随着生命科学的深入发展, 光学成像因其具有成像速度快、检测灵敏度高、样品制备简单及成本低等优点越来越广泛用于生物医学领域[1~13].然而, 传统光学成像受到光学衍射极限的限制, 只能获得衍射极限之上的目标结构的清晰成像(＞200 nm)[14], 对于尺寸大小在衍射极限之下的目标结构, 尤其是细胞内发挥重要生物学功能的细胞器、亚细胞器甚至更小尺寸生物目标结构, 传统光学成像则不能获得高清晰的结构成像.近年发展起来的超分辨光学显微成像技术可以突破光学衍射极限的限制, 成像分辨率高达20 nm, 实现目标结构的超分辨成像, 有望获得单细胞内微小目标结构的超精细成像[15~18].
超分辨成像技术的出现为成功研究衍射极限之下的生物结构提供了可能性[19~24].相比其他超分辨成像技术, 基于单分子定位超分辨成像(Single molecule localization microscopy, SMLM)的随机光学重构超分辨成像(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)具有显著的优势.根据其技术原理, 主要将特殊结构的五甲川菁染料(Alexa647)标记到目标结构上后, 在激光照射下发生稀疏的随机光致闪烁, 使用EMCCD相机采集数千乃至上万帧图像, 分别进行定位后, 将所有图像的定位信息进行叠加重构出目标结构的超分辨图像, 利用该技术可以获得20 nm的细胞内超高分辨成像结果. STORM超分辨成像原理上, 满足光致闪烁的荧光染料与超分辨重构软件是两个关键的步骤.其中, 具有特定光物理性能的荧光染料起着至关重要的作用. Alexa647荧光染料是目前应用最为成熟的STORM成像探针, 大部分STORM荧光探针的设计都是在Alexa647荧光染料的结构上进行修饰改造的.此类荧光染料在进行STORM成像中, 需要外加缓冲体系(葡萄糖氧化酶和过氧化氢还原酶体系)、含巯基试剂, 巯基试剂与染料(Alexa647)之间的光致加成反应淬灭染料荧光, 以及巯基试剂的随机消除恢复染料结构而恢复荧光发射, 产生随机的光致闪烁信号.由于外加缓冲体系及标记方法无法在活细胞环境中实现, 仅能获得固定细胞的超分辨成像[25~28].近年报道的罗丹明类荧光染料也可发生分子内可逆开关环, 在激光照射下可发生光致闪烁, 进行活细胞的超分辨成像, 但是需要两束激光同时照射实现闪烁, 短波长激光对细胞光毒性较大[29].开发不需要外加成像缓冲体系单束激光照射即可实现光致闪烁的新型STORM超分辨成像的荧光染料, 将有利于活细胞STORM超分辨成像, 有利于降低STORM超分辨成像的生物应用门槛, 对促进生物医学的发展具有重大意义.
基于上述考虑, 本研究工作主要针对五甲川菁染料的光致闪烁机理, 开发了一种不需要外加缓冲体系的新型五甲川菁染料.分子结构中, 将巯基引入分子内, 在一定条件下发生分子内可逆开/关环反应, 产生光致闪烁现象.进一步研究了其光致闪烁物理性能及细胞内的定位信息, 在不同条件下进行超分辨重构, 实现STORM超分辨成像.
Alexa647菁染料是目前STORM超分辨成像广泛使用的商用荧光染料, 但在成像过程中, 需要使用巯基试剂及葡萄糖氧化酶与过氧化氢还原酶等缓冲体系辅助荧光染料的光致闪烁.在原理上, 巯基试剂在激光照射染料下, 分子吸收光子受到激发后, 巯基进攻染料分子共轭链上的β-C破坏染料的共轭, 淬灭荧光, 在缓冲体系中, 巯基又能可逆地从甲川链上消除, 恢复染料分子的共轭结构, 使染料发射出荧光, 这个过程是随机的, 产生随机光致闪烁, 实现超分辨成像, 但是由于需要外加大分子量的酶及大量巯基试剂, 无法在活细胞中进行STORM成像, 尤其是进行活细胞器的STORM超分辨成像.
本研究工作设计了不需要外加缓冲体系及巯基试剂就可以发生光致闪烁的新型五甲川菁染料探针, 用于活细胞STORM超分辨成像.在分子结构设计上(图 1a所示), 参考Miki等[30]在五甲川菁染料的一端吲哚啉氮位上引入巯基, 可自发进攻邻位的碳原子, 形成五元环状结构淬灭荧光.在染料分子的吲哚季铵盐的N位上引入巯基, 巯基可以在一定条件下发生分子内的闭环淬灭染料荧光, 同时也可以逆向开环恢复共轭发射荧光, 同时在菁染料另一端的吲哚环上连接羧酸基团调控整个共轭链的缺电子性, 利于巯基亲核进攻闭环及消除开环, 哌嗪及叔丁氧羰基(tert-Butyloxycarboryl, tBOC)部分可调整染料分子的亲水亲脂性, 增加染料的活细胞内线粒体的定位性, 新型五甲川菁染料的制备及结构表征见实验部分.
为了研究新型染料的相关光物理性能, 首先研究了染料在溶液中的光物理性质, 主要测试吸收、发射光谱, 饱和激光功率、单帧闪烁时间、占空比及光漂白存活比例等相关参数.
首先, 从分子结构及实验结果可以知道, 染料分子属于小分子探针, 在有机溶剂中可以完全溶解, 针对本实验将探针溶解于DMSO中制备成母液保存, 然后将探针溶液稀释于不同溶剂中进行溶液测试, 测试浓度均在微摩尔量级, 因此探针在实验中不存在溶解性问题.五甲川菁染料是一种比较传统的荧光染料, 其吸收、发射波长在λabs＝655 nm, λem＝670 nm受溶剂极性影响较小, 摩尔消光系数在1.0×105左右, 根据测试结果(表 1)发现探针在二氯甲烷, DMSO中, 摩尔消光系数较在质子性溶剂(乙醇, 甲醇)中小, 可能是由于染料分子在非质子性溶剂中发生分子内闭环, 导致部分分子在633 nm没有吸收峰.由于染料分子在极性溶剂中荧光量子产率比弱极性溶剂中低, 荧光寿命也较短.在测试染料在不同溶剂中光谱性质后, 进一步研究了染料在不同pH环境中的光谱变化, 如图 1b和图 1c所示, 探针置于pH分别为8.0和5.8的溶液中, 其光谱表现出明显不同.当pH 8.0时, 探针在650 nm的吸收峰比pH 5.8时吸光度降低, 同时, 在375 nm的吸收峰升高; 另外, 从荧光发射光谱图中可以看出, 相比pH 5.8的溶液, 探针在pH 8.0的溶液中荧光淬灭.这些变化表明了探针在碱性溶液中处于闭环状态, 验证了探针设计的正确性(图 1a).
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| 摩尔吸光系数a(×105) | 荧光量子产率b | 荧光寿命c/ns | |
| 二氯甲烷 | 0.96 | 0.134 | 0.53 |
| 二甲基亚砜 | 0.91 | 0.097 | 0.47 |
| 乙醇 | 1.21 | 0.083 | 0.60 |
| 甲醇 | 1.15 | 0.075 | 0.61 |
| 水 | 0.72 | 0.011 | 0.58 |
| a摩尔消光系数是在控制探针吸光度在0.3~0.5范围内测试; b荧光量子产率是选用罗丹明B作为参比染料进行测试计算(Φ＝0.97); c荧光寿命是在课题组DCS-120荧光寿命系统上测试. | |||
五甲川菁染料的STORM光致闪烁的研究大多基于外加缓冲体系的测试.本研究工作中, 对设计的五甲川菁染料不需要外加缓冲液, 将其稀释的溶液匀旋涂在盖玻片上后, 在单束激光(656 nm)宽场照明下, 激光功率密度测试为200 W·cm-2, 使用较低激光功率, 探针分子很快被转入暗态, 产生显著的荧光闪烁, 图 2a所示, 探针分子在前60 s的照射过程中迅速转入暗态, 染料没有发生光致漂白, 首先所使用激光功率密度比文献报道(＞1 kW·cm-2)低很多; 其次, 在随后的照射中, 盖玻片上的染料分子保持着长时间的系数闪烁, 可采集30000帧以上的图像.从选取的发光区域的荧光闪烁可以看出探针在600 s内发生高频率的闪烁, 从图 2b中可知最高闪烁光子数超过2000, 表明新开发光学探针在直接激光照射下即可产生显著的光致闪烁, 有望用于STORM超分辨成像.
为了进一步验证新开发五甲川菁染料(8)的STORM超分辨的适用性, 我们对其光物理性质进行了深入的研究, 包括其吸收发射光谱、饱和激发激光功率、单帧闪烁时间及占空比与探针漂白残留分数.首先从探针的光谱中可以发现其最大吸收、发射波长分别位于655与675 nm (图 3a), 因此本实验中使用656 nm连续激光照射染料, 使用滤光片将680 nm以下信号滤掉, 收集长波长的光子.其次研究了在656 nm波长激光照射下, 使用不同激光功率测试探针的饱和荧光发射强度, 采集几个发光区域的光子数, 改变激光功率测试发光光子数, 根据光子数与激光功率的关系, 发现该探针的荧光发射在较低激光功率密度(约400 W·cm-2, 图 3b)下达到饱和, 说明探针可以在低功率激光下发生高效荧光发射; 另外根据测试结果计算探针分子的平均闪烁时间约100 ms (图 3c), 与文献报道的五甲川菁染料的单帧闪烁时间类似, 可以以此速率设置EMCCD的采样频率[31].同时通过计算探针的占空比进一步验证其STORM成像的可能性, 通过分析30000帧同一区域内发光分子的发光情况, 从图 3d中得到该探针分子的占空比为0.00092, 适合进行STORM超分辨成像, 略大于文献报道的Alexa647的占空比(0.0005), 可以推测在进行光致闪烁测试时, 每帧图像中处于荧光态的密度较大, 适合进行活细胞图像测试.同时考察了探针分子的耐光漂白情况, 从图中可知探针分子在656 nm激光连续照射750 s后, 其漂白残余比例仍＞20%.从以上各参数的测试可知, 新开发的探针适合直接STORM超分辨成像应用, 不需要使用缓冲液即可产生光致闪烁, 有望进行活细胞的STORM超分辨成像.
为了确定荧光探针8进入活细胞后, 在细胞内的优先富集区域及定位对其分布进行了活细胞的共定位实验, 探针(1 μmol·L-1)与HeLa活细胞进行共孵育(15 min)后, 然后分别与商品化的线粒体、内质网及溶酶体定位试剂进行了共培养, 然后在尼康激光共聚焦显微成像系统上进行图像采集.如图 4所示, 对于探针使用635 nm激发, 大于650 nm波长范围进行图像采集; 对于商品化试剂使用488 nm激发, 探测范围500~560 nm.从共定位实验结果中可以看出, 探针与线粒体的共定位最好(Pr＝0.87), 可以判断探针在进入活细胞后主要定位于线粒体上.
为了验证设计的新型Cy5荧光染料(8)进行STORM超分辨成像的可能性, 首先将探针(1 μmol·L-1)与HeLa细胞共培养30 min后, 在课题组自主搭建的STORM超分辨光学系统上进行了测试.将制备好的细胞样品放置于样品台上, 不外加缓冲体系, 使用656 nm的连续激光进行宽场照明, 测试了探针在细胞内的闪烁, 并用EMCCD进行采集, 采样频率设在60 Hz.结果表明, 探针在细胞内主要定位于线粒体上, 并且表现出理想闪烁, 可用于细胞内的STORM成像.
在进行图像重构之前, 需要先将原始图像输入ImageJ中进行预处理, 将图像中的噪声与不需要的信号点去除, 然后将得到的图像输入文献报道的Falcon算法进行重构处理, 研究了不同实验条件下的超分辨重构图像[31].采用不同帧数的图像进行重构, 如图 5所示, a, e, i是图像前50, 100, 200帧的平均宽场图像, b, f, j是使用前50, 100, 200帧重构的STORM超分辨图像.将荧光探针在活细胞的宽场成像图与STORM超分辨图中的选定区域进行局部放大后, 对其发光区域进行测试获得强度分布, 进行高斯拟合后, 从后面的图中可知, 图像的分辨率增加, 相比之下, STORM超分辨成像的分辨率显著提升, 但是重构图像的帧数越多会导致定位精度下降, 时间分辨率也会下降, 因此减少重构帧数有利于提高定位精度与时间分辨率.如图c, d; g, h; k, l中线粒体局部放大图, 从图中可以看出, 宽场图中观察不到线粒体的精细结构, 而STORM重构之后, 则获得了清晰线粒体膜结构轮廓的超分辨成像, 可以发现荧光探针主要标记在线粒体的外膜上, 根据高斯拟合曲线可以发现成像分辨率从740 nm提升至129 nm.考虑到分辨率与定位精确的相互制约, 可以选择100帧图像进行重构, 获得超分辨图像结构比较连贯同时也具有较高空间分辨率.
在上述实验条件下, 进一步将探针(8)用于活细胞线粒体的STORM超分辨成像研究, 如图 6所示, 将探针与活HeLa细胞进行共培养后, 不用外加缓冲液体系, 将细胞样品固定于样品架上, 使用656 nm的稳态激光照射, 由于分子内自发可逆的开关环反应, 产生理想的荧光闪烁, 使用EMCCD进行图像采集后使用前述的重构条件进行图像分析获得了活细胞内线粒体的STORM超分辨成像, 从图 6中可以发现由于光的衍射效应, 宽场成像无法获取线粒体的精细结构图像(图a, c), STORM成像中则能清楚地观察到线粒体的结构(图b, d), 而线粒体膜结构的尺寸精度从409 nm提升到110 nm, 这证明本工作开发的新型Cy5菁染料探针可以发生分子内的开关环, 产生光致闪烁, 不需要使用成像缓冲液即可进行超分辨成像, 而且成像的空间分辨率明显得到提升, 有望将该类荧光探针用于活细胞的动态过程的STORM超分辨成像研究, 为生物医学成像应用提供全新的有力工具.
在获得探针(8)在活细胞线粒体的超分辨成像后, 为了进一步研究探针对细胞的毒性, 我们测试了探针的活细胞毒性.分别使用不同浓度的探针(0, 0.5, 1, 3, 5, 10 μmol·L-1)与HeLa细胞共培养24 h后, 使用CCK-8方法在酶标仪上进行紫外吸收测试, 根据公式计算获得HeLa细胞的存活率, 如图 7所示, 当探针浓度为10 μmol·L-1时, 与细胞培养后, 测试获得细胞存活率＞90%, 在实验中使用的探针浓度1 μmol·L-1, 对活细胞的毒性会更低, 适合用于活细胞成像探针.
本研究工作提出了一种新型可用于活细胞的STORM超分辨成像探针的设计策略, 相比Alexa647荧光染料, 不需要外加成像缓冲试剂即可进行STORM超分辨成像.此类Cy5菁染料分子的设计是基于分子内可逆的开/闭环反应机理, 在不需要外加氧化还原体系, 在低功率密度的激光照射下就产生显著的光致闪烁, 为STORM超分辨成像活细胞动态过程提供可能性.通过对该新型Cy5荧光染料的光物理性能测试证明染料适合用于STORM成像, 将探针与活细胞共培养后, 探针定位于线粒体上, 在自主搭建的STORM光学系统上进行测试, 并使用Falcon算法将采集到的数据进行重构分析获得线粒体的STORM超分辨成像结构.从实验条件优化看, 在EMCCD (60 Hz)的采样频率下, 使用100帧图像就可重构出较好的超分辨图像, 成功获得活细胞线粒体膜结构的超分辨成像, 为生物医学研究相关疾病的发生、发展及寻找治疗方法提供了有力的研究工具.
实验中使用的化学试剂均从国内阿拉丁、麦克林等化学试剂公司购买分析纯试剂, 其中用于质谱分析的溶剂如乙腈、甲醇属于色谱纯级别, 测试用溶剂均为色谱纯级别.探针的结构表征通过Bruker核磁共振谱仪及岛津液质联用质谱仪; Varian生产紫外吸收光谱仪, Horiba生产荧光光谱仪.目标染料探针(8)的合成制备工艺路线如图式 1所示.
化合物1 (3.66 g, 15 mmol), 2, 3, 3-三甲基-3H-吲哚啉(2.38 g, 15 mmol)混合于干燥乙腈中(30 mL), 加热回流过夜后, 冷却至室温, 旋转蒸发除掉大部分溶剂, 向残余物中加入30 mL无水乙醚产生大量的粘稠紫色油状物.小心将液体倒出后, 使用少量的二氯甲烷溶解, 再次得到紫色油状物, 重复上述操作.使用旋转蒸发仪除掉溶剂干燥得到油状粗产物(2.4 g, 产率40%), 干燥保存待下一步反应使用.
将化合物2 (1.2 g, 3 mmol)与丙二醛缩二苯胺盐酸盐(0.78 g, 3 mmol)溶解于醋酸与醋酸酐混合溶剂中[V(醋酸):V(醋酸酐)＝1:1, 15 mL], 加热回流1 h, 然后冷却至室温, 旋转蒸发除掉大部分溶剂后, 向残余物中加入30 mL干燥乙醚, 收集固体残余物, 通过柱色谱层析纯化, 旋转蒸发除掉溶剂, 干燥得到暗黄色固体(0.86 g, 产率50%), 保存留待下一步反应使用.
将化合物3 (0.574 g, 1 mmol)与化合物4 (0.345 g, 1 mmol)溶于乙醇(10 mL)中, 加入三乙胺(1 mL)后, TLC监测反应进程, 加热回流2 h直到其中之一原料消耗殆尽, 停止加热, 冷却至室温, 旋转蒸发除掉溶剂得到残余固体通过硅胶柱色谱分离纯化, 使用二氯甲烷-甲醇混合溶剂做流动相, 减压蒸发溶剂后得到暗蓝色固体(0.4 g, 产率60%). 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 12.88 (s, 1H), 8.38 (dd, J＝20.6, 13.0 Hz, 2H), 8.11 (d, J＝1.4 Hz, 1H), 7.96 (dd, J＝8.4, 1.5 Hz, 1H), 7.67 (d, J＝7.3 Hz, 1H), 7.43 (dd, J＝18.4, 8.1 Hz, 3H), 7.29 (dd, J＝11.2, 4.1 Hz, 1H), 6.60 (t, J＝12.4 Hz, 1H), 6.47 (d, J＝14.0 Hz, 1H), 6.23 (d, J＝13.5 Hz, 1H), 4.24 (t, J＝6.6 Hz, 2H), 3.56 (s, 3H), 3.00~2.89 (m, 2H), 2.31 (s, 3H), 1.93 (dd, J＝13.9, 6.7 Hz, 2H), 1.69 (d, J＝3.8 Hz, 12H); 13C NMR (75 MHz, DMSO) δ: 195.61, 175.16, 172.69, 167.50, 155.97, 154.07, 147.14, 142.20, 142.01, 141.28, 130.95, 129.00, 126.70, 126.56, 126.51, 126.00, 123.74, 123.09, 112.12, 110.61, 105.35, 103.65, 49.98, 48.60, 43.39, 31.50, 31.08, 28.05, 27.53, 27.33, 26.04, 23.27.化学式: C32H37- N2O3S. ESI-MS (positive) m/z:计算式[M]+ 529.25, 发现529.
将化合物5 (0.32 g, 0.5 mmol), 1-N-boc-哌嗪(0.18 g, 1 mmol)及三乙胺(0.14 mL, 1 mmol)溶于干燥二氯甲烷中(20 mL), 向其中加入四甲基脲六氟磷酸酯(HATU) (0.38 g, 1 mmol).混合液在室温下继续搅拌反应3 h, 然后用0.1 mol·L-1 HCl与盐水洗涤反应液, 分液收集有机相干燥后, 旋转蒸发除掉有机溶剂, 通过硅胶柱色谱分离得到蓝色固体产物(0.33 g, 产率80%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.96 (dd, J＝13.3, 3.3 Hz, 2H), 7.48~7.36 (m, 4H), 7.28 (d, J＝2.7 Hz, 1H), 7.18 (d, J＝8.1 Hz, 1H), 7.12 (d, J＝8.7 Hz, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.27 (d, J＝13.7 Hz, 1H), 6.13 (d, J＝13.4 Hz, 1H), 4.12 (dd, J＝9.8, 4.9 Hz, 2H), 3.58 (s, 7H), 3.48 (s, 4H), 2.99 (t, J＝7.1 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H), 1.71 (d, J＝9.3 Hz, 12H), 1.47 (s, 9H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ: 195.57, 195.55, 174.37, 172.69, 169.99, 154.58, 154.54, 153.20, 144.31, 141.64, 141.45, 141.17, 131.38, 128.82, 128.23, 126.75, 125.90, 122.45, 121.71, 110.92, 109.91, 104.57, 103.59, 80.42, 49.84, 48.97, 43.22, 31.36, 30.70, 28.36, 27.88, 27.76, 25.98.化学式: C41H53N4O4S. ESI-MS (positive) m/z:计算式[M]+ 697.38, 发现697.
将化合物6 (0.1 g, 0.12 mmol)溶解于5 mL甲醇中, 加入K2CO3 (60 mg, 0.4 mmol)后, 将混合液室温下搅拌30 min, 使用液相-质谱监测反应进度.在初始原料消耗完后停止反应, 使用二氯甲烷(20 mL)稀释反应液, 然后使用1 mol·L-1的HCl洗涤反应液, 然后使用分液漏斗分液, 收集蓝色液相溶液.使用无水硫酸钠干燥有机相, 旋转蒸发除掉溶剂得到蓝色固体化合物8 (80 mg, 产率99%).为了得到中间体化合物7, 前面有机相溶液使用饱和NaHCO3溶液洗涤, 分离有机相, 使用无水硫酸钠干燥后, 过滤除掉结晶硫酸钠, 旋转蒸发得到黄绿色固体7.化合物Fluo-SH的核磁谱中混有少量开环形式的染料, 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.31 (t, J＝8 Hz, 2H), 7.07 (q, J＝8.0 Hz, 2H), 6.98 (dd, J＝8.8, 8.0 Hz, 1H), 6.72 (t, J＝12 Hz, 2H), 6.63 (d, J＝12 Hz, 1H), 6.26 (dd, J＝18.4, 8.1 Hz, 3H), 7.29 (dd, J＝11.2, 4.1 Hz, 1H), 6.60 (t, J＝16 Hz, 1H), 5.76 (d, J＝16 Hz, 1H), 5.51 (d, J＝16 Hz, 1H), 4.01~4.08 (m, 1H), 3.53~3.61 (m, 4H), 3.38~3.47 (m, 4H), 3.19 (s, 3H), 2.79~2.91 (m, 1H), 2.33~2.46 (m, 1H), 1.62 (s, 3H), 1.61 (s, 3H), 1.45 (s, 12H), 1.27 (s, 3H), 10.95 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 172.8, 168.9, 154.7, 149.8, 145.1, 140.7, 133.9, 132.5, 131.0, 128.9, 127.1, 126.5, 125.3, 122.0, 117.8, 109.7, 107.6, 104.8, 95.8, 79.8, 55.6, 53.8, 50.9, 50.4, 49.8, 33.0, 28.4, 26.8, 21.1.目标化合物8化学式: C39H51- N4O3S. ESI-MS (positive) m/z:计算式[M]+ 655.37, 发现峰655.0 (如图 8所示).
将HeLa细胞复苏传代好后, 待其生长到合适的密度后, 将探针母液(1 mmol·L-1)加入细胞培养液中, 使得培养基中探针的最终浓度为1 μmol·L-1, 或者将相应浓度的细胞复染剂加入培养皿中, 然后将细胞样品置于培养箱中孵育30 min后, 将细胞样品取出, 倒掉培养基, 用PBS缓冲液洗涤3~4次后, 加入培养基后, 将细胞样品放置于显微镜上观察进行复染实验或者超分辨成像测试.
将探针母液使用无水乙醇进行稀释, 得到母液浓度不超过50 nmol·L-1, 将样品涂抹在盖玻片上, 然后将样品固定在匀胶机上进行旋转制样, 保证样品是稀疏的分布于玻璃片上, 然后将盖破片盖在载玻片上, 使用指甲油将盖玻片密封在载玻片上后, 将制备的样品放置于实验室自主搭建的STORM超分辨成像样品支架上, 在显微镜下找到焦面, 调整激光光源, 控制衰减片, 使用不同激光功率照射样品, 测试染料在玻璃片上的光致闪烁性质.
将探针与细胞共培养好后, 将样品放置于STORM成像活细胞工作站中, 设置好实验条件后, 将656 nm红色连续激光通过光路后照射到细胞样品上(激光功率密度100 W·cm-2)使用油镜(NA＝1.45)观测样品及相机采样频率(60 Hz), 激光通过阶跃式衰减片进行不同程度衰减获得不同的激光功率, 采集探针分子在HeLa活细胞内的闪烁数据, 保存所有闪烁帧数, 直到探针完全光漂白.
将采集到的玻璃片上闪烁数据及活细胞内闪烁数据首先使用ImageJ软件打开, 进行初步结果分析, 对背景噪声及不需要的信号进行过滤, 然后将获得的结果导入文献报道的Falcon重构算法中, 去卷积运算后进行单分子定位, 获得超分辨的结构图像.
使用HeLa细胞进行细胞毒性试验, 用CCK8法测定细胞活力.每孔约10000个细胞接种在96孔板中, 并在加湿培养箱中培养以获得粘附性.培养24 h后, 用100 μL新鲜培养基(RPMI-1640)代替每个孔中的培养基, 新鲜培养基中分别含有不同浓度(0, 0.5, 1, 3, 5, 10 μmol·L-1)的探针.探针溶液用孔径为0.22 μm无菌过滤器进行过滤, 使用DMSO的探针溶液进行测试, 将DMSO的体积分数小于0.2%的染料溶液加入培养基中, 37 ℃下培养24 h后, 倒掉培养基后, 将培养基RPMI-1640 (10%)稀释的CCK-8试剂添加到每个孔中并培养1 h后, 在450 nm处用平板阅读器(Spectra Max M5, 分子器件, 加利福尼亚州森尼维尔)测量吸光度, 每项试验都用6口平行井进行.细胞存活率测定为VR＝(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%, As是实验组中测试样品的吸光度(有探针, 有细胞), Ab代表实验中空白组的吸光度(无细胞, 无探针), Ac代表实验中对照组的吸光度(有细胞, 无探针).
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图 1 五甲川菁染料探针(8)的可逆光致闪烁过程示意图(a)及探针在不同pH溶液中的吸收(b)与发射(c)光谱
Figure 1 (a) Proposed diagram of photo-blinking mechanism of pentamethine cyanine dye (Cy5) probe (8); (b) absorption spectra and (c) fluorescent emission spectra of the probe in the solutions with different pH values
图 2 Cy5荧光染料(8)光致闪烁测试.在盖玻片上的光致闪烁变化(a)及单个闪烁点的光子数随时间的变化关系(b)
Figure 2 Photo-blinking study of Cy5 dye. (a) The time lapse of photoblinking behaviors of Cy5 dye on a coverslip; (b) photon number dependence of time at a single emission point
图 3 Cy5荧光染料(8)的光物理性能测试. (a)吸收、发射光谱; (b)饱和激发功率测试; (c)平均闪烁时间; (d)占空比与残余分子比例曲线, 激光功率200 W·cm-2
Figure 3 Photophysical behavior measurement of Cy5 dye. (a) Absorption and fluorescent spectra in ethanol; (b) excitation laser power dependent curve of photon number; (c) photo-blinking frequency measurements at different fluorescence-on durations; (d) duty cycle and survival fraction analysis of Cy5 dyes, laser power density was 200 W·cm-2
图 4 Cy5探针(1 μmol·L-1)在HeLa活细胞内的共定位成像测试.图a, d, g分别为Cy5探针在活细胞内的定位成像, 激发波长633 nm, 探测波长＞660 nm; 图b, e, h分别是商品化的线粒体、溶酶体、内质网探针在细胞内的定位成像, 激发波长均为488 nm, 探测波长范围520~560 nm; 图c, f, i分别为Cy5染料与商品化探针在HeLa细胞内的共定位成像.图像标尺均为10 μm
Figure 4 Colocalization fluorescent imaging of Cy5 dye (1 μmol·L-1) in HeLa cells. Panels a, d, g show Cy5 dye imaging in Hela cells excited at 633 nm, collection > 660 nm; panels b, e, h demonstrate the commercial organelle trackers imaging in HeLa cells (b) mito-trackers, (e) lyso-tracker, (h) ER-tracker, excitation wavelength at 488 nm, collection range at 520~560 nm; panels c, f, i exhibited the merged imaging of Cy5 dyes with corresponding trackers in live HeLa cells. Scale bar: 10 μm
图 5 Cy5荧光染料在HeLa细胞内的宽场成像与STORM超分辨成像. (a, e, i)分别使用前50, 100, 200帧图像平均得到的宽场成像; (b, f, j)分别使用前50, 100, 200帧原始图像重构获得超分辨成像图; (c, g, k)是图a, e, i中方框中对应的放大区域; (d, h, l)图b, f, j中方框区域对应的放大图; (o, p, q)图c, d, g, h, k, l中对应划线处的荧光强度的分布; a, b, e, f, i, j中标尺2 μm; c, d, g, h, k, l中标尺500 nm, 激光功率密度100 W·cm-2
Figure 5 Average wide-field and STORM super-resolution images of Cy5 dyes in HeLa cells and photon distribution curves of Cy5 dyes alongside the trace line in c, d, g, h, k, l. (a, e, i) Average wide-field images obtained by 50, 100 and 200 frames of raw images; (b, f, j) STORM images of Cy5 dye on mitochondria in HeLa cells reconstructed by a Falcon software with 50, 100 and 200 frames of raw images, respectively; (c, g, k) magnified images in box area in panels a, e, i, and (d, h, l) magnified images in the box area in panels b, f, j, respectively; (o, p, q) photon distribution curves alongside line in c, d, g, h, k, l; scale bar, panels a, b, e, f, i, j, 2 μm, panels c, d, g, h, k, l, 500 nm
图 6 Cy5荧光染料在活HeLa细胞内线粒体的宽场成像与STORM超分辨成像. (a) 100帧平均宽场图; (b) 100帧原始图重构的STORM超分辨成像图; (c)图a方框中的放大图; (d)图b方框中放大STORM图像, (e)图c, d中对应划线处的荧光强度的分布
Figure 6 Average wide-field and STORM super-resolution images of Cy5 dyes on mitochondria in live HeLa cells and photon distribution curves of Cy5 dyes alongside the line in panels c, d. (a) average wide-field images obtained by 100 frames of raw images; (b) STORM images of Cy5 dye on mitochondria in HeLa cells reconstructed by a Falcon software with 100 frames of raw images; (c) magnified image in box area in panel a, and (d) magnified image in the box area in panel b; (e) photon distribution curves alongside line in c, d; scale bar, panels a, b, 2 μm, panels c, d, 200 nm
图 7 Cy5探针的细胞毒性试验结果, 不同浓度探针(8)与HeLa细胞共培养后使用MTT检测试剂
Figure 7 Cytotoxicity experiment of fluorescent probe (8), different concentration of the probe was incubated with HeLa cell for 24 h and cell viability was measured with MTT reagent
表 1 探针的光物理性质
Table 1. Photophysical properties of fluorescent probe
| 摩尔吸光系数a(×105) | 荧光量子产率b | 荧光寿命c/ns | |
| 二氯甲烷 | 0.96 | 0.134 | 0.53 |
| 二甲基亚砜 | 0.91 | 0.097 | 0.47 |
| 乙醇 | 1.21 | 0.083 | 0.60 |
| 甲醇 | 1.15 | 0.075 | 0.61 |
| 水 | 0.72 | 0.011 | 0.58 |
| a摩尔消光系数是在控制探针吸光度在0.3~0.5范围内测试; b荧光量子产率是选用罗丹明B作为参比染料进行测试计算(Φ＝0.97); c荧光寿命是在课题组DCS-120荧光寿命系统上测试. | |||
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