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• 1.   引言

  次硝酸(Nitroxyl, HNO)由一氧化氮(NO)经过单电子还原和质子化作用产生, 化学性质独特, 在多种生理和病理过程中发挥着重要作用^[1-4].研究表明, HNO可与生物硫醇反应, 抑制某些含硫醇的酶活性, 如甘油醛-3-磷酸脱氢酶和乙醛脱氢酶等^[5]. HNO还可刺激心血管扩张, 因此被作为治疗酗酒和心脏衰竭的潜在药物^[6-10].在生理病理状态下, HNO含量低, 半衰期短, 极易发生脱水二聚反应, 检测难度大^[11].因此, 开发可靠的用于检测生物系统中HNO的分析方法具有极大的应用价值.

  荧光分析法由于具有灵敏度高、非侵入性以及较高的时空分辨率等优点而被广泛用于生物样品的分析检测^[12-14].目前, 检测HNO的荧光探针多为有机小分子探针, 且主要基于将Cu(II)还原为Cu(I)^{[15, 16]}或者2-(二苯基膦)苯甲酸与HNO之间发生施陶丁格反应(Staudinger)^[17-20]的机理构建.利用施陶丁格反应机理构建的探针能够有效降低生物还原剂如抗坏血酸、谷胱甘肽等的影响, 对活性氧类物质(ROS)及活性氮类物质(RNS)均具有较好的选择性^[21-23].但是这些有机小分子探针多用可见光激发, 存在生物组织穿透深度低、生物背景荧光强、易光漂白等问题.因此, 开发一种新型的、适于在生物体系特异性检测HNO的荧光探针是非常必要的.

  上转换荧光纳米颗粒(Upconversion nanoparticles, UCNPs)具有近红外光激发, 反斯托克斯发射的特征^{[24, 25]}, 能够有效消除生物样品的自发荧光, 并提高生物成像的穿透深度.此外, UCNPs还具有斯托克斯位移大、光稳定性好、发射谱带窄等优点, 能有效避免激发光的干扰且适合长时间成像.因此, UCNPs是制备荧光探针的优良材料, 上转换荧光纳米探针已在生物传感及成像领域显示出极大的优势^[26-33].

  与传统“turn-on”类型的探针相比, 比率型探针同时测量两个发射信号, 可以提供内置校正来降低由于探针分布不均匀, 样品厚度等问题而产生的测量误差, 提高在生物体系中检测的准确性^[34-37].据我们所知, 目前还没有基于UCNPs的比率型HNO探针的报道.本工作基于发光共振能量转移(Luminescence resonance energy transfer, LRET)原理, 以具有独特结构的UCNPs为能量供体, 有机染料Fl-TP为潜在能量受体, 成功构建了一种用于特异性测定HNO的比率型纳米探针.如图 1所示, 探针与HNO反应后, Fl-TP转换为Fl-HNO, 触发UCNPs与染料之间的LRET过程, 此时UCNPs的荧光被猝灭, 并出现Fl-HNO的荧光发射.比率荧光信号, 即Fl-HNO的荧光发射强度(F_{525 nm})与UCNPs的上转换荧光强度(F_{480 nm})的比值, 与HNO浓度的对数呈良好的线性关系, 可用于HNO的定量检测.相比于完全依赖UCNPs的不同波长发射信号实现比率变化的探针, 这种基于染料和UCNPs发射构建的比率探针与目标物响应后, UCNPs荧光信号减弱, 染料荧光信号增强, 比率信号变化更加明显, 可有效提高探针的检测灵敏度, 使探针能更真实地反映目标物浓度的变化.

  图 1

  

  图 1.  基于LRET原理构建比率型Fl-TP-UCNPs探针及对HNO响应的原理图

  Figure 1.  Schematic illustration of the construction of Fl-TP-UCNPs ratiometric probe and sensing of HNO through LRET principle

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  2.   结果与讨论

  2.1   Fl-TP-UCNPs的响应机理

  荧光素类染料具有优良的光物理性能, 分子结构易修饰, 很适合作为UCNPs的能量受体.因此, 本工作合成一种荧光素类衍生物Fl-TP作为可特异性识别HNO的能量受体.与HNO反应前, Fl-TP为无吸收的闭环状态, 抑制了LRET过程.与HNO发生施陶丁格反应后, Fl-TP释放三苯基膦单体并转换为开环状态的Fl-HNO, Fl-HNO在400~500 nm处具有明显吸收(图 2A), 与UCNPs的蓝色发射光谱相匹配, LRET过程得以发生.由于开环结构的Fl-HNO具有强的荧光性能(图 2B), LRET的发生会同时引起UCNPs荧光(480 nm)的减弱及染料荧光(525 nm)的增强, 从而可根据染料与UCNPs荧光强度的比值进行HNO的定量分析.

  图 2

  

  图 2.  (A) Fl-TP、Fl-HNO的吸收光谱和UCNPs的发射光谱; (B) Fl-TP对不同浓度AS (Angel’s salt, HNO供体)的响应

  Figure 2.  (A) Absorption spectra of Fl-TP and Fl-HNO as well as the emission spectrum of UCNPs; (B) Emission spectra of Fl-TP responding to different concentrations of AS (Angeli's salt, a generally used HNO donor)

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  2.2   UCNPs的表征

  本文合成了核壳结构的UCNPs (NaYbF₄:30%Gd@ NaYF₄:2%Yb:1%Tm)^[38-40], 其中Gd³⁺用于控制晶核生长速度, 减小纳米颗粒粒径^[41].与传统结构(NaYF₄:Yb, Tm)相比, 这种结构的UCNPs具有两个优势:首先, 发光离子(Tm³⁺)限域在纳米颗粒表面的薄层内, 有效缩短了发光离子与受体间的距离.由于LRET效率与供-受体间距离的六次方成反比^{[40, 42, 43]}, 距离的减少可显著提高LRET效率; 其次, 核内高浓度掺杂的敏化剂Yb³⁺增强了UCNPs对近红外光的吸收能力, 能够显著提高UCNPs的亮度^[44].掺杂在壳层的Yb³⁺起到桥联离子的作用, 能提高发光离子的整体泵浦效率, 因此对壳层中Yb³⁺浓度进行优化, 确定Yb³⁺浓度为2%(图S1).

  对合成的UCNPs进行表征, 透射电子显微镜图像(Transmission electron microscopy, TEM)表明本文制备的UCNPs具有良好的形貌和均一的尺寸(图 3A~D).其中, 核纳米颗粒的粒径为(20.0±1.5) nm, 核壳结构UCNPs的平均粒径为(27.5±1.7) nm, 壳层厚度为3.8 nm.所得UCNPs的X射线粉末衍射(X-ray powder diffraction, XRD)图像与标准六方相NaYF₄的谱图(JCPDS No. 16-0034)一致, 表明其为六方相(图 3E).

  图 3

  

  图 3.  (A) NaYbF₄:Gd和(B) NaYbF₄:Gd@NaYF₄:Yb:Tm的透射电子显微镜成像; (C) NaYbF₄:Gd和(D) NaYbF₄:Gd@NaYF₄:Yb:Tm的粒径分布直方图; (E)核NaYbF₄:Gd、核-壳NaYbF₄:Gd@NaYF₄:Yb:Tm、UCNPs@PEG和Fl-TP-UCNPs的XRD图像

  Figure 3.  The transmission electron microcopy (TEM) images of OA-coated (A) NaYbF₄:Gd and (B) NaYbF₄:Gd@NaYF₄:Yb:Tm. Histograms of the size distribution of (C) NaYbF₄:Gd and (D) NaYbF₄:Gd@ NaYF₄:Yb:Tm. (E) XRD patterns of the core structure NaYbF₄:Gd, core-shell structure NaYbF₄:Gd@NaYF₄:Yb:Tm, UCNPs@PEG and Fl-TP-UCNPs

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  2.3   Fl-TP-UCNPs探针的表征

  为实现能量供受体的组装, 两亲性聚合物DSPE-PEG(分子结构式如图S2所示)通过疏水作用包覆OA-UCNPs, 在UCNPs表面形成疏水腔.随后Fl-TP通过疏水-疏水作用负载于疏水腔内, 完成Fl-TP-UCNPs探针的构建^[45].利用傅里叶变换红外光谱图(Fourier transform infrared spectra, FTIR)对Fl-TP-UCNPs探针进行表征, 如图S3所示, 1769 cm^-1及1640 cm^-1分别对应Fl-TP分子内酯键及DSPE-PEG分子内酰胺键的C=O的伸缩振动峰^{[46, 47]}, 证明Fl-TP-UCNPs组装成功. TEM图像表明在修饰前后, DSPE-PEG@UCNPs与Fl-TP- UCNPs的形貌均未发生明显变化(图S4A, B).由于Fl-TP分子为电中性, 与Fl-TP结合之后, DSPE-PEG@UCNPs的Zeta电势未发生显著变化(图S5A, B). DSPE-PEG@UCNPs的水合动力学直径为150 nm (图S5C), 与Fl-TP结合之后, 水合动力学直径变为190 nm (图S5D).在980 nm连续激光激发下, 探针与AS反应后, 525 nm处可以明显察到Fl-HNO的发射, UCNPs在480 nm处的发射强度相应地下降(图S6), 由此证明我们成功构建了一个基于LRET的比率型检测平台.

  2.4   Fl-TP-UCNPs探针对HNO的响应

  随后我们探究了Fl-TP-UCNPs对HNO的响应性能.首先, 对影响探针响应性能的因素进行优化, 图S7显示了Fl-TP-UCNPs与HNO反应的动力学曲线.由图可知比率信号(F_{525 nm}/F_{480 nm})随时间逐渐增大, 在50 min时达到平台.为确保反应完全, 将孵育时间定为1 h.染料Fl-TP的负载量对探针的响应性能也会产生显著影响, 如图S8所示, 染料浓度在60~300 μmol•L^-1范围时, 随染料浓度增加, 比率信号(F_{525 nm}/F_{480 nm})显著增大.当Fl-TP的浓度达到400 μmol•L^-1时, 此时Fl-TP的负载量达到饱和, 比率信号增加趋势不明显.因此, 选择300 μmol•L^-1作为构建探针的最优染料浓度.

  在最佳条件下, 探究Fl-TP-UCNPs对HNO的响应.如图 4A所示, 在0~100 μmol•L^-1范围内, 随HNO浓度增加, UCNPs的荧光强度(F_{480 nm})逐渐降低, Fl-HNO的荧光强度(F_{525 nm})逐渐增强.比率信号(F_{525 nm}/F_{480 nm})在3~100 μmol•L^-1范围内与AS浓度对数呈良好的线性关系(R²=0.9914), 线性方程为F_{525 nm}/F_{480 nm}= -0.0493+0.25239c (c为AS浓度的对数) (图 4B), 检测限(3σ/s, s为线性方程斜率)为23.4 nmol•L^-1, 与目前报道检测HNO的有机小分子探针灵敏度相当(表S1).上述结果表明该探针在水溶液中对HNO有较好的响应性能.

  图 4

  

  图 4.  (A) Fl-TP-UCNPs对不同浓度AS响应的发射光谱; (B)比率信号(F_{525 nm}/F_{480 nm})与AS浓度的对数之间的线性关系

  Figure 4.  (A) Emission spectra of Fl-TP-UCNPs responding to different concentrations of AS. (B) The linear relationship between ratiometric fluorescence signal (F_{525 nm}/F_{480 nm}) of Fl-TP-UCNPs and the logarithm of AS concentration

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  2.5   Fl-TP-UCNPs探针的选择性与稳定性

  为实现生物体系中的应用, 荧光探针需具备良好的选择性与稳定性以克服复杂生物环境产生的干扰.为考察探针的选择性, 在相同条件下测试探针对其他干扰物的响应.如图S9所示, 金属离子、氨基酸、ROS、RSS(活性硫类物质)、RNS等干扰物对比率荧光信号的影响较小, 探针对HNO有较好的选择性.随后探究Fl-TP-UCNPs探针的热稳定性和pH稳定性.如图S10A所示, 在37 ℃下孵育2 h, 上转换荧光强度基本无变化.此外, 如图S10B所示, 在4.5~8.0的pH范围内, 探针的上转换荧光强度基本保持稳定.以上结果表明探针具有良好的选择性、热稳定性和pH稳定性, 满足进行生物体系中HNO成像分析的前提.

  2.6   细胞成像

  为确保探针具有足够的生物相容性, 首先采用CCK-8试验考察探针的细胞毒性.如图S11所示, 在与不同浓度Fl-TP-UCNPs (0~0.6 mg•mL^-1)孵育24 h后, HeLa细胞存活率无明显变化, 表明探针毒性较低, 适合用于生物成像.随后, 本工作考察了Fl-TP-UCNPs监测活细胞中HNO含量变化的能力. Fl-TP-UCNPs (0.3 mg•mL^-1)探针与HeLa细胞孵育2 h, 通过胞吞形式进入细胞^[48], 随后用不同浓度的AS (0, 10, 50, 100 μmol•L^-1)处理细胞1 h后进行荧光成像.如图 5A~D所示, 随着HNO浓度增大, UCNPs通道的荧光发射强度逐渐降低, Fl-HNO通道的荧光发射强度逐渐增强, HNO浓度为100 μmol•L^-1时, 比率信号达到最大(图 5E), 这与溶液中的测试结果相符.证明Fl-TP-UCNPs可应用于活细胞内HNO浓度的变化监测.

  图 5

  

  图 5.  HeLa细胞的共聚焦成像, (A~D)用Fl-TP-UCNPs (0.3 mg• mL^-1)孵育2 h, 然后细胞用不同浓度的AS (A: 0; B: 10 μmol•L^-1; C: 50 μmol•L^-1; D: 100 μmol•L^-1)处理1 h; (E)图(A~D)的比率信号(F_Fl-HNO/F_UCNPs).收集400~500 nm (UCNPs通道)和500~600 nm (Fl-HNO通道)的信号, 比例尺: 20 μm

  Figure 5.  Confocal microscopic images of HeLa cells incubated with Fl-TP-UCNPs (0.3 mg•mL^-1) for 2 h: (A) cells incubated with Fl-TP-UCNPs only; (B~D) cells treated with (B) 10 μmol•L^-1 AS; (C) 50 μmol•L^-1 AS; (D) 100 μmol•L^-1 AS after pretreated with Fl-TP-UCNPs. (E) Ratiometric signal of Fl-HNO emission to UCNPs emission in images (A~D). The emissions were collected at 400~500 nm (UCNPs channel) and 500~600 nm (Fl-HNO channel), respectively. Scale bar: 20 μm

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  根据文献报道, 机体内气体信号分子H₂S与NO相互作用(“串扰”机制)生成HNO^[49].本文初步探究了活细胞中H₂S与NO相互作用生成HNO的过程.文献报道Na₂S和DETA NONOate可作为产生H₂S和NO的供体^[50], 因此使用二者探究该过程.如图 6C所示, 只有同时添加了Na₂S与DETA NONOate, 才可以观察到UCNPs通道信号减弱, Fl-HNO通道信号增强.而只使用Fl-TP-UCNPs处理的图 6A、未使用DETA NONOate处理的图 6B及使用N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC, 巯基清除剂)处理的图 6D中均只能观察到UCNPs通道出现荧光, Fl-HNO通道荧光信号不明显.基于以上测试结果, 证明Fl-TP-UCNPs可用于活细胞中监测H₂S与NO共同作用产生的HNO, 有望用于生理病理过程中HNO浓度的监测.

  图 6

  

  图 6.  HeLa细胞探针的共聚焦成像, (A~D)用Fl-TP-UCNPs (0.3 mg•mL^-1)孵育2 h, 然后(A)只用探针处理; (B)用200 μmol•L^-1 Na₂S处理0.5 h; (C)用200 μmol•L^-1 Na₂S处理0.5 h, 再用1 mmol•L^-1 DETA NONOate处理1 h; (D) 200 μmol•L^-1 Na₂S处理0.5 h, 再加入1 mmol•L^-1 NAC处理0.5 h, 最后再用1 mmol•L^-1 DETA NONOate处理1 h; (E)图(A~D)的比率信号(F_Fl-HNO/F_UCNPs).收集400~500 nm (UCNPs通道)和500~600 nm (Fl-HNO通道)的信号, 比例尺: 20 μm

  Figure 6.  Confocal microscopic images of HeLa cells incubated with Fl-TP-UCNPs (0.3 mg•mL^-1) for 2 h: (A) cells incubated with Fl-TP-UCNPs only; (B) cells pretreated with 200 μmol•L^-1 Na₂S for 0.5 h; (C) cells pretreated with 200 μmol•L^-1 Na₂S for 0.5 h and 1 mmol•L^-1 DETA NONOate for another 1 h; (D) cells pretreated with 200 μmol•L^-1 Na₂S for 0.5 h and then 1 mmol•L^-1 NAC for another 0.5 h, finally 1 mmol•L^-1 DETA NONOate was added for 1 h. (E) Ratiometric signal of Fl-HNO emission to UCNPs emission in images (A~D). Images were acquired at 400~500 nm (UCNPs channel) and 500~600 nm (Fl-HNO channel), respectively. Scale bar: 20 μm

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  2.7   组织成像

  为进一步考察Fl-TP-UCNPs在活体内的分析性能, 测试了Fl-TP-UCNPs对小鼠肝脏组织中HNO的响应能力^{[51, 52]}.因为根据文献报道, 粒径为20~150 nm的纳米颗粒在肝脏中富集较多, 所以选取肝脏进行成像^[53].将Fl-TP-UCNPs (200 μL, 5 mg•mL^-1分散于生理盐水)通过腹腔注射至Balb/c小鼠(雄性, 约20 g), 20 min后腹腔注射不同浓度的AS溶液(体积为100 μL, 物质的量分别为0, 0.5 μmol和1 μmol). 3 h后将小鼠解剖并取肝脏组织, 切片后进行共聚焦成像.如图 7所示, 探针在肝脏组织内均匀分布.随着AS注射量的增加, UCNPs通道的信号逐渐减弱, Fl-HNO通道的信号逐渐增强, 该现象与溶液、细胞中的现象一致, 证明Fl-TP-UCNPs可以测定生物组织中HNO的浓度变化.

  图 7

  

  图 7.  小鼠肝脏切片的共聚焦成像, (A~C)用Fl-TP-UCNPs (0.3 mg•mL^-1)探针对小鼠进行腹腔注射, 然后腹腔注射不同浓度的AS (A: 0; B: 0.5 μmol; C: 1 μmol); (D)图(A~C)的比率信号(F_Fl-HNO/F_UCNPs).收集400~500 nm (UCNPs通道)和500~600 nm (Fl-HNO通道)的信号, 比例尺: 200 μm

  Figure 7.  Confocal microscopic images of mice liver slices injected with Fl-TP-UCNPs (0.3 mg•mL^-1). (A~C) Mice injected with AS (A: 0 μmol; B: 0.5 μmol; C: 1 μmol). (D) Ratiometric fluorescence signal of images (A~C). The emissions were collected at 400~500 nm (UCNPs channel) and 500~600 nm (Fl-HNO channel), respectively. Scale bar: 200 μm.

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  3.   结论

  成功构建了用于HNO检测的比率型上转换荧光纳米探针.该探针基于LRET原理, 以UCNPs为能量供体, 荧光素衍生物Fl-TP为潜在能量受体.与HNO特异性反应后, 由于触发了LRET作用, UCNPs荧光强度减弱, 受体荧光逐渐增强, 比率信号(F_{525 nm}/F_{480 nm})与AS浓度对数间具有良好的线性关系.该探针具有较高的灵敏度及良好的稳定性、选择性、生物相容性, 成功实现了对活细胞以及肝脏组织中HNO的检测和成像.同时, 比率信号也提高了检测结果的可靠性.基于其优良性能, 该探针有望用于监测各种生理病理过程中HNO的含量变化.

  4.   实验部分

  4.1   Fl-TP的合成

  合成路线如图S12所示.化合物2和4按照文献报道合成^{[45, 54]}.化合物5由化合物2 (200 mg, 0.6 mmol)和化合物4 (185 mg, 0.72 mmol)溶解于甲磺酸中, 在60 ℃反应8 h, 再经过硅胶柱层析得到的. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.03 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.71~7.58 (m, 2H), 7.16 (d, J=7.5 Hz, 1H), 6.77 (dd, J=5.1, 2.4 Hz, 2H), 6.71~6.52 (m, 4H), 3.98 (t, J=6.5 Hz, 2H), 1.84~1.73 (m, 2H), 1.44 (d, J=7.0 Hz, 2H), 1.26 (s, 24H), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 3H).

  Fl-TP通过下列合成步骤得到.将2-(二苯基膦)苯甲酸(0.17 mmol)溶于无水N, N-二甲基甲酰胺(N, N-Dimethylformamide, DMF)中.在冰浴条件下, 加入37 mg (0.2 mmol)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimide hydrochloride, EDCI)和2 mg (0.02 mmol)的4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine, DMAP).反应0.5 h后, 加入110 mg (0.2 mmol)化合物5, 升温至室温并搅拌过夜.反应混合物倒入水中, 用乙酸乙酯萃取后旋蒸除去有机溶剂, 最后用硅胶柱层析分离, 得到产物Fl-TP 64 mg, 产率为45%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.28~8.20 (m, 1H), 8.01 (d, J=7.4 Hz, 1H), 7.58~7.69 (m, 2H), 7.49~7.44 (m, 2H), 7.38~7.26 (m, 10H), 7.14 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.02~6.97 (m, 1H), 6.95 (d, J=2.2 Hz, 1H), 6.76~6.70 (m, 2H), 6.69~6.64 (m, 1H), 6.64~6.57 (m, 2H), 3.97 (t, J=6.5 Hz, 2H), 1.87~1.73 (m, 2H), 1.51~1.40 (m, 2H), 1.32~1.22 (m, 24H), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 3H) (图S13). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 169.37, 164.76, 161.03, 153.13, 152.24, 151.83, 151.75, 141.72, 141.44, 137.51, 137.40, 135.08, 134.52, 134.14, 134.13, 133.93, 133.92, 132.76, 131.43, 131.41, 129.79, 128.93, 128.87, 128.86, 128.66, 128.64, 128.58, 128.57, 128.38, 126.51, 125.05, 124.08, 117.45, 116.73, 112.34, 110.61, 110.46, 101.35, 82.60, 68.42, 31.94, 29.71, 29.69, 29.67, 29.61, 29.58, 29.37, 29.09, 26.01, 22.71, 14.14 (图S14). HRMS (m/z): [M+Na]⁺ calcd for [C₅₅H₅₇O₆NNa]⁺ 867.3785, found 867.377 (图S15).

  4.2   油酸修饰的上转换纳米颗粒(OA-UCNPs)合成

  UCNPs根据逐层晶种生长法合成.首先, 将0.5 mmol油酸盐[n(Yb³⁺):n(Gd³⁺)=70:30], 20 mmol氟化钠(NaF), 10 mL油酸(Oleic acid, OA)和10 mL十八烯(1-octadecene, ODE)加入到三口烧瓶中.抽真空, 在氩气保护下, 升温至110 ℃保持1 h, 随后升温至320 ℃保持75 min.取出4 mL反应液用于之后的表征, 然后将分散在8 mL OA/ODE混合液中的0.4 mmol油酸盐[n(Y³⁺):n(Yb³⁺):n(Tm³⁺)=75:4:1]匀速加入到混合液中, 继续保持320 ℃反应40 min.混合液冷却至室温, 用等体积的乙醇使纳米颗粒沉淀下来, 纳米颗粒用体积比为1:1的己烷/乙醇洗涤三次后, 分散在己烷里备用.

  4.3   制备Fl-TP-UCNPs探针

  将1 mg•mL^-1的OA-UCNPs和等质量的DSPE-PEG分散在氯仿中, 溶液搅拌过夜直至氯仿挥发完全, 将残留物(DSPE-PEG@UCNPs)分散在超纯水中. Fl-TP溶于DMF中, 然后缓慢滴加至搅拌中的DSPE-PEG@ UCNPs中, 过夜搅拌.离心除去多余的DSPE-PEG和Fl-TP, 沉淀用超纯水洗涤两次后并分散在超纯水中, 得到Fl-TP-UCNPs, 使其终浓度为1 mg•mL^-1.

  4.4   Fl-TP-UCNPs在水溶液中的响应

  在HEPES (100 mmol•L^-1, pH=7.2)缓冲溶液中, 0.05 mg•mL^-1的Fl-TP-UCNPs与不同浓度的AS (0~100 μmol•L^-1)混合, 37 ℃反应1 h.以980 nm连续激光器为激发光源, 收集400~600 nm范围内的荧光信号.

  4.5   选择性

  在HEPES (100 mmol•L^-1, pH=7.2)缓冲溶液中, 0.05 mg•mL^-1的Fl-TP-UCNPs与AS (100 μmol•L^-1)和其他干扰物(100 μmol•L^-1)在37 ℃孵育1 h.以980 nm连续激光器为激发光源, 收集400~600 nm范围内的荧光信号.

  4.6   稳定性

  在HEPES (100 mmol•L^-1, pH=7.2)缓冲溶液中, 0.05 mg•mL^-1的Fl-TP-UCNPs在37 ℃孵育2 h, 收集不同时段的上转换荧光信号, 测定探针的热稳定性.在磷酸缓冲溶液内, 测定不同pH对探针的影响, 37 ℃条件下孵育1 h, 收集上转换荧光信号, 测定探针的pH稳定性.

  4.7   细胞毒性

  探针的毒性用CCK-8的实验方法探究.首先将HeLa细胞接种于96孔板中, 使用含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基, 37 ℃培养24 h.随后加入含有不同浓度Fl-TP-UCNPs探针(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg•mL^-1)的新鲜培养基继续培养24 h.之后每孔加入10 μL的CCK-8, 继续孵育4 h.最后用酶标仪测定450 nm处的吸光度, 计算细胞存活率, 细胞存活率的计算方式为(Fl-TP-UCNPs组的平均吸光度/对照组的平均吸光度)×100%.

  4.8   细胞成像

  将HeLa细胞接种于共聚焦小皿中, 培养24 h.然后用含有0.03 mg•mL^-1探针的新鲜培养基继续孵育2 h.用PBS清洗三次以除去未进入细胞的探针, 接着加入含有不同浓度AS (0、10、50、100 μmol•L^-1)的新鲜培养基继续孵育1 h.用PBS清洗三次后, 共聚焦成像.

  接着探究该探针能否对气体分子H₂S与NO相互作用产生的HNO成像.将HeLa细胞接种于共聚焦小皿中, 分为四组, 培养24 h.然后用含有0.03 mg•mL^-1探针的新鲜培养基继续孵育2 h.第一组只使用Fl-TP-UCNPs处理2 h.第二组用Fl-TP-UCNPs处理后继续用200 μmol•L^-1 Na₂S处理30 min.第三组重复第二组的操作后再加入1 mmol•L^-1 DETA NONOate孵育1 h.第四组依然重复第二组的操作, 在加入DETA NONOate前, 先用1 mmol•L^-1 NAC孵育30 min.最后, 用PBS清洗三次, 共聚焦成像.

  4.9   组织成像

  Balb/c小鼠(雄性, 20 g)由中国武汉古德生物科技有限公司提供, 通过腹腔注射向小鼠(n=3)体内注射Fl-TP-UCNPs (200 μL, 5 mg•mL^-1分散于生理盐水). 20 min后, 通过腹腔注射的方法向对应小鼠体内注射不同浓度的AS溶液(体积为100 μL, 物质的量分别为0, 0.5 μmol和1 μmol). 3 h后, 将小鼠解剖并取肝脏组织, 冰切, 共聚焦成像.

  
  
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  图 1  基于LRET原理构建比率型Fl-TP-UCNPs探针及对HNO响应的原理图

  Figure 1  Schematic illustration of the construction of Fl-TP-UCNPs ratiometric probe and sensing of HNO through LRET principle

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  图 2  (A) Fl-TP、Fl-HNO的吸收光谱和UCNPs的发射光谱; (B) Fl-TP对不同浓度AS (Angel’s salt, HNO供体)的响应

  Figure 2  (A) Absorption spectra of Fl-TP and Fl-HNO as well as the emission spectrum of UCNPs; (B) Emission spectra of Fl-TP responding to different concentrations of AS (Angeli's salt, a generally used HNO donor)

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  图 3  (A) NaYbF₄:Gd和(B) NaYbF₄:Gd@NaYF₄:Yb:Tm的透射电子显微镜成像; (C) NaYbF₄:Gd和(D) NaYbF₄:Gd@NaYF₄:Yb:Tm的粒径分布直方图; (E)核NaYbF₄:Gd、核-壳NaYbF₄:Gd@NaYF₄:Yb:Tm、UCNPs@PEG和Fl-TP-UCNPs的XRD图像

  Figure 3  The transmission electron microcopy (TEM) images of OA-coated (A) NaYbF₄:Gd and (B) NaYbF₄:Gd@NaYF₄:Yb:Tm. Histograms of the size distribution of (C) NaYbF₄:Gd and (D) NaYbF₄:Gd@ NaYF₄:Yb:Tm. (E) XRD patterns of the core structure NaYbF₄:Gd, core-shell structure NaYbF₄:Gd@NaYF₄:Yb:Tm, UCNPs@PEG and Fl-TP-UCNPs

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  图 4  (A) Fl-TP-UCNPs对不同浓度AS响应的发射光谱; (B)比率信号(F_{525 nm}/F_{480 nm})与AS浓度的对数之间的线性关系

  Figure 4  (A) Emission spectra of Fl-TP-UCNPs responding to different concentrations of AS. (B) The linear relationship between ratiometric fluorescence signal (F_{525 nm}/F_{480 nm}) of Fl-TP-UCNPs and the logarithm of AS concentration

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  图 5  HeLa细胞的共聚焦成像, (A~D)用Fl-TP-UCNPs (0.3 mg• mL^-1)孵育2 h, 然后细胞用不同浓度的AS (A: 0; B: 10 μmol•L^-1; C: 50 μmol•L^-1; D: 100 μmol•L^-1)处理1 h; (E)图(A~D)的比率信号(F_Fl-HNO/F_UCNPs).收集400~500 nm (UCNPs通道)和500~600 nm (Fl-HNO通道)的信号, 比例尺: 20 μm

  Figure 5  Confocal microscopic images of HeLa cells incubated with Fl-TP-UCNPs (0.3 mg•mL^-1) for 2 h: (A) cells incubated with Fl-TP-UCNPs only; (B~D) cells treated with (B) 10 μmol•L^-1 AS; (C) 50 μmol•L^-1 AS; (D) 100 μmol•L^-1 AS after pretreated with Fl-TP-UCNPs. (E) Ratiometric signal of Fl-HNO emission to UCNPs emission in images (A~D). The emissions were collected at 400~500 nm (UCNPs channel) and 500~600 nm (Fl-HNO channel), respectively. Scale bar: 20 μm

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  图 6  HeLa细胞探针的共聚焦成像, (A~D)用Fl-TP-UCNPs (0.3 mg•mL^-1)孵育2 h, 然后(A)只用探针处理; (B)用200 μmol•L^-1 Na₂S处理0.5 h; (C)用200 μmol•L^-1 Na₂S处理0.5 h, 再用1 mmol•L^-1 DETA NONOate处理1 h; (D) 200 μmol•L^-1 Na₂S处理0.5 h, 再加入1 mmol•L^-1 NAC处理0.5 h, 最后再用1 mmol•L^-1 DETA NONOate处理1 h; (E)图(A~D)的比率信号(F_Fl-HNO/F_UCNPs).收集400~500 nm (UCNPs通道)和500~600 nm (Fl-HNO通道)的信号, 比例尺: 20 μm

  Figure 6  Confocal microscopic images of HeLa cells incubated with Fl-TP-UCNPs (0.3 mg•mL^-1) for 2 h: (A) cells incubated with Fl-TP-UCNPs only; (B) cells pretreated with 200 μmol•L^-1 Na₂S for 0.5 h; (C) cells pretreated with 200 μmol•L^-1 Na₂S for 0.5 h and 1 mmol•L^-1 DETA NONOate for another 1 h; (D) cells pretreated with 200 μmol•L^-1 Na₂S for 0.5 h and then 1 mmol•L^-1 NAC for another 0.5 h, finally 1 mmol•L^-1 DETA NONOate was added for 1 h. (E) Ratiometric signal of Fl-HNO emission to UCNPs emission in images (A~D). Images were acquired at 400~500 nm (UCNPs channel) and 500~600 nm (Fl-HNO channel), respectively. Scale bar: 20 μm

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  图 7  小鼠肝脏切片的共聚焦成像, (A~C)用Fl-TP-UCNPs (0.3 mg•mL^-1)探针对小鼠进行腹腔注射, 然后腹腔注射不同浓度的AS (A: 0; B: 0.5 μmol; C: 1 μmol); (D)图(A~C)的比率信号(F_Fl-HNO/F_UCNPs).收集400~500 nm (UCNPs通道)和500~600 nm (Fl-HNO通道)的信号, 比例尺: 200 μm

  Figure 7  Confocal microscopic images of mice liver slices injected with Fl-TP-UCNPs (0.3 mg•mL^-1). (A~C) Mice injected with AS (A: 0 μmol; B: 0.5 μmol; C: 1 μmol). (D) Ratiometric fluorescence signal of images (A~C). The emissions were collected at 400~500 nm (UCNPs channel) and 500~600 nm (Fl-HNO channel), respectively. Scale bar: 200 μm.

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