生物标志物的高灵敏度检测和准确分析对于疾病的早期检测和治疗至关重要[1~5].碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)是一种广泛存在于哺乳动物组织和体液中的磷酸单酯酶, 可以非特异性地催化磷酸单酯的水解反应和磷酸基团的转移反应[6]. ALP在许多关键的生理学和病理学进程中发挥着重要的作用[7, 8].作为一种重要的生物标志物, 血清中ALP的异常水平与许多疾病如骨病、肝功能不全、心力衰竭、卵巢癌和乳腺癌等密切相关[9].因此, 开发便捷可靠的ALP测定方法在临床诊断和生物医学研究中具有重要意义.焦磷酸根离子(P2O74-, PPi), 作为一种重要的生物阴离子, 参与很多关键的生理学过程, 例如DNA聚合[10]、酶促反应[11]和细胞代谢[12]等.此外, PPi在人体中是一种有效的矿化抑制剂, 在骨骼矿化和血管钙化中发挥着重要作用.作为ALP催化反应的底物, 其浓度可以通过ALP的水解程度来调节.因此, 开发一种可以便利的、高灵敏度和高选择性的检测ALP和PPi两种生物标志物的化学传感器很有必要.
迄今为止, 已经报道的ALP或PPi检测方法主要有荧光法[13~16]、电化学法[17]和比色法[18]等.其中, 荧光分析法因其灵敏度高、简单易行、可实时检测而被广泛关注[19, 20].而紫外-可见分光光度法具有测定准确度高、不易受干扰和应用范围广的优势.然而, 目前无论用于检测ALP还是PPi的分析方法, 大都局限于单一模式的信号输出.而结合不同信号输出的多模式检测方法, 可以有效减少环境因素影响, 提升检测方法的准确度和可靠性, 更适合实际应用[21, 22].因此, 开发双信号输出的生物传感器用于重要生物标志物的高灵敏检测具有重要意义.
作为经典的分子生物学技术, 酶级联反应可依次执行多种酶促反应, 广泛用于生命系统中的信号转导和扩增.由于其有效的信号放大机制, 天然酶的级联扩增体系近来被开发用于高灵敏度和选择性的生物分析[23, 24].然而, 由于天然酶的不稳定、易失活及价格昂贵等缺点, 其发展和应用受到一定限制.近年来, 模拟酶因其成本低和热稳定性好等优点而受到广泛关注[25, 26]. Fe3O4纳米粒子[27]、Pt纳米颗粒[28]、CeO2纳米粒子[29]和MnO2纳米粒子[30]等多种材料作为模拟酶已经被用于构建生物标志物的检测传感系统[31, 32].受此启发, 我们认为, 构建模拟酶-天然酶级联反应体系, 有望用于信号放大的生物分析[33, 34].目前, 一些作为模拟酶的材料合成步骤比较复杂, 水溶性较差容易聚沉, 从而影响了催化活性[35].金属离子和有机配体自组装形成的金属有机框架(MOFs)材料制备过程简单, 同时具有超高的表面积和孔隙率、孔隙大小均匀可调和结构多样等优点[36~38].其水溶性和稳定性可以通过调节配体结构进行优化[39].同时, MOFs材料具有的表面积大和孔隙率高的特性, 使其具有作为模拟酶的潜力.基于以上分析, 我们以潜在的MOFs材料与ALP为例, 设计模拟酶-天然酶级联反应体系, 进行信号放大的生物分析.
我们发现Cu基MOFs HKUST-1具有类氧化酶活性, 可以在有氧条件下催化邻苯二胺(o-phenylenediamine, OPD)的氧化, 生成带有强荧光和紫外信号的氧化产物(2, 3-diaminophenazine, oxOPD).由于PPi可以和HKUST-1表面的Cu2+配位[40], 对其催化活性产生抑制, 从而导致荧光和紫外信号降低, 降低值与PPi浓度呈现正相关.此外, ALP可以催化PPi去磷酸化, 从而恢复HKUST-1的催化能力, 使荧光和紫外吸收信号恢复.基于设计的模拟酶-天然酶级联反应体系, 我们开发了一种可以灵敏检测ALP和PPi两种生物标志物的荧光/紫外双模式传感平台(图式 1).该双模式检测结合了荧光检测的高灵敏度及紫外的准确度高且不易受干扰特性.两种不同的输出方式, 环境波动可以大大消除, 确保了检测结果的可靠性.据我们所知, 这是第一次将模拟酶-天然酶级联放大用于双模式的生物分析.由于酶级联催化放大效应, 该系统具有灵敏度高和检测限低的特点, 并实现了人血清样品中ALP的超灵敏分析.
根据文献报道的方法制备HKUST-1[41].在室温下, 以水作为反应介质, 快速混合铜前体溶液(Cu(NO3)2· 3H2O)和配体均苯三甲酸(H3BTC)悬浮液, 反应2 h后合成HKUST-1.通过扫描电子显微镜(SEM)对HKUST-1颗粒的尺寸和形貌进行了表征(图 1a).合成的HKUST-1是典型的八面体结构, 平均粒径约4 μm.此外, 通过紫外分光光度计对HKUST-1的紫外-可见吸收光谱进行表征(图 1b), HKUST-1在280 nm处有明显的吸收.这些结果与文献报道一致[42], 证明了HKUST-1的成功制备.
首先, 使用OPD作为典型的有机底物, 对HKUST-1类氧化酶活性进行了探究(图 2).如图 2a所示, 单独的OPD溶液无明显荧光信号.将HKUST-1加入到OPD溶液后, 该混合溶液在568 nm处产生明显的荧光, 说明HKUST-1可以催化OPD的氧化, 产生具有荧光的氧化产物oxOPD. HKUST-1所表现出的类氧化酶性质, 是因为它是铜基MOFs.据文献报道, 很多其他铜基材料具有氧化酶模拟物的性质, 例如类漆酶活性、类葡萄糖氧化酶活性及类细胞色素c氧化酶活性[43~45].为了进一步确定最佳反应条件, 对HKUST-1的浓度和与OPD反应的时间进行优化.如图 2a, 固定OPD的浓度, 随HKUST-1浓度增加, 荧光信号逐渐增加.根据荧光信号增加的趋势, 最终确定25 μg·mL－1的HKUST-1作为最终使用的材料浓度.如图 2b所示, 在OPD溶液中引入HKUST-1之后, 荧光信号随时间延长逐渐增强, 在2 h后达到平衡, 这表明HKUST-1催化OPD氧化的进程达到平衡.因此在后续实验中我们选择2 h作为HKUST-1和OPD的最佳孵育时间.
OPD: 500 μmol·L－1, HKUST-1: 25 μg·mL－1
据文献报道, PPi对铜离子具有很强的亲和力, PPi可以与铜离子配位, 抑制铜离子的催化能力[40].基于此, 我们推测PPi同样可以与HKUST-1表面未配位的铜离子配位, 对HKUST-1的催化性质产生影响.为了对此推测进行验证, 将HKUST-1与不同浓度的PPi进行预处理, 随后将预处理的HKUST-1与OPD溶液混合反应, 通过监测反应体系中荧光信号和紫外吸收来探究此反应过程.如图 3a和3c所示, 当没有PPi存在时, OPD在HKUST-1的催化作用下逐渐氧化生成具有荧光和紫外信号的氧化产物(oxOPD).在HKUST-1与PPi预处理后, 随PPi浓度增加, 检测体系荧光强度和紫外吸收均下降.这种现象可能是由于PPi和HKUST-1表面Cu2+配位, 导致催化位点封闭, HKUST-1的催化能力降低, OPD氧化产物减少, 从而导致荧光强度和紫外吸收下降.基于此, 我们设计了这个荧光紫外双模式PPi检测体系.如图 3a和3c中插图所示, 检测体系的荧光强度和紫外吸收随PPi浓度的增加而降低, 当PPi浓度大于120 μmol·L－1后, 信号强度降至最低且几乎不再发生变化.并且荧光和紫外信号在PPi浓度分别为10~120和10~100 μmol·L－1范围时呈线性降低(图 3b和3d).通过线性拟合, 得到荧光和紫外工作曲线的回归方程分别为y＝628.4－4.04x和y＝0.6984－0.00599x, 检测限分别为4.5和4.0 μmol·L－1.其中y分别为荧光强度和紫外吸收值, x为PPi浓度.
OPD: 500 μmol·L－1, HKUST-1: 25 μg·mL－1. Error bars of (b) and (d) were estimated from three replicate measurements
PPi具有抑制HKUST-1催化氧化OPD的能力, 同时, 碱性磷酸酶(ALP)可以催化PPi去磷酸化, 从而使HKUST-1催化活性恢复.基于此, 我们利用模拟酶-天然酶级联反应, 设计了一种以OPD为底物的荧光/紫外双模式检测平台用于ALP的高灵敏检测.如图 4a所示, 当ALP和PPi共同存在时, 检测溶液在568 nm处有明显荧光信号产生.这说明该条件下HKUST-1的催化活性恢复, OPD被有效催化氧化.而当不存在ALP, 只有PPi的条件下, 无明显荧光信号产生.该结果表明ALP可以催化PPi水解, 从而使HKUST-1的催化作用恢复, 荧光信号恢复.为了获得最优的ALP检测时间, 我们对ALP催化水解PPi的反应时间进行优化.如图 4b所示, 在反应前30 min内, 随着时间的延长, PPi水解程度增加, 荧光强度增加, 30 min后荧光强度基本不变, 这意味着该时间段ALP水解PPi反应基本达到平衡.因此选择30 min作为ALP和PPi的最佳孵育时间.
OPD: 500 μmol·L－1, PPi: 100 μmol·L－1, HKUST-1: 25 μg·mL－1, ALP: 4 nmol·L－1
为了进一步实现对ALP的检测, 基于之前优化的反应条件, 构建了基于模拟酶-天然酶级联放大的双模式检测系统.将100 μmol·L－1 PPi预处理的HKUST-1与不同浓度ALP反应, 通过监测体系中OPD氧化产物的荧光和紫外信号来检测ALP的浓度.如图 5a和5c所示, 随着ALP浓度增加, 检测溶液的荧光强度和紫外吸收逐渐升高.当ALP的浓度大于3.5 nmol·L－1时, 荧光强度和紫外吸收值达到峰值, 说明ALP将HKUST-1上起封闭作用的PPi几乎完全水解, HKUST-1的催化氧化能力几乎完全恢复.荧光强度和紫外信号(y)与ALP浓度(x)之间存在着良好的线性关系(图 5b, 5d).在最佳条件下, 荧光检测的线性范围为0.02~3.5 nmol·L－1, 线性回归方程为y＝155.62+98.4x, 基于酶级联反应对信号的有效放大, 检测限低至0.0078 nmol·L－1.紫外检测的线性范围为0.04~3.5 nmol·L－1, 回归方程为y＝0.1063+0.1212x, 检测限为0.039 nmol·L－1.结果表明该方法对ALP的检测具有出色的灵敏度和可靠性, 检测效果与现有文献报道相当[15, 46].
OPD: 500 μmol·L－1, PPi: 100 μmol·L－1, HKUST-1: 25 μg·mL－1
考虑到该检测体系对ALP有出色的响应性, 我们进一步将该体系用于ALP抑制剂筛选潜能的研究.选择磷酸二氢钾(KH2PO4)作为ALP的模型抑制剂, 以探究该分析方法筛选ALP抑制剂的能力.当ALP的活性被KH2PO4抑制时, PPi不能被ALP水解, 荧光强度不再恢复.通过对这一过程的荧光进行监测得出KH2PO4对ALP抑制效率.如图 6a所示, 随着KH2PO4浓度从0增大到20 mmol·L－1, 抑制效率逐渐增加.将酶活性降低50%所需的抑制剂浓度(IC50值)为1.522 mmol·L－1.该结果表明该检测体系可以用于筛选潜在的ALP抑制剂.
OPD: 500 μmol·L－1, PPi: 100 μmol·L－1, HKUST-1: 25 μg·mL－1, ALP: 4 nmol·L－1
模拟酶的重复利用性是其在生物应用中的重要问题之一.为了研究该体系中HKUST-1的重复利用性, 将检测后的反应液进行离心, 分离HKUST-1并洗涤, 然后重新加入到新的反应体系中孵育, 再次检测反应溶液的荧光.如图 6b所示, HKUST-1在重复利用4次后催化活性仍无明显下降, 显示出极好的重复利用性.
接下来我们对该检测体系对PPi和ALP的选择性分别进行了验证, 如图 7a所示, 该体系只对PPi有响应, 除PPi以外其他阴离子的存在对PPi的检测几乎没有影响, 表明该体系对PPi的检测具有良好的选择性和抗干扰能力.值得注意的是, 即使含多个磷酸根的分子如ATP也没有对PPi的检测产生干扰.这可能是由于ATP等核苷三磷酸含有碱基和戊糖, 与焦磷酸相比, 具有更大的空间位阻和相对较小的阴离子电荷密度, 从而导致其与Cu2+的配位作用比PPi弱很多[47].此外, 我们通过利用其他常见的生物分子, 包括牛血清白蛋白(BSA)、过氧化物酶(peroxidase)、过氧化氢酶(catalase)、葡萄糖氧化酶(GOx)、乙酰胆碱酯酶(AChE), 评估了该检测体系对ALP的选择性.如图 7b所示, 只有在ALP存在下才会导致荧光强度增加, 而其它生物分子产生的信号接近系统的背景荧光, 几乎可以忽略不计.结果表明该检测系统对ALP具有较高的选择性
The final concentrations of PPi and other anions were 100 μmol·L－1. The final concentrations of ALP and other biomolecules were 4 nmol·L－1
为了评估所提出的方法在实际样品检测中的可行性, 将开发的方法应用于人血清样品中ALP的测定.将不同浓度的ALP掺入稀释的人血清样品(体积分数为0.1%)中, 并根据标准曲线进行计算.该检测方法的重复性和准确性较好, 相对标准偏差小于8.21%, 回收率在91.8%和103.0%之间(表 1).这些结果证明了该方法在生物样品分析中的潜在应用.
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| 样品 | 加入ALP/(nmol·L－1) | 测定ALP/(nmol·L－1) | 回收率/% | 相对标准偏差/% |
| 1 | 0.01 | 0.0102 | 102.0 | 5.54 |
| 2 | 0.10 | 0.0918 | 91.8 | 5.74 |
| 3 | 0.50 | 0.5152 | 103.0 | 7.94 |
| 4 | 1.00 | 1.0010 | 100.1 | 8.21 |
综上所述, 本工作发现HKUST-1可以作为氧化酶模拟物, 催化OPD的氧化.基于PPi对HKUST-1催化位点的封闭及ALP将PPi水解后HKUST-1催化活性的恢复, 建立了荧光/紫外双模式传感平台用于两种重要生物标志物ALP与PPi的灵敏检测.由于模拟酶-天然酶的级联催化放大效应及双模式信号输出, 该体系具有灵敏度高、检测限低、准确度和可靠性高等优势, 能够实现人血清样品中ALP的超灵敏分析, 并可用于ALP抑制剂的筛选.这是第一次将模拟酶-天然酶级联放大用于双模式的生物分析.此外, 作为氧化酶模拟物, HKUST-1具有成本低、易于制备和可重复利用的特点, 该检测平台拓宽了具有类酶性质的微纳材料在生物催化领域的应用, 为深入理解酶催化体系及其在生物传感领域的应用提供了一种新的策略.
实验中的扫描电子显微镜图由蔡司高分辨扫描电镜(Zeiss Merlin Compact)表征, 荧光光谱由安捷伦荧光光度计记录, 紫外光谱由岛津UV-2600型紫外可见分光光度计记录.
硝酸铜(Cu(NO3)2·3H2O)、1, 3, 5-苯三甲酸(H3BTC)、焦磷酸钠(Na4P2O7·10H2O)均购自上海国药集团化学试剂有限公司.邻苯二胺(OPD)、碱性磷酸酶(ALP)、磷酸二氢钾(KH2PO4)购自美国西格玛奥德里奇公司.以上试剂在使用前均未做任何处理.
根据文献报道的方法合成HKUST-1.分别称取0.126 g的H3BTC和0.07 g Cu(NO3)2·3H2O各溶于6 mL超纯水中, 然后将H3BTC溶液加入Cu(NO3)2·3H2O溶液中, 在室温下快速搅拌2 h.将产物离心12 min, 并用乙醇洗涤三遍以除去未反应的H3BTC, 最后, 将洗涤后的产物分散到乙醇中备用.
为了评估HKUST-1对OPD氧化的影响, 取10 μL不同浓度的HKUST-1溶液, 20 μL 5 mmol·L－1的OPD溶液和170 μL 10 mmol·L－1的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)于1.5 mL离心管中, 在37 ℃下孵育2 h, 反应结束后取出进行后续的荧光和紫外吸收测定.此外, 在孵育时间优化实验中, HKUST-1浓度为25 μg·mL－1, 每隔10~20 min测量一次荧光.
在PPi的荧光和紫外检测中, 先将10 μL不同浓度的PPi溶液和HKUST-1溶液(25 μg·mL－1)在37 ℃下预孵育30 min, 以使PPi和HKUST-1充分结合.然后再和OPD (500 μmol·L－1)孵育进行后续荧光和紫外吸收测试.在选择性测试中, 通过使用其他常见的阴离子代替PPi评估该检测平台对PPi的选择性.文中检测限计算方法为:检测限＝3×空白信号标准差/灵敏度.这里空白信号标准差是在一定时间内20~30次空白测定后统计处理得到的, 灵敏度为校准灵敏度, 即测定浓度范围内校准曲线斜率.
为了检测ALP, 先将不同浓度的ALP分别加入PPi溶液(100 μmol·L－1)中, 并在37 ℃下孵育30 min.其他后续反应步骤与检测PPi相同.在选择性测试中, 通过使用其他常见的生物分子代替ALP评估该检测平台对ALP的选择性.实验中使用ALP酶活性为1 nmol·L－1 ALP对应0.53 U·mL－1.
将ALP (4 nmol·L－1)和不同浓度的KH2PO4混合并孵育30 min.将混合物加入PPi溶液(100 μmol·L－1)中.并根据ALP检测步骤进行了后续实验.为了评估HKUST-1是否可以重复利用, 将检测液离心取沉淀, 然后加入新鲜的OPD溶液重新孵育进行下一次测试.
将不同浓度的ALP加标到稀释的人血清样品(体积分数为0.1%)中.血清中ALP的检测方法与缓冲液中的相同.
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图式 1 基于模拟酶-天然酶级联放大反应的荧光/紫外双模式ALP和PPi检测示意图
Scheme 1 Illustration of fluorescent and UV-vis dual-mode detection of ALP and PPi by designing mimic enzyme-natural enzyme cascade reactions
图 1 (a) HKUST-1的扫描电镜图和(b) HKUST-1的紫外-可见吸收光谱图
Figure 1 (a) SEM image and (b) UV-vis absorption spectra of HKUST-1
图 2 (a) 不同浓度的HKUST-1对OPD催化氧化后体系在568 nm处荧光强度的变化和(b) HKUST-1催化OPD反应体系荧光随时间变化曲线
Figure 2 (a) Fluorescence intensity changes of the system at 568 nm after adding different concentrations of HKUST-1 and (b) time-dependent fluorescence intensity changes of the system in the presence of HKUST-1
OPD: 500 μmol·L－1, HKUST-1: 25 μg·mL－1
图 3 (a) 不同浓度PPi存在下(0~200 μmol·L－1)体系的荧光光谱(插图是检测体系在568 nm处的荧光强度与PPi浓度的关系曲线), (b)检测体系在568 nm处的荧光强度与PPi浓度的线性拟合图, (c)不同浓度PPi存在下(0~200 μmol·L－1)体系的紫外吸收谱图(插图是检测体系在416 nm处的紫外吸收值与PPi浓度的关系曲线)和(d)检测体系在416 nm处的紫外吸收值与PPi浓度的线性拟合图
Figure 3 (a) Fluorescence evolution of the system upon addition of various concentrations of PPi (from 0 to 200 μmol·L－1) (Inset: the plots of fluorescent intensity at 568 nm versus PPi concentration), (b) the linearity of fluorescence intensity with respect to PPi concentrations, (c) the absorbance evolution of the system upon the addition of various concentrations of PPi (from 0 to 200 μmol·L－1) (Inset: the plots of UV-vis absorption at 416 nm versus PPi concentration) and (d) the linearity of UV-vis absorption at 416 nm with respect to PPi concentrations
OPD: 500 μmol·L－1, HKUST-1: 25 μg·mL－1. Error bars of (b) and (d) were estimated from three replicate measurements
图 4 (a) ALP添加前后系统的荧光变化和(b)加入ALP后体系的时间依赖性荧光变化
Figure 4 (a) Fluorescence spectra of the system in the absence and presence of ALP and (b) time-dependent fluorescence intensity changes of the system upon adding ALP
OPD: 500 μmol·L－1, PPi: 100 μmol·L－1, HKUST-1: 25 μg·mL－1, ALP: 4 nmol·L－1
图 5 (a) 不同浓度ALP存在下(0~5 nmol·L－1)体系的荧光光谱(插图是体系在568 nm处的荧光强度与ALP浓度的关系曲线), (b)检测体系在568 nm处的荧光强度与ALP浓度的线性拟合图, (c)不同浓度ALP存在下(0~5 nmol·L－1)体系的紫外吸收谱图(插图是体系在416 nm处的紫外吸收与ALP浓度的关系曲线)和(d)检测体系在416 nm处的紫外吸收值与PPi浓度的线性拟合图
Figure 5 (a) Fluorescence evolution of the system upon the addition of various concentrations of ALP (0~5 nmol·L－1) (Inset: the plots of fluorescent intensity at 568 nm versus ALP concentration), (b) the linearity of fluorescence intensity with respect to ALP concentrations. Error bars were estimated from three replicate measurements, (c) the absorbance evolution of the system upon the addition of various concentrations of ALP (from 0 to 5 nmol·L－1) (Inset: the plots of UV-vis absorption at 416 nm versus ALP concentration) and (d) the linearity of UV-vis absorption at 416 nm with respect to ALP concentrations. Error bars were estimated from three replicate measurements
OPD: 500 μmol·L－1, PPi: 100 μmol·L－1, HKUST-1: 25 μg·mL－1
图 6 (a) 不同浓度的KH2PO4对该体系ALP活性的抑制效率和(b)模拟酶HKUST-1重复利用率的考察
Figure 6 (a) Inhibition efficiency of different concentrations of KH2PO4 on the ALP activity of the system and (b) study of recycling rate of the mimic enzyme HKUST-1
OPD: 500 μmol·L－1, PPi: 100 μmol·L－1, HKUST-1: 25 μg·mL－1, ALP: 4 nmol·L－1
图 7 该检测体系对(a) PPi和(b) ALP的选择性
Figure 7 Selectivity of the established assay toward (a) PPi and (b) ALP
The final concentrations of PPi and other anions were 100 μmol·L－1. The final concentrations of ALP and other biomolecules were 4 nmol·L－1
表 1 该方法对人血清样品中ALP的检测
Table 1. Determination of ALP in spiked human serum by the proposed method
| 样品 | 加入ALP/(nmol·L－1) | 测定ALP/(nmol·L－1) | 回收率/% | 相对标准偏差/% |
| 1 | 0.01 | 0.0102 | 102.0 | 5.54 |
| 2 | 0.10 | 0.0918 | 91.8 | 5.74 |
| 3 | 0.50 | 0.5152 | 103.0 | 7.94 |
| 4 | 1.00 | 1.0010 | 100.1 | 8.21 |
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