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• 1.   引言

  真核细胞包含着大量的糖类物质, 这些物质主要由单糖、寡糖或者多糖组成.它们与蛋白质或者脂质相连接, 形成糖缀合物.糖缀合物的糖基部分称为聚糖.聚糖修饰是生物过程中一种重要的蛋白质翻译后修饰, 它对哺乳动物细胞的存活至关重要, 通常决定蛋白质的加工、折叠和转运, 并调控包括细胞的生长和分化、细胞-细胞间的交流和细胞-基质间的相互作用等几乎所有的细胞过程^{[1, 2]}.哺乳动物细胞相关的聚糖主要由10种单糖组成^[3]:葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、艾杜糖醛酸(IdoA)和唾液酸(SA).不同的单糖组成、排列顺序、连接方式和分支结构等因素形成了多种多样的聚糖^[4].它们主要存在于人体细胞和血液循环中的绝大多数蛋白质上^{[5, 6]}.根据结合位点的不同, 可将聚糖划分为O-聚糖(O-glycan)、N-聚糖(N-glycan)和糖脂等(图 1)^[7]. O-聚糖是通过氧原子与多肽连接的寡糖, 通常由起始糖GalNAc与蛋白质肽链的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基共价结合. N-聚糖是通过氮原子与多肽连接的寡糖, 通常由起始糖GlcNAc与蛋白质肽链的天冬酰胺(Asn)残基共价结合. N-聚糖有一个共同的五糖核心结构, 根据聚糖链的差异可以将N-聚糖划分为复合型、杂合型和高甘露糖型.糖脂是由糖基与脂质神经酰胺连接而成的分子^[4].

  图 1

  

  图 1.  糖蛋白和糖脂上N-聚糖和O-聚糖的示意图^[7]

  Figure 1.  Schematic representation of N-linked and O-linked glycans on glycoproteins and glycolipids^[7]

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  聚糖参与糖缀合物介导多种生物学过程并执行各种重要的生物功能.例如: (1)聚糖参与多肽的形成和加工, 从而调节蛋白质的折叠和转运, 并参与蛋白质的质量控制, 延长蛋白质的半衰期. (2)聚糖在细胞表面形成细胞的糖衣, 参与细胞的识别与粘连, 并在组织的生长、发育和分化中起着关键性作用. (3)细胞分泌的糖缀合物是细胞外基质(ECM)的重要组成部分, 它们介导细胞间的识别与粘附、细胞间信号传导以及细胞转移等生物过程. (4)聚糖还携带蛋白质代谢去向的信息.如糖缀合物末端的唾液酸残基与血液中蛋白质的寿命和更新机制有关. (5)寡糖链是绝大多数糖缀合物的功能中心.部分聚糖对自身糖蛋白具有保护或润滑作用, 比如在唾液中, 大量的唾液酸残基能增强唾液粘蛋白的粘性, 从而增强了唾液的润滑性^{[8, 9]}.

  聚糖的多样性决定了糖缀合物包含丰富的关于细胞和疾病状态的聚糖信息.糖缀合物参与调节多种细胞生理过程, 例如:细胞代谢^[10], 细胞之间的粘附^[11], 细胞与基质的相互作用^[12], 细胞间或细胞内信号传导^{[13, 14]}等.异常的糖基化与人类疾病密切相关, 包括炎症、癌症转移和传染病等^[15~17].因此, 糖缀合物可以作为疾病检测和药物靶向的有效生物标志物, 研究细胞的糖缀合物对疾病的早期预防、及时诊断、实时监测以及预后评估具有重要意义^{[18, 19]}.本综述基于细胞外聚糖的相关研究, 总结了细胞分泌聚糖的检测方法, 并阐述了研究细胞分泌聚糖的意义.

  2.   细胞分泌物中的聚糖

  细胞外基质(ECM)包含大量细胞分泌的大分子物质, 这些物质构成动态且复杂的三维大分子网状结构并存在于所有的组织和器官中. ECM的主要成分包括糖胺聚糖(GAGs)、蛋白聚糖(PGs)、弹性蛋白、胶原蛋白、纤黏连蛋白(FN)、层黏连蛋白(LN)和其他的糖蛋白.其中, GAGs是由不同结构和数量的二糖单元重复连接形成的直链分子, 它们是带负电荷的杂多糖. PGs是指一个核心蛋白上共价连接了一个或多个GAGs链, 它是组织中最重要的结构和功能性生物大分子^[20].弹性蛋白是一种弹性较大的结构糖蛋白, 它与微纤维糖蛋白一起组成网状结构的弹性纤维^[21]. FN是一种分子量高达450 KD的大分子糖蛋白, 它与组织形成、修复和重塑密切相关, 并在脊椎动物发育过程中发挥重要作用^[22]. LN是一种大型的异源三聚体十字形糖蛋白, 每个LN异源三聚体由一个α链, 一个β链和一个γ链组成, 每个链有各自的基因编码^[23]. ECM中的糖蛋白还包括接触蛋白(ND)、抗黏附蛋白肌腱生长蛋白(tenascin, TN)、骨黏连蛋白(osteonecin, BM-40)、基底膜蛋白(bamin)等.此外, 细胞还通过内吞途径分泌出糖基化的小囊泡, 例如外泌体^[24].这些成分大多是高度酸性的水合分子, 包含多种独立折叠的结构域和特定的聚糖, 它们不仅为细胞提供空间环境和结构支持, 还参与调节多种细胞生理过程, 包括细胞的生长、增殖、分化、迁移和形态变化等^{[20, 25~27]}.

  大约有50%的血清蛋白都是糖基化的^[28], 并且糖基化程度随着细胞恶性程度的增加而增加.分泌物的异常糖基化与多种疾病的发生和发展密切相关, 例如:已经报道血清中多种糖基化蛋白质的改变与卵巢癌的发生有关^[29~31].口腔癌的恶性转化会导致口腔癌患者血清中唾液酸水平增加^[32].在所有的病理ECM重塑过程中, PGs的含量会发生明显的改变^{[33, 34]}.肿瘤血管系统周围由FN大分子(纤黏连蛋白)构成的无定形胶状物显著上调, 促进肿瘤的进展^[35]. LN在早期胚胎和某些肿瘤细胞之间含量较高, 而在正常组织液中的浓度极低.它们对早期胚胎发育和器官生长具有至关重要的作用, 也是促进血管生长和内皮基底膜成熟的重要组成部分^{[36, 37]}.肿瘤细胞的分泌液常常展现出总体唾液酸化水平的异常增加^[38~40].因此检测细胞分泌物中的聚糖可以预测多种疾病的发生和发展, 为疾病诊断和治疗提供有力的工具^{[26, 41]}.

  3.   细胞分泌物中的聚糖研究

  由于细胞分泌物中聚糖的广泛分布和多种生物学作用, 研究分泌物中的聚糖有利于更好地了解异常的细胞代谢和恶性肿瘤的进展^[42], 对揭示复杂的癌症机理具有重要意义^[43].

  3.1   分泌聚糖的识别与标记方法

  要检测细胞分泌物中聚糖, 首先需要有特异性的聚糖识别和标记方法.目前, 识别或标记分泌物中的聚糖的方法主要有三种:凝集素识别法、化学共价识别法和聚糖代谢标记技术.

  3.1.1   凝集素识别法

  自然界中的凝集素大多是来源于植物的一类非免疫源蛋白质, 通常含有多个与特定聚糖结合的位点, 在聚糖研究领域发挥极大的作用.基于凝集素的多样性和特异性, 研究者可以将多种凝集素固定在同一个芯片上形成凝集素阵列, 实现多种聚糖的同时检测.

  2010年, Liu等^[44]开发了一个综合平台用于研究早期肝癌(HCC)中的糖蛋白生物标志物.他们首先使用凝集素阵列研究早期HCC和肝硬化患者癌细胞分泌到血清中糖蛋白的聚糖结构差异, 发现HCC血清检测中, 能特异性结合岩藻糖的凝集素AAL和LCA的荧光信号明显升高, 这说明HCC的岩藻糖基化水平较高.然后, 通过精准的同位素标记、凝集素提取和LC-MS/MS分析相结合的方法, 分别用10种早期HCC和肝硬化患者的血清鉴定出差异表达的岩藻糖基化蛋白, 并用AAL凝集素抗体阵列分别检测27种早期HCC和肝硬化血清样本, 以验证这些岩藻糖基化蛋白的改变(图 2).该工作结合凝集素阵列、质谱分析和凝集素抗体阵列, 确定了五种岩藻糖基化蛋白C3、CE、HRG、CD14和HGF是区分早期HCC和肝硬化的生物标志物, 使岩藻糖基化蛋白可以作为早期HCC的潜在生物标志物, 为早期HCC的检测提供了有力工具.

  图 2

  

  图 2.  早期肝癌(HCC)血清中发现糖蛋白生物标志物的综合策略流程图^[44]

  Figure 2.  Workflow showing the integrated strategy for the discovery of serum glycoprotein biomarkers in early hepatocellular carcinoma (HCC)^[44]

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  3.1.2   化学共价识别法

  化学共价识别法是指聚糖与一些化合物的化学共价结合, 该方法可以分为两类:

  第一类是指糖苷的多羟基先被氧化成醛基, 醛基进一步与含有酰肼或氨氧基的探针连接, 从而实现聚糖的识别与标记^[45].例如, Han等^[46]利用高碘酸盐和半乳糖氧化酶(GO)分别将唾液酸和半乳糖的特定羟基氧化成醛基, 然后让生物素酰肼、抗生素蛋白以及生物素-HRP编码的纳米探针依次与氧化的醛基相连, 实现了唾液酸和半乳糖的成像监测(图 3).

  图 3

  

  图 3.  用于聚糖分析的纳米探针组装(A)和CL成像(B)示意图^[46]

  Figure 3.  Schematic representation of (A) nanoprobe assembly and (B) CL imaging for analysis of cell surface glycan expression^[46]

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  第二类是指硼酸共价识别含顺式二醇的碳水化合物.当pH值较高呈碱性时, 硼酸可以与含顺式二醇的碳水化合物共价结合生成稳定的复合物, 而当pH值变为酸性时, 形成的复合物又可以解离.因此, 基于硼酸修饰的物质可以作为特异性识别顺式二醇化合物的亲和材料, 用于靶向或选择性富集目标聚糖.

  近年来, 由于硼酸的pH值敏感性, 硼酸修饰的纳米材料受到越来越多的关注^[47~50]. 2018年, Liu等^[51]基于体外指数富集配体的系统进化(SELEX)技术, 合成了一种硼酸修饰的聚糖印迹磁性纳米粒子(BA-MNPs), 用于高效筛选糖蛋白特异性的适配体(图 4).这一工作首先在相对较高的pH值(≥7.0)下, 利用BA-MNPs特异性识别从血清中富集的含有顺式二醇的目标糖蛋白, 该糖蛋白可以特异性结合荧光素标记的核酸适配体ssDNA.然后, 在pH为酸性(pH≤3.0)条件下, 通过酸性溶液洗脱过程从BA-MNPs上释放出带有目标ssDNA的糖蛋白, 并通过聚合酶链反应(PCR)技术放大ssDNA的信号, 实现糖蛋白的高灵敏检测.

  图 4

  

  图 4.  基于聚糖印迹MNP的SELEX方法用于筛选糖蛋白适配体的原理示意图^[51]

  Figure 4.  Principle and procedure of the glycan-imprinted MNP-based SELEX approach for the selection of glycoprotein-binding aptamers^[51]

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  3.1.3   新陈代谢标记技术

  聚糖新陈代谢标记技术是一种常用的生物正交反应技术, 它是基于细胞自身的生物合成机制, 将带有生物正交功能基团的非天然单糖前驱体表达到目标聚糖上^[52].通过带有信号分子的第二探针与之共价结合, 研究者可以实现目标物的原位检测或实时跟踪.该技术的关键在于选取一个能与目标糖底物良好结合且对细胞的生理过程影响较小的功能基团.由于叠氮基团具有体积小、不与内源性基团反应、在体内稳定存在且易于转化到聚糖中等优势, 近些年来基于叠氮基团的聚糖新陈代谢标记技术成为生物学家的研究热点^[53].

  目标聚糖被代谢标记叠氮基团后, 可以通过点击化学反应共价结合带有炔基的信号分子探针实现目标聚糖的检测.与叠氮聚糖进行点击反应的炔基探针通常分为两种:一种是末端炔探针, 另一种是环辛炔探针. 2002年, Sharpless及其同事^[54]首次开发了铜催化的叠氮-末端炔基的环加成反应, 然而, 金属的细胞毒性导致末端炔探针在活体中的应用受到限制.而在环辛炔与叠氮的环加成反应中, 环辛炔的sp杂化使得碳的键角相对较小并且向环加成反应的过渡态扭转, 这使得反应在没有催化剂存在下也能发生.该反应对细胞活性几乎无影响, 因此, 在生物分析中得到广泛地应用^[55~58].

  2006年, Bertozzi及其同事^[56]首次发现环辛炔能够选择性地识别标记表面带有叠氮糖蛋白的细胞. 2008年, Boons及其同事^[57]发现二苯并环辛炔可以与细胞表面代谢标记的非天然叠氮糖发生有效的无铜催化反应. 2018年, Lee等^[58]利用代谢聚糖标记技术给细胞分泌的外泌体聚糖修饰上叠氮基团, 并用带有荧光染料的偶氮苯环辛炔与叠氮基团进行体外环加成反应, 在外泌体上标记荧光分子.细胞可以通过内吞作用摄取荧光标记的外泌体, 实现外泌体在细胞或个体内的实时跟踪和生物分布研究, 为研究外泌体与靶细胞之间的相互作用提供巨大的帮助, 也为外泌体相关疾病的研究提供有力的工具.

  3.2   分泌聚糖的检测方法

  由于大多数生物分析物具有较低的丰度, 研究者们往往采用高分辨率的检测方法或者信号放大技术实现目标物的高灵敏检测.目前, 生物学家们已经开发了多种方法用于细胞分泌物中的聚糖检测, 主要有分光光度法、色谱法、质谱法、荧光法、电化学法、酶联免疫吸附法和蛋白印迹法等.

  3.2.1   分光光度法

  分光光度法是一种简单、快速且灵敏度较高的检测方法.许多研究者用分光光度法来检测血清中的唾液酸含量变化^{[32, 59~64]}.通常的方法是先通过酸水解或唾液酸苷酶处理释放出唾液酸, 然后将唾液酸与试剂反应形成色素原, 再根据它们的光谱吸收进行提取和检测, 实现不同癌症血清中唾液酸水平的评估.

  许多研究表明, 口腔癌的发生和发展与其血清中的唾液酸水平密切相关^{[32, 59~62]}. 2013年, Patel及其同事^[32]利用分光光度法研究了口腔癌前病变(OPCs)患者和口腔癌患者血清和唾液中的总体唾液酸(TSA)水平.他们研究了100例口腔癌患者、50例OPC患者和100例对照组, 比较了他们的血清和唾液中的总唾液酸/总蛋白(TSA/TP)比率.与对照组相比, OPC患者和口腔癌患者的血清和唾液的TSA/TP比率明显升高.并且, 唾液的TSA/TP比率的升高幅度大于血清的, 说明血清和唾液的TSA/TP水平在监测OPCs方面具有重要的应用价值.这些研究说明唾液酸生物标志物作为一种非侵入性工具, 可以用于监测口腔癌变过程中发生的早期病变.

  3.2.2   色谱法

  色谱法是生物分析化学领域常用的一种分离和分析方法, 目前, 已有不少研究者将不同类型的色谱技术用于细胞分泌聚糖的检测与分析^[65~68].

  2016年, Lauc及其同事^[65]采用高通量超高效液相色谱(UPLC)技术首次研究了免疫球蛋白G(IgG)的糖基化对结直肠癌的影响.该工作从血浆中分离出IgG, 释放IgG上的N-聚糖并用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记N-聚糖, 最后采用UPLC技术进行鉴定.他们比较了760例结直肠癌患者和538例年龄与性别相匹配的健康对照组的IgG糖基化.对28例患者术前进行手术疗效评估, 并在术后再评估3次.此外, 他们还分析了39例在结直肠癌初诊前搜集的血浆样品, 并将它们的IgG聚糖组分与对照组(80人在同一时期内没有患结直肠癌)进行了比较.与健康对照组相比, 结直肠癌患者血浆中的IgG半乳糖基化和IgG唾液酸化水平降低, 而其核-岩藻糖基化水平增加, 与此同时, 唾液酸化聚糖的核-岩藻糖基化水平降低.虽然基于年龄与性别关系的模型没有显示出分辨能力(AUC＝0.499), 但是在模型中加入聚糖变量后, 模型的分辨能力会显著增加(AUC＝0.755).然而, 在结直肠癌初诊前收集的样本与不患结直肠癌的对照组样本中, 这些差异并不显著, 这说明IgG糖基化的改变是疾病产生与发展的过程造成的.由于IgG糖基化与肿瘤免疫监视和癌症预后密切相关, IgG糖基化的个体差异可能对预测疾病过程或选择治疗方案具有重要意义.

  3.2.3   质谱法

  质谱法是蛋白质组学研究中的一项重要分析技术, 它既能提供结构信息, 又能提供定量信息.然而, 蛋白质糖基化的研究面临着巨大的挑战.这主要是因为糖肽的丰度相对较低, 与非糖肽相比, 其电离效率要低得多, 高丰度的非糖肽可以显著抑制糖肽的质谱响应.因此, 在质谱分析之前, 需要高效的富集策略来分离和富集糖蛋白/糖肽^[47].

  IgG可以通过其可结晶的片段(Fc)区域和先天免疫性细胞的Fcγ受体或用于消除入侵异物和癌细胞的补体之间的相互作用, 引发抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性的细胞毒性(CDC).这种相互作用可以通过IgG Fc的N-聚糖来介导促炎和抗炎活性^[69].健康状态下, 血清中的IgG只能介导临床保护, 没有生物学功能^[70], 而疾病特异性IgG (DSIgG)的Fc区域N-聚糖改变在一定程度上可以反映人类的健康状况^{[71, 72]}. 2016年, Zhang等^[73]利用基质辅助激光解吸电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱(MALDI-FTICR MS)研究了胃癌(GC)患者的DSIgG的Fc区域N-聚糖, 他们成功区分了胃癌患者和良性胃病患者(BGD).结合优化的聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)和十二烷基磺酸钠-PAGE (SDS- PAGE)技术, 从443例BGD患者和403例GC患者的846份血清样本中分离得到与血清免疫炎症相关的DSIgG, 然后使用MALDI-FTICR MS技术检测吸附在DSIgG Fc区域的N-连接糖肽, 并统计分析BGD患者和GC患者的DSIgG聚糖表达水平的变化. BGD患者的DSIgG1 G1S、DSIgG2 G0F、G1、G2F、G2FS以及DSIgG2的半乳糖基化和唾液酸化与性别显著相关, BGD患者与GC患者之间DSIgG的年龄特异性糖型和糖基化特征具有相似的变化趋势.然而, DSIgG糖型的半乳糖基化、唾液酸化和二等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的协同作用在两种病理间出现显著差异, 具有较强的区分GC患者与BGD患者的诊断能力.受试者工作特征曲线(ROC)分析表明, DSIgG2的G2FN/G1FN比率能很好地区分20~79岁的女性BGD患者和女性GC患者.

  事实上, 生物学家大多采用色谱-质谱联用技术研究分泌聚糖相关的生物标志物^{[66, 67, 74~79]}.传统的N-聚糖分析方法是通过肽-N-糖苷酶F(PNGase岩藻糖)裂解糖基, 使其从肽骨架中释放出来.这一程序虽然简化了质谱分析, 但是会导致糖基化位点信息的丢失, 当被应用于分析混合蛋白质时, 只能得到糖基结构的总数量.而LC-MS/MS联用技术虽然产生了完整糖肽片段的复杂光谱(多肽、聚糖和糖肽片段峰), 但也保留了每种聚糖的位点信息, 它可以在特定肽段上明确单个糖形式^[61].

  2014年, Kontro等^[67]采用液相色谱与质谱联用(LC-MS)技术, 分析比较了胰腺癌(PC)患者、急性胰腺炎(AP)患者和健康个体血清中的唾液酸化N-糖肽的表达水平.首先将PC患者、AP患者和健康个体血清中的白蛋白损耗, 并加入能有效区分胰蛋白酶N-糖肽和同源物的牛胎蛋白, 经胰蛋白酶消化后利用凝集素亲和层析法富集唾液酸化的胰蛋白酶N-糖肽, 最后使用超高效LC‐MS技术比较它们的相对丰度, 并使用光谱软件MZmine进行相对定量分析, 使用网络软件Glycopeptide ID进行N-糖肽鉴定(图 5).他们鉴定出以急性期蛋白和免疫球蛋白为主的17种高丰度的血清蛋白, 其中共包含27种N-糖基化位点和62种糖型. AP患者血清中含有38种具有显著性差异的糖型变化, 而PC患者血清中只有13种, 这些变化通常只与特定糖蛋白的一两个N-糖基化位点有关. PC和AP与从急性期蛋白和免疫球蛋白中提取的唾液酸化N-糖肽的浓度有关, 这说明唾液酸化N-糖肽作为胰腺癌检测的新生物标志物具有很大的应用潜力.

  图 5

  

  图 5.  样品制备和LC-MS及LC-MS/MS分析的工作流程^[67]

  Figure 5.  Workflow including sample preparation and LC-MS and LC-MS/MS analysis^[67]

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  3.2.4   荧光法

  近年来, 荧光技术在生物分析领域具有越来越广泛的应用.为了实现低浓度生物分析物的高灵敏检测, 对目标物的荧光信号进行放大往往是必不可少的.目前用于分泌聚糖的荧光信号放大技术主要有滚环扩增技术(RCA)和杂交链式反应(HCR).

  2018年, Feng等^[24]利用凝集素介导的原位RCA放大荧光信号策略, 实现了外泌体上与癌症相关的多种聚糖的同时检测.他们首先利用醛基玻片共价结合外泌体膜表面的氨基得到外泌体阵列, 然后将外泌体阵列与生物素化的凝集素一起温育, 其中凝集素部分作为识别外泌体上糖基的单元, 可以将外泌体上多种聚糖的不同表达程度转换成相应的生物素化凝集素的结合数量.通过加入带有滚环扩增引物探针的链霉亲和素与之继续温育, 可启动RCA反应的引物探针可以被引入到外泌体表面上.最后通过多个带有荧光染料的DNA探针进行RCA反应后, 研究者实现了荧光信号的极大放大, 从而实现外泌体表面聚糖的高灵敏检测(图 6).该方法不仅可用于对比来源不同的外泌体之间的聚糖模式, 还可用于比较外泌体与其亲本细胞所具有的特定聚糖特征, 为研究基于外泌体上的糖生物标记物和阐明外泌体聚糖的生物学意义提供帮助.

  图 6

  

  图 6.  外泌体阵列上凝集素介导的原位滚环扩增(RCA)技术用于检测癌症相关的外泌体聚糖模式的方案示意图^[24]

  Figure 6.  Schematic illustration of lectin-mediated in situ rolling circle amplification on exosomal array for detection of cancer-related exosomal glycan pattern^[24]

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  2019年, Xiong等^[80]利用HCR信号放大技术, 实现了多种活细胞分泌的唾液酸化糖缀合物(SiaGCs)的荧光可视化定量检测.通过化学选择性识别作用, 硼酸芯片可以轻松地捕获细胞分泌的代谢标记叠氮基团的SiaGCs, 并利用炔基修饰的DNA引物探针引发HCR信号放大反应, 获得细胞分泌的SiaGCs的可视化荧光信号.放大的荧光信号可以用基于叠氮唾液酸建立的标准曲线实现单个细胞分泌SiaGCs的定量检测(图 7).该方法还可用于鉴别肿瘤细胞与正常细胞, 监测药物治疗过程中分泌SiaGCs的变化, 为揭示聚糖分泌相关的生物学过程提供了强有力的量化工具.

  图 7

  

  图 7.  细胞分泌的SiaGCs定量检测示意图^[80]

  Figure 7.  Schematic illustration of quantitative detection of SiaGCs secreted from cells^[80]

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  3.2.5   电化学法

  电化学法具有高灵敏、快响应和低成本等优势, 近年来成为细胞分泌聚糖检测的一个重要工具.前列腺特异性抗原(PSA)是前列腺癌(PCa)的一种生物标志物. 2016年, Pihikova等^[81]构建了一种三明治结构的基于凝集素的高灵敏无损害的电化学免疫传感器, 该传感器用于癌症相关的人血清样本中PSA的糖基化分析.电化学阻抗谱法(EIS)作为一种无标记的固定抗PSA的方法, 对同一表面捕获的PSA进行PSA检测和凝集素测定.此外, 合适的阻断剂可以使固定化的抗PSA抗体的检测具有较高的选择性.研究结果发现, 商业化的无碳阻断液是最佳的阻断剂, 其抑制非特异性蛋白结合的效果是无阻断剂的55倍, 同时允许检测PSA.将加入凝集素(与PSA上特定聚糖的量成比例)后得到的生物传感响应除以与样本(与样本中的PSA水平成正比)孵育后得到的生物传感响应, 发现前列腺癌样品中结合到血清PSA的Maackia amurensis凝集素(MAA, 一种识别α2, 3-终端唾液酸的凝集素)明显高于健康对照组5.3倍, 这说明该生物传感器可以有效地鉴别健康个体和PCa患者的血清样本, 结合血清PSA水平分析和PSA糖谱分析对改善PCa检测具有巨大的潜力.

  3.2.6   酶联免疫吸附法

  酶联免疫吸附测定法(ELISA)是一种基于抗原抗体特异性识别通过酶与底物产生的颜色反应实现目标物的分析与检测方法. ELISA具有操作简单、反应迅速、特异性强以及灵敏度高等优点, 受到生物学家越来越多的关注. 2012年, Wu等^[82]结合凝集素阵列、MS分析和ELISA, 研究了卵巢癌患者血清中的岩藻糖基化蛋白生物标志物.他们首先利用凝集素阵列检测卵巢癌患者和良性患者血清中岩藻糖基化的总体变化, 发现卵巢癌患者血清中的岩藻糖具有明显不同的表达差异.然后, 使用多种特异性识别岩藻糖的凝集素提取岩藻糖基化糖蛋白, 用LC-MS/MS对提取的糖蛋白进行鉴定, 发现卵巢癌患者血清与良性疾病血清中有5种差异表达的糖蛋白.最后, 基于辣根过氧化物酶(HRP)与底物TMB的显色反应, 研究者利用ELISA和基于凝集素的ELISA (AAL-ELISA)证实这些糖蛋白的差异表达, 发现糖皮质激素结合球蛋白(CBG)、血清淀粉样蛋白p组分(SAP)、补体因子B (CFAB)和富含组氨酸的糖蛋白(HRG)是区分卵巢癌与良性疾病或健康对照的最具潜力的糖蛋白生物标志物(图 8).

  图 8

  

  图 8.  鉴定并验证候选生物标志物的工作流程^[82]

  Figure 8.  Workflow for candidate biomarker identification and validation^[82]

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  此外, 该课题组还利用类似的方法研究了卵巢癌患者血清中唾液酸化糖蛋白的变化^[28].先利用凝集素SNA阵列捕获卵巢癌患者血清中的唾液酸化糖蛋白, 然后基于HRP与TMB的显色反应, 使用ELISA技术证实卵巢癌患者血清中的丛生蛋白(CLUS)、补体因子H (CFH)和血液结合素(HEMO)具有异常的唾液酸化水平CLUS的蛋白水平下调而富含亮氨酸的糖蛋白(LRG1)的蛋白水平上调(图 9).

  图 9

  

  图 9.  基于凝集素的ELISA分析目标糖蛋白的示意图^[28]

  Figure 9.  Diagram of lectin-based ELISA assay for the analysis of target glycoproteins^[28]

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  3.2.7   蛋白印迹法

  蛋白印迹法是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的实验方法. Yang等^[83]使用蛋白印迹法检测分泌糖蛋白的聚糖配体, 研究了分泌蛋白质老化和更新的内在机制.该机制主要涉及两大因素, 即:循环糖苷酶和内源凝集素.循环糖苷酶会逐渐重塑连接到大多数分泌蛋白的N-聚糖.随着时间的推移, N-聚糖重塑暴露出各种内源凝集素受体的聚糖配体, 它们与凝集素识别后, 被溶酶体内吞, 从而消除了这些老化的分泌蛋白质.所以, 糖苷酶活性的抑制可以减弱N-聚糖重塑, 而凝集素受体的缺失会导致带有相应聚糖配体的老化蛋白质的积累.此外, N-聚糖重塑的基础速率在不同的蛋白质中是不同的, 体现了分泌蛋白的寿命差异.这种分泌蛋白老化和更新的机制决定了分泌蛋白的寿命和丰度, 有利于研究疾病的发病机理并调节疾病状况.

  4.   总结与展望

  细胞分泌物中的聚糖作为一种重要的生物功能分子, 在细胞间信号转导、分子识别和免疫应答等一系列生物学过程中发挥着重要作用.当前, 分泌聚糖的研究主要集中在血清中的聚糖检测.血清中的聚糖变化在各种癌症中都十分显著, 因而分泌聚糖可以作为一种可靠的生物标志物.并且, 研究分泌的聚糖对肿瘤等疾病的治疗起到积极的作用, 在临床应用中具有极其重要的意义.然而, 只针对血清中的聚糖进行检测难以揭示聚糖相关的细胞间信号传导过程, 这对揭示癌症机理以及发展新的癌症诊断治疗手段至关重要.未来的研究方向应该更加着力于细胞分泌聚糖的原位监测, 且需要注重具体的聚糖分泌物种类的鉴定以及定量.对分泌聚糖进行原位监测, 需要开发新型聚糖响应型信号开关, 并构建聚糖响应性信号探针, 将探针直接加入到细胞外基质实现对分泌聚糖的实时原位监测.由于聚糖本身的生物以及化学性质不活泼性, 这将具有较大的挑战性.此外, 聚糖分泌物的种类鉴定和定量需综合利用现有的生物分子鉴别手段, 或者开发新的识别机制, 发展新的定量分析方法学, 并在单细胞层次实现高灵敏定量检测.最后, 为了阐明肿瘤相关疾病中聚糖的潜在作用, 分泌物中聚糖以及聚糖相关酶的变化机制的研究也是一个重要的发展方向.

  
  
• 1. [1]

     Xiao, H. P.; Suttapitugsakul, S.; Sun, F. X.; Wu, R. H. Acc. Chem. Res. 2018, 51, 1796. doi: 10.1021/acs.accounts.8b00200

  2. [2]

     张丽霞, 杜秀芳, 曾盈, 化学学报, 2016, 74, 149. doi: 10.7503/cjcu20150696Zhang, L.-X.; Du, X.-F.; Zeng, Y. Acta Chim. Sinica 2016, 74, 149 (in Chinese). doi: 10.7503/cjcu20150696

  3. [3]

     Krishnamoorthy, L.; Mahal, L. K. ACS Chem. Biol. 2009, 4, 715. doi: 10.1021/cb900103n

  4. [4]

     Pinho, S. S.; Reis, C. A. Nat. Rev. Cancer 2015, 15, 540. doi: 10.1038/nrc3982

  5. [5]

     Brockhausen, I. BBA-Gen. Subjects 1999, 1473, 67. doi: 10.1016/S0304-4165(99)00170-1

  6. [6]

     Clerc, F.; Reiding, K. R.; Jansen, B. C.; Kammeijer, G. S. M.; Bondt, A.; Wuhrer, M. Glycoconjugate J. 2016, 33, 309. doi: 10.1007/s10719-015-9626-2

  7. [7]

     Zhang, Z. J.; Wuhrer, M.; Holst, S. Glycoconjugate J. 2018, 35, 139. doi: 10.1007/s10719-018-9820-0

  8. [8]

     Fuster, M. M.; Esko, J. D. Nat. Rev. Cancer 2005, 5, 526. doi: 10.1038/nrc1649

  9. [9]

     Rich, J. R.; Withers, S. G. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 206. doi: 10.1038/nchembio.148

  10. [10]

      Dennis, J. W.; Nabi, I. R.; Demetriou, M. Cell 2009, 139, 1229. doi: 10.1016/j.cell.2009.12.008

  11. [11]

      Pinho, S. S.; Figueiredo, J.; Cabral, J.; Carvalho, S.; Dourado, J.; Magalhaes, A.; Gartner, F.; Mendonca, A. M.; Isaji, T.; Cu, J. G.; Carneiro, F.; Seruca, R.; Taniguchi, N.; Reis, C. A. BBA-Gen. Subjects 2013, 1830, 2690. doi: 10.1016/j.bbagen.2012.10.021

  12. [12]

      Zhao, Y. Y.; Sato, Y.; Isaji, T.; Fukuda, T.; Matsumoto, A.; Miyoshi, E.; Gu, J. G.; Taniguchi, N. FEBS J. 2008, 275, 1939. doi: 10.1111/j.1742-4658.2008.06346.x

  13. [13]

      Takeuchi, H.; Haltiwanger, R. S. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014, 453, 235. doi: 10.1016/j.bbrc.2014.05.115

  14. [14]

      Boscher, C.; Dennis, J. W.; Nabi, I. R. Curr. Opin. Cell Biol. 2011, 23, 383. doi: 10.1016/j.ceb.2011.05.001

  15. [15]

      Ju, T. Z.; Otto, V. I.; Cummings, R. D. Angew. Chem., Int. Ed. 2011, 50, 1770. doi: 10.1002/anie.201002313

  16. [16]

      Gilgunn, S.; Conroy, P. J.; Saldova, R.; Rudd, P. M.; O'Kennedy, R. J. Nat. Rev. Urol. 2013, 10, 99. doi: 10.1038/nrurol.2012.258

  17. [17]

      Ohtsubo, K.; Marth, J. D. Cell 2006, 126, 855. doi: 10.1016/j.cell.2006.08.019

  18. [18]

      Kailemia, M. J.; Park, D.; Lebrilla, C. B. Anal. Bioanal. Chem. 2017, 409, 395. doi: 10.1007/s00216-016-9880-6

  19. [19]

      Adamczyk, B.; Tharmalingam, T.; Rudd, P. M. BBA-Gen. Subjects 2012, 1820, 1347. doi: 10.1016/j.bbagen.2011.12.001

  20. [20]

      Theocharis, A. D.; Skandalis, S. S.; Gialeli, C.; Karamanos, N. K. Adv. Drug Del. Rev. 2016, 97, 4. doi: 10.1016/j.addr.2015.11.001

  21. [21]

      Muiznieks, L.; Keeley, F. W. Biochem. Cell Biol. 2010, 88, 392.

  22. [22]

      George, E. L.; Georgeslabouesse, E. N.; Patelking, R. S.; Rayburn, H.; Hynes, R. O. Development 1993, 119, 1079.

  23. [23]

      Aumailley, M.; Bruckner-Tuderman, L.; Carter, W. G.; Deutzmann, R.; Edgar, D.; Ekblom, P.; Engel, J.; Engvall, E.; Hohenester, E.; Jones, J. C. R.; Kleinman, H. K.; Marinkovich, M. P.; Martin, G. R.; Mayer, U.; Meneguzzi, G.; Miner, J. H.; Miyazaki, K.; Patarroyo, M.; Paulsson, M.; Quaranta, V.; Sanes, J. R.; Sasaki, T.; Sekiguchi, K.; Sorokin, L. M.; Talts, J. F.; Tryggvason, K.; Uitto, J.; Virtanen, I.; von der Mark, K.; Wewer, U. M.; Yamada, Y.; Yurchenco, P. D. Matrix Biol. 2005, 24, 326. doi: 10.1016/j.matbio.2005.05.006

  24. [24]

      Feng, Y. M.; Guo, Y. N.; Li, Y. R.; Tao, J.; Ding, L.; Wu, J.; Ju, H. X. Anal. Chim. Acta 2018, 1039, 108. doi: 10.1016/j.aca.2018.07.040

  25. [25]

      Kim, S. H.; Turnbull, J.; Guimond, S. J. Endocrinol. 2011, 209, 139. doi: 10.1530/JOE-10-0377

  26. [26]

      Bonnans, C.; Chou, J.; Werb, Z. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014, 15, 786.

  27. [27]

      Varki, A. Trends Mol. Med. 2008, 14, 351. doi: 10.1016/j.molmed.2008.06.002

  28. [28]

      Wu, J.; Xie, X. L.; Nie, S.; Buckanovich, R. J.; Lubman, D. M. J. Proteome Res. 2013, 12, 3342. doi: 10.1021/pr400169n

  29. [29]

      Saldova, R.; Royle, L.; Radcliffe, C. M.; Hamid, U. M. A.; Evans, R.; Arnold, J. N.; Banks, R. E.; Hutson, R.; Harvey, D. J.; Antrobus, R.; Petrescu, S. M.; Dwek, R. A.; Rudd, P. M. Glycobiology 2007, 17, 1344. doi: 10.1093/glycob/cwm100

  30. [30]

      Ye, B.; Skates, S.; Mok, S. C.; Horick, N. K.; Rosenberg, H. F.; Vitonis, A.; Edwards, D.; Sluss, P.; Han, W. K.; Berkowitz, R. S.; Cramer, D. W. Clin. Cancer. Res. 2006, 12, 432. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-05-0461

  31. [31]

      Zhang, H.; Li, X. J.; Martin, D. B.; Aebersold, R. Nat. Biotechnol. 2003, 21, 660. doi: 10.1038/nbt827

  32. [32]

      Vajaria, B. N.; Patel, K. R.; Begum, R.; Shah, F. D.; Patel, J. B.; Shukla, S. N.; Patel, P. S. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. 2013, 115, 764. doi: 10.1016/j.oooo.2013.01.004

  33. [33]

      Theocharis, A. D.; Gialeli, C.; Bouris, P.; Giannopoulou, E.; Skandalis, S. S.; Aletras, A. J.; Iozzo, R. V.; Karamanos, N. K. FEBS J. 2014, 281, 5023. doi: 10.1111/febs.12927

  34. [34]

      Iozzo, R. V.; Sanderson, R. D. J. Cell. Mol. Med. 2011, 15, 1013. doi: 10.1111/j.1582-4934.2010.01236.x

  35. [35]

      Chandler, E. M.; Seo, B. R.; Califano, J. P.; Eguiluz, R. C. A.; Lee, J. S.; Yoon, C. J.; Tims, D. T.; Wang, J. X.; Cheng, L.; Mohanan, S.; Buckley, M. R.; Cohen, I.; Nikitin, A. Y.; Williams, R. M.; Gourdon, D.; Reinhart-King, C. A.; Fischbach, C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2012, 109, 9786. doi: 10.1073/pnas.1121160109

  36. [36]

      Durbeej, M. Cell Tissue Res. 2010, 339, 259. doi: 10.1007/s00441-009-0838-2

  37. [37]

      Hallmann, R.; Horn, N.; Selg, M.; Wendler, O.; Pausch, F.; Sorokin, L. M. Physiol. Rev. 2005, 85, 979. doi: 10.1152/physrev.00014.2004

  38. [38]

      Arcinas, A.; Yen, T. Y.; Kebebew, E.; Macher, B. A. J. Proteome Res. 2009, 8, 3958. doi: 10.1021/pr900278c

  39. [39]

      Schultz, M. J.; Swindall, A. F.; Bellis, S. L. Cancer Metastasis Rev. 2012, 31, 501. doi: 10.1007/s10555-012-9359-7

  40. [40]

      Bertozzi, C. R.; Kiessling, L. L. Science 2001, 291, 2357. doi: 10.1126/science.1059820

  41. [41]

      Hu, Y. M.; Borges, C. R. Analyst 2017, 142, 2748. doi: 10.1039/C7AN00396J

  42. [42]

      Reis, C. A.; Osorio, H.; Silva, L.; Gomes, C.; David, L. J. Clin. Pathol. 2010, 63, 322. doi: 10.1136/jcp.2009.071035

  43. [43]

      Zhang, Z. J.; Wuhrer, M.; Holst, S. Glycoconjugate J. 2018, 35, 139. doi: 10.1007/s10719-018-9820-0

  44. [44]

      Liu, Y. S.; He, J. T.; Li, C.; Benitez, R.; Fu, S.; Marrero, J.; Lubman, D. M. J. Proteome Res. 2010, 9, 798. doi: 10.1021/pr900715p

  45. [45]

      Zeng, Y.; Ramya, T. N. C.; Dirksen, A.; Dawson, P. E.; Paulson, J. C. Nat. Methods 2009, 6, 207. doi: 10.1038/nmeth.1305

  46. [46]

      Han, E.; Ding, L.; Qian, R. C.; Bao, L.; Ju, H. X. Anal. Chem. 2012, 84, 1452. doi: 10.1021/ac203489e

  47. [47]

      Li, D. J.; Chen, Y.; Liu, Z. Chem. Soc. Rev. 2015, 44, 8097. doi: 10.1039/C5CS00013K

  48. [48]

      刘丽婷, 张莹, 焦竞, 杨芃原, 陆豪杰, 化学学报, 2013, 71, 535. doi: 10.6023/A13020176Liu, L.-T.; Zhang, Y.; Jiao, J.; Yang, P.-Y.; Lu, H.-J. Acta Chim. Sinica 2013, 71, 535 (in Chinese). doi: 10.6023/A13020176

  49. [49]

      Liu, Z.; He, H. Acc. Chem. Res. 2017, 50, 2185. doi: 10.1021/acs.accounts.7b00179

  50. [50]

      仇娟, 张莹, 陆豪杰, 杨芃原, 化学学报, 2011, 69, 2123. doi: 10.3866/PKU.WHXB20110902Qiu, J.; Zhang, Y.; Lu, H.-J.; Yang, P.-Y. Acta Chim. Sinica 2011, 69, 2123 (in Chinese). doi: 10.3866/PKU.WHXB20110902

  51. [51]

      Ma, Y. Y.; Li, X. L.; Li, W.; Liu, Z. ACS Appl. Mater. Interfaces 2018, 10, 40918. doi: 10.1021/acsami.8b14441

  52. [52]

      王杰, 陈鹏, 化学学报, 2017, 75, 1173. doi: 10.6023/A17090419Wang, J.; Chen, P. Acta Chim. Sinica 2017, 75, 1173 (in Chinese). doi: 10.6023/A17090419

  53. [53]

      Palaniappan, K. K.; Bertozzi, C. R. Chem. Rev. 2016, 116, 14277. doi: 10.1021/acs.chemrev.6b00023

  54. [54]

      Rostovtsev, V. V.; Green, L. G.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B. Angew. Chem., Int. Ed. 2002, 41, 2596. doi: 10.1002/1521-3773(20020715)41:14<2596::AID-ANIE2596>3.0.CO;2-4

  55. [55]

      Jewett, J. C.; Bertozzi, C. R. Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 1272. doi: 10.1039/b901970g

  56. [56]

      Agard, N. J.; Baskin, J. M.; Prescher, J. A.; Lo, A.; Bertozzi, C. R. ACS Chem. Biol. 2006, 1, 644. doi: 10.1021/cb6003228

  57. [57]

      Ning, X. H.; Guo, J.; Wolfert, M. A.; Boons, G. J. Angew. Chem., Int. Ed. 2008, 47, 2253. doi: 10.1002/anie.200705456

  58. [58]

      Lee, T. S.; Kim, Y.; Zhang, W. Q.; Song, I. H.; Tung, C. H. Biochim. Biophys. Acta-Gen. Subj. 2018, 1862, 1091. doi: 10.1016/j.bbagen.2018.02.001

  59. [59]

      Shah, M. H.; Telang, S. D.; Shah, P. M.; Patel, P. S. Glycoconjugate J. 2008, 25, 279. doi: 10.1007/s10719-007-9086-4

  60. [60]

      Sawhney, H.; Kumar, C. A. Cancer Biomark. 2011, 10, 43.

  61. [61]

      Rajpura, K. B.; Patel, P. S.; Chawda, J. G.; Shah, R. M. J. Oral Pathol. Med. 2005, 34, 263. doi: 10.1111/j.1600-0714.2004.00210.x

  62. [62]

      Krishnan, K.; Balasundaram, S. J. Clin. Diagn. Res. 2017, 11, ZC25.

  63. [63]

      Wongkham, S.; Boonla, C.; Kongkham, S.; Wongkham, C.; Bhudhisawasdi, V.; Sripa, B. Clin. Biochem. 2001, 34, 537. doi: 10.1016/S0009-9120(01)00265-X

  64. [64]

      Patel, P. S.; Rawal, G. N.; Balar, D. B. Gynecol. Oncol. 1993, 50, 294. doi: 10.1006/gyno.1993.1214

  65. [65]

      Vuckovic, F.; Theodoratou, E.; Thaci, K.; Timofeeva, M.; Vojta, A.; Stambuk, J.; Pucic-Bakovic, M.; Rudd, P. M.; Derek, L.; Servis, D.; Wennerstrom, A.; Farrington, S. M.; Perola, M.; Aulchenko, Y.; Dunlop, M. G.; Campbell, H.; Lauc, G. Clin. Cancer. Res. 2016, 22, 3078. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-15-1867

  66. [66]

      Saldova, R.; Royle, L.; Radcliffe, C. M.; Hamid, U. M. A.; Evans, R.; Arnold, J. N.; Banks, R. E.; Hutson, R.; Harvey, D. J.; Antrobus, R.; Petrescu, S. M.; Dwek, R. A.; Rudd, P. M. Glycobiology 2007, 17, 1344. doi: 10.1093/glycob/cwm100

  67. [67]

      Kontro, H.; Joenvaara, S.; Haglund, C.; Renkonen, R. Proteomics 2014, 14, 1713. doi: 10.1002/pmic.201300270

  68. [68]

      Rohrer, J. S. Anal. Biochem. 2000, 283, 3. doi: 10.1006/abio.2000.4643

  69. [69]

      Raju, T. S. Curr. Opin. Immunol. 2008, 20, 471. doi: 10.1016/j.coi.2008.06.007

  70. [70]

      Irani, V.; Guy, A. J.; Andrew, D.; Beeson, J. G.; Ramsland, P. A.; Richards, J. S. Mol. Immunol. 2015, 67, 171. doi: 10.1016/j.molimm.2015.03.255

  71. [71]

      Selman, M. H. J.; Niks, E. H.; Titulaer, M. J.; Verschuuren, J.; Wuhrer, M.; Deelder, A. M. J. Proteome Res. 2011, 10, 143. doi: 10.1021/pr1004373

  72. [72]

      Fokkink, W. J. R.; Selman, M. H. J.; Dortland, J. R.; Durmus, B.; Kuitwaard, K.; Huizinga, R.; van Rijs, W.; Tio-Gillen, A. P.; van Doorn, P. A.; Deelder, A. M.; Wuhrer, M.; Jacobs, B. C. J. Proteome Res. 2014, 13, 1722. doi: 10.1021/pr401213z

  73. [73]

      Zhang, D.; Chen, B. C.; Wang, Y. M.; Xia, P.; He, C. Y.; Liu, Y. J.; Zhang, R. Q.; Zhang, M.; Li, Z. L. Sci. Rep. 2016, 6, 10. doi: 10.1038/s41598-016-0003-6

  74. [74]

      Tajiri, M.; Ohyama, C.; Wada, Y. Glycobiology 2008, 18, 2. doi: 10.1093/glycob/cwm117

  75. [75]

      Shi, Y.; Xu, X.; Fang, M.; Zhang, M.; Li, Y.; Gillespie, B.; Yorke, S.; Yang, N.; McKew, J. C.; Gahl, W. A.; Huizing, M.; Carrillo- Carrasco, N.; Wang, A. Q. J. Chromatogr. B 2015, 1000, 105. doi: 10.1016/j.jchromb.2015.07.018

  76. [76]

      Priego-Capote, F.; Orozco-Solano, M. I.; Calderon-Santiago, M.; de Castro, M. D. L. J. Chromatogr. A 2014, 1346, 88. doi: 10.1016/j.chroma.2014.04.051

  77. [77]

      Kodar, K.; Stadlmann, J.; Klaamas, K.; Sergeyev, B.; Kurtenkov, O. Glycoconjugate J. 2012, 29, 57. doi: 10.1007/s10719-011-9364-z

  78. [78]

      Balmana, M.; Sarrats, A.; Llop, E.; Barrabes, S.; Saldova, R.; Ferri, M. J.; Figueras, J.; Fort, E.; de Llorens, R.; Rudd, P. M.; Peracaula, R. Clin. Chim. Acta 2015, 442, 56. doi: 10.1016/j.cca.2015.01.007

  79. [79]

      胡争艳, 孙珍, 张轶, 吴仁安, 邹汉法, 化学学报, 2012, 70, 2059. doi: 10.6023/A12050215Hu, Z.-Y.; Sun, Z.; Zhang, Y.; Wu, R.-A.; Zou, H.-F. Acta Chim. Sinica 2012, 70, 2059 (in Chinese). doi: 10.6023/A12050215

  80. [80]

      Xiong, Y.; Chen, Y.; Ding, L.; Liu, X.; Ju, H. Analyst 2019, 144, 4545. doi: 10.1039/C9AN00572B

  81. [81]

      Pihikova, D.; Kasak, P.; Kubanikova, P.; Sokol, R.; Tkac, J. Anal. Chim. Acta 2016, 934, 72. doi: 10.1016/j.aca.2016.06.043

  82. [82]

      Wu, J.; Xie, X. L.; Liu, Y. S.; He, J. T.; Benitez, R.; Buckanovich, R. J.; Lubman, D. M. J. Proteome Res. 2012, 11, 4541. doi: 10.1021/pr300330z

  83. [83]

      Yang, W. H.; Aziz, P. V.; Heithoff, D. M.; Mahan, M. J.; Smith, J. W.; Marth, J. D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 13657. doi: 10.1073/pnas.1515464112

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  图 1  糖蛋白和糖脂上N-聚糖和O-聚糖的示意图^[7]

  Figure 1  Schematic representation of N-linked and O-linked glycans on glycoproteins and glycolipids^[7]

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  图 2  早期肝癌(HCC)血清中发现糖蛋白生物标志物的综合策略流程图^[44]

  Figure 2  Workflow showing the integrated strategy for the discovery of serum glycoprotein biomarkers in early hepatocellular carcinoma (HCC)^[44]

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  图 3  用于聚糖分析的纳米探针组装(A)和CL成像(B)示意图^[46]

  Figure 3  Schematic representation of (A) nanoprobe assembly and (B) CL imaging for analysis of cell surface glycan expression^[46]

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  图 4  基于聚糖印迹MNP的SELEX方法用于筛选糖蛋白适配体的原理示意图^[51]

  Figure 4  Principle and procedure of the glycan-imprinted MNP-based SELEX approach for the selection of glycoprotein-binding aptamers^[51]

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  图 5  样品制备和LC-MS及LC-MS/MS分析的工作流程^[67]

  Figure 5  Workflow including sample preparation and LC-MS and LC-MS/MS analysis^[67]

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  图 6  外泌体阵列上凝集素介导的原位滚环扩增(RCA)技术用于检测癌症相关的外泌体聚糖模式的方案示意图^[24]

  Figure 6  Schematic illustration of lectin-mediated in situ rolling circle amplification on exosomal array for detection of cancer-related exosomal glycan pattern^[24]

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  图 7  细胞分泌的SiaGCs定量检测示意图^[80]

  Figure 7  Schematic illustration of quantitative detection of SiaGCs secreted from cells^[80]

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  图 8  鉴定并验证候选生物标志物的工作流程^[82]

  Figure 8  Workflow for candidate biomarker identification and validation^[82]

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  图 9  基于凝集素的ELISA分析目标糖蛋白的示意图^[28]

  Figure 9  Diagram of lectin-based ELISA assay for the analysis of target glycoproteins^[28]

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