 而ACP的加入通过水解恢复PPi活性.在NH₂-MIL-101/OPD/H₂O₂系统中加入PPi和ACP后, 得到比率发光信号(F556/F456), 用于PPi和ACP活性的灵敏检测, 检测限为0.005 U/L.该传感器已成功用于血清中ACP的检测, 为基于MOFs的生物传感应用开辟了新途径.

  此外, 2019年Weng等^[68]发现ACP在酸性或中性条件下催化聚多巴胺的水解, 而碱性磷酸酶(ALP)没有这样的功能.由此Weng利用碳点作为信号指示剂, 开发了一种简单的ACP检测方法.中性条件下, ACP存在时通过内部过滤效应淬灭碳点, 并对碱性磷酸酶的干扰表现出较高的选择性, 具有良好的分析性能、线性范围宽, 检测限为0.45 U/L.在人类血清样本中优良的试验回收率表明该方法在临床和生物医学领域的应用潜力.

  3.4   荧光共振能量转移法

  荧光共振能量转移(FRET)是指在两个不同的荧光基团中, 作为供体(Donor)的荧光基团的发射光谱与另一个作为受体(Acceptor)基团的吸收光谱有一定的重叠, 当这两个荧光基团间的距离合适时(≤100 Å), 就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象, 即前一种基团的激发波长激发, 可观察到后一个基团发射的荧光.如果受体荧光量子产率为零, 则发生能量转移导致荧光猝灭; 如果受体也是一种荧光发射体, 则呈现出受体的荧光并造成次级荧光光谱的红移.该技术具有较高的光谱分辨率、较好的灵敏度以及优异的选择性.基于纳米等离子体提出的等离子体共振能量转移(PRET)与其原理相同.然而, 在构建PRET时, 很难选择与纳米等离子体探针的光谱刚好重叠的能量受体分子.此外, 供体与受体之间的连接需要特定的化学键才能进行.

  FRET已广泛应用于生物分子识别^[69]、细胞生理状态监测^{[70, 71]}、离子检测^[72]、AuNPs易位^[73]的研究.基于金属配体复合物的选择性形成和PRET过程的可控构建和阻断, 该技术具有较高的分辨率、灵敏度以及优异的选择性. 2020年, Yan等^[74]提出了一种基于oxTMB和海胆状金纳米等离子体(UGPs)之间的PRET检测ACP的新方法.如图 9所示, 由于oxTMB的电子共振峰与UGPs的等离子体共振峰重叠, 可以减弱UGPs的散射强度.在加入ACP后, ACP催化AAP分解产生的水解产物AA, 由于AA具有还原性, 可以有效地将oxTMB还原为TMB, 从而阻断FRET效应.由此, 通过简单的静电吸附, 构建了一个“off-on”FRET传感器用于ACP的灵敏检测.

  图 9

  

  图 9.  基于FRET点亮检测ACP的方案^[74]

  Figure 9.  Working protocol of the light up detection of ACP based FRET^[74]

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  3.5   核磁共振成像

  化学交换饱和转移磁共振成像(CEST MRI)是一种依赖于质子与大量水直接化学交换的成像方法, 目前已发展了许多具有与周围水质子快速交换质子的小分子CEST磁共振造影剂. CEST的对比机制涉及使用射频(RF)饱和脉冲在其共振频率上选择性照射那些可交换质子, 这时饱和质子与水质子在磁共振时间尺度反复交换, 导致水的MRI信号减少.这种大量水信号的损失形成了CEST谱(z谱).水质子对应的频率为4.75 ppm, 在z谱表现为0 ppm.为了量化CEST效果, 使用不对称磁化传递率MTR_asym＝S_sat^-Δω/S₀-S_sat^+Δω/S₀. CEST最显著的特征之一是它可用于检测亚毫米浓度的抗磁性分子, 而不需要金属标记.在¹H核磁共振谱(¹H NMR), 苯酚包含一个可交换的羟基质子共振为4.8 ppm的水, 分别在酸性和碱性条件下可通过CEST-MRI或基于交换的T₂弛豫增强(T_2ex)从而达到亚毫摩尔级检测. 2019年Zhang等^[75]基于苯酚固有的CEST MR特性, 开发了第一个检测酸性磷酸酶(ACP)酶活性的MRI方法.在pH 5.0条件下, 酶底物磷酸苯酯被ACP作用转化为CEST-MRI可检测的苯酚, 为直接定量ACP活性提供了一种简单的方法, 并将该传感器用于检测前列腺细胞酶解液和细胞裂解液中ACP活性的应用.

  3.6   质谱法

  质谱分析是测量离子质荷比(m/z)的分析方法, 基本原理为样品各组分在离子源中发生电离, 生成不同质荷比的带电粒子, 经加速电场形成离子束, 进入质量分析器, 利用电场和磁场作用, 不同质荷比的离子聚焦在不同的点上得到质谱图, 从而确定其质量.基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)由于其无标记和高通量特性是评价生物大分子活性的一种极好工具.但对于实际样品的检测, 其应用范围往往受到分离、纯化和脱盐的限制.

  为进一步拓展“质谱生物传感”^[76]的概念, 并满足临床诊断中标志物的质谱检测需求, Ju等^[77]以氧化铟锡(ITO)玻片为载体, 提出MALDI-MS传感芯片构建的新技术.基于酶的剪切效率, 利用MALDI-MS实现了ACP浓度的定量检测.该工作将末端带有生物素基团的长链聚乙二醇(PEG)以共价形式修饰在ITO玻片上, 再分别将SA和生物素化磷酸肽依次组装到ITO玻片表面获得ACP传感芯片. ACP存在时, 磷酸肽脱去磷酸基团, 产生新的质量信号.利用该信号强度与产物和磷酸肽底物的质量信号强度之和的比值, 进行ACP活性的MALDI-MS定量分析, 线性范围为0.05~1 g/L, 检测限为0.04 g/L.该ACP传感芯片结合MALDI-MS的优势, 可以消除样品中共存物质的干扰, 不需要样品预处理, 为复杂生物样本中ACP的定量检测提供了一个简单、快捷、高选择性、高通量的生物传感方法.通过改变相应的肽底物, 该质谱传感平台可扩展到其它作为生物标志物的蛋白酶的定量分析, 为生物标志物的定量分析提供了新思路.

  4.   总结与展望

  前列腺癌肿瘤标志物对于前列腺癌的早期诊断、晚期PCa转移和对PCa治疗效果的评估具有重要意义.当前, 前列腺癌肿瘤标志物检测的方法学研究主要集中于单个标志物的超灵敏分析.尽管血清肿瘤标志物已经成为诊断恶性肿瘤的手段之一, 但当前列腺癌发生时, 血清中的多项物质的浓度也都会发生极大变化, 单项肿瘤标志物指标检测的敏感性与特异性均存在很大的限制, 对于前列腺癌的早期诊断和治疗效果判断也具有很大的局限性.而且目前常用于前列腺特异性抗原和前列腺酸性磷酸酶的检测技术仍存在一些不足, 临床上普遍使用的酶联免疫吸附测定, 对于生物标志物的检测只能在样品浓度达到临阈值时才会出现信号, 此时疾病已经显著发展, 不符合对肿瘤标志物的检测需求.而常见的荧光法存在假阳性信号, 使检测的准确率降低.同时, 样品的负载率低也极大地影响检测效果, 一些检测方法存在过程繁琐、对样品的纯度要求高、检测成本昂贵、重现性差等缺陷.这些都是目前前列腺癌肿瘤标志物检测方法研究迫切需要解决的问题.

  针对上述问题和即时检测(point-of-care)与联合检测的需求, 高通量、多通道的灵敏检测方法和检测方法的器件化是前列腺癌肿瘤标志物检测方法学研究的发展方向.标志物的多模态检测有利于弥补单项检测的不足, 而即时设备的研制有助于后期对于前列腺癌治疗效果进行监测.这些方法的发展对于提高诊断的敏感性及特异性和肿瘤的检出率, 实现对前列腺癌的早期发现、早期治疗及疗效监测具有重要意义.

  
  
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  图 1  96孔板上PSA的荧光激活免疫分析原理图^[22]

  Figure 1  Representation of the fluorescence-activatable immunoassay for PSA performed in 96-well PS plates^[22]

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  图 2  ECL-PB生物传感器用于PSA测定的原理^[28]

  Figure 2  Schematic diagram of ECL-PB biosensor for the determination of PSA^[28]

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  图 3  (a) PCC电场对WO₃纳米薄片/BTO/Cu₂O光电极空穴对分离的促进作用示意图和(b) WO₃纳米薄片/BTO/Cu₂O光电极的DSCC策略^[31]

  Figure 3  (a) Schematic diagram of the promoting effect of the PCC electric field on the separation of electron-hole pairs and (b) DSCC strategy of the WO₃ nanoflakes/BTO/Cu₂O photoelectrode^[31]

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  图 4  利用PSA检测抗体修饰的金纳米颗粒进行夹心免疫分析^[32]

  Figure 4  Schematic representation of the PSA sandwich assay using PSA detection antibody-modified Au nanoparticles^[32]

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  图 5  (A) TP@PEI/Ab2-MSNs的合成; (B) 96孔板上基于TP@PEI/ Ab2-MSNs扩增比色法检测PSA的无酶免疫吸附检测步骤^[33]

  Figure 5  (A) Synthesis of TP@PEI/Ab2-MSNs and (B) steps of the enzyme-free immunosorbent assay of PSA using TP@PEI/Ab2-MSNs for amplified colorimetric detection in a 96-well plate^[33]

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  图 6  辅助目标诱导的适配体解离功能化LC传感器同时检测血液中多种肿瘤标志物的原理^[36]

  Figure 6  Principle of simultaneous detection of multiple tumor markers in blood with functional LC sensors assisted with target-induced dissociation of an aptamer^[36]

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  图 7  基于AAP调控的{100}PdSP@rGO催化活性检测ACP活性^[63]

  Figure 7  ACP activity detection based on AAP controlled catalytic activity of {100}PdSP@rGO^[63]

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  图 8  基于疏水作用控制的发光CuNCs纳米开关对ACP活性检测策略示意图^[46]

  Figure 8  Schematic illustration of detection strategy for ACP activity based on the luminescent CuNCs nanoswitch controlled by hydrophobic interaction ^[46]

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  图 9  基于FRET点亮检测ACP的方案^[74]

  Figure 9  Working protocol of the light up detection of ACP based FRET^[74]

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