English

• 1.   引言

  敌敌畏(A)具有高效、快速、广谱性等特点, 是目前应用最为广泛的有机磷杀虫剂^[1].由于敌敌畏的大量生产与使用, 导致其在土壤、淡水流域、农产品中被广泛检出^{[2, 3]}.已有研究表明, 敌敌畏能够与DNA中的鸟嘌呤发生甲基化作用, 具有致癌、致畸和致突变的三致作用, 能够导致鱼类发育发生变化, 已被确认为外源性内分泌干扰化学物质^{[4, 5]}.如图 1所示, 敌敌畏进入水环境、土壤环境后会进行水解、光解以及微生物作用等一系列反应, 形成多种代谢产物, 主要包括二氯乙醇(B)、二氯乙酸(C)和磷酸二甲酯(D)^{[6, 7]}等.尽管敌敌畏被普遍认为属于易降解、非持久性有机污染物, 但是由于不间断地施用且施用量巨大, 其环境残留较高, 敌敌畏与其代谢产物常常共存^[8].仅仅评价单个母体化合物或代谢产物对生物的毒性, 不能完全反映其环境风险.一方面, 一些代谢产物可能比相应的母体化合物具有更高的生物毒性^{[9, 10]}.另一方面, 母体化合物与代谢产物之间的相互作用会影响生物对毒物的吸收、代谢、排泄等, 最终导致更高生物毒性^[11].例如, 敌草隆及其代谢产物对两种浮游植物的联合毒性具有协同作用^[12].因此, 在评价敌敌畏的环境风险时, 有必要对母体化合物及其代谢产物的联合毒性进行评价.

  图 1

  

  图 1.  敌敌畏及其代谢物

  Figure 1.  Dichlorvos and its three metabolites

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  混合物联合毒性研究的难点在于混合物设计及毒性相互作用评价.传统的实验设计方法, 析因设计和正交设计会使得试验量随着组分和浓度水平的增加呈现指数形式增长, 大大增加了研究者的实验工作量, 不适用于多元混合物的联合毒性研究.均匀设计射线法(Uniform design ray, UD-Ray)^[13]将固定比射线设计^{[14, 15]}与均匀试验设计^[16]有机结合, 选取少数具有代表性的实验点, 让实验点在实验范围内均匀分布, 用尽可能少的实验量有效地探索多元混合物在不同浓度配比下的毒性变化规律. Chou^[17]开发了以半数效应方程为基础的组合指数(Combination index, CI). CI方法不依赖于混合物组分作用模式, 且只需精确测定两个实验点就能得到浓度-效应曲线的完整信息.不同浓度水平下的CI可定量地表达整条混合物射线毒性相互作用的变化规律^[18].研究表明, 整合UD-Ray和CI可以有效地考察复杂多元混合物的毒性相互作用^[19~21].

  尽管UD-Ray可在最大程度上降低试验工作量, 但对于生物毒性测试而言, 试验量仍不可小觑^[22].因此选择合适的受试生物及测试终点对于敌敌畏及其代谢产物混合物的毒性测试具有重要意义.业已表明, 发光菌的发光抑制毒性与各种水生动植物(例如藻类、甲壳纲动物、鱼类等)的生物毒性具有良好相关性^[23].以发光菌为受试生物的毒性测试法, 简单快速、稳定灵敏, 是化学品生物毒性测试的标准方法之一, 已得到广泛应用^{[24, 25]}.不同发光细菌具有基本相同的发光机理^[26], 青海弧菌属于淡水发光细菌^[27], 已成功用于离子液体、重金属、抗生素以及个人护肤品对水生生物的毒性测试^[28~32].秀丽线虫生活在世界各地的泥土中, 以细菌为食, 是最为简单、遗传与发育背景了解最清楚的物种之一, 已成为毒性测试的模式生物^{[33, 34]}.致死率为线虫毒性测试最常用的毒性终点, 已成功用于有机磷农药、磺胺类抗生素以及持久性有机污染物的毒性测试^[35~37].

  暴露时间也是影响生物毒性大小的重要因素. Feng等^[19]发现以取代酚、农药、离子液体为组分的六元混合物对秀丽线虫致死毒性具有明显的时间依赖协同效应, 暴露24 h后的混合物毒性明显大于12 h. Varo等^[38]发现短期暴露时纳米塑料对卤虫无明显毒性, 但长期暴露会导致生长受损.根据青海弧菌的生长曲线, 常常采用暴露0.25 h和12 h为急性毒性与慢性毒性观测时间^{[22, 29, 39]}.暴露24 h为秀丽线虫的急性致死毒性观测时间, 为揭示不同时间毒性规律, 也选择12 h为观测时间^{[19, 40, 41]}.

  本文综合应用UD-Ray和CI方法, 以水生生物青海弧菌(Vibrio qinghaiensis sp.-Q67, Q67)和土壤生物秀丽线虫(Caenorhabditis elegans, C. elegans)为受试生物, 系统分析敌敌畏(A)及其3个代谢产物即二氯乙醇(B)、二氯乙酸(C)和磷酸二甲酯(D)和它们的四元混合物体系(A-B-C-D)中5条代表性混合物射线的毒性变化与联合毒性规律, 并分别选取两个观察时间点观察混合物体系的长短期毒性, 为探索农药及其代谢物的混合物对水体与土壤环境的生态风险提供方法技术.

  2.   结果与讨论

  2.1   敌敌畏及代谢产物的毒性

  敌敌畏(A)及其三个代谢产物(B、C和D)在两个不同测试时间点对青海弧菌和秀丽线虫的浓度-效应数据都可以用两参数(位置参数α和形状参数β)非线性Weibull或Logit函数进行有效表征.拟合函数、位置参数α和形状参数β、拟合均方根误差RMSE与决定系数R²以及pEC₅₀/pLC₅₀结果参见支持信息的表S1和表S2.母体敌敌畏A与它的3个代谢物(B、C和D)在不同时间下对青海弧菌发光抑制率以及对秀丽线虫致死率的浓度-效应关系分别如图 2a与2b.为了便于观察同一物质毒性随时间的变化, 在支持信息中绘制了对青海弧菌发光抑制率(图S1)和对秀丽线虫致死率(图S2)的浓度-效应关系.

  图 2

  

  图 2.  敌敌畏及其3种代谢产物在不同暴露时间的浓度-效应关系图(●敌敌畏(A); ○二氯乙醇(B); ◇二氯乙酸(C); □磷酸二甲酯(D); 实线:拟合曲线; 虚线: 95%置信区间)

  Figure 2.  The concentration-response curves of dichlorvos and its three metabolites to Q67 (a) and C.elegans (b) at different exposure times where ●, ○, ◇ and □ refer to dichlorvos (A), dichloroethanol (B), dichloroacetic acid (C) and dimethyl phosphate (D), respectively, the solid curves to the fitted ones and the dashed ones to the 95% observation-based confidence intervals

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  结合表S1及图 2a, 对青海弧菌, 0.25 h的毒性顺序为A (pEC₅₀＝2.888)＞C (2.060)≈D (2.045)＞B (1.327).同为有机磷杀虫剂的乐果和磷胺, 青海弧菌暴露0.25 h后的pEC₅₀分别为2.697和2.950^{[42, 43]}, 毒性大小与敌敌畏基本相同. 4种混合物组分(A、B、C和D)在12 h对青海弧菌的发光抑制毒性(pEC₅₀)分别为2.760, 2.328, 2.070和2.062.可知, A、C及D的发光抑制毒性在两个暴露时间(0.25 h和12 h)没有显著性差异, 而B在12 h的毒性显著大于0.25 h的毒性, 即B具有时间依赖毒性.某些离子液体对青海弧菌和费氏弧菌的发光抑制毒性均同样具有明显的时间依赖特性, 该现象可能与胞内活性氧自由基产生及相关酶蛋白表达有关^{[40, 44]}.二氯乙醇B在青海弧菌胞内代谢过程中可能发生氧化反应, 随着时间的增加更容易转化为更高毒性的二氯乙醛或者二氯乙酸^[45], 导致0.25 h和12 h的毒性差异.但母体A在两个暴露时间点的毒性都大于其三个代谢产物的毒性.

  由表S2及图 2b可知, 对秀丽线虫, A、B、C和D在12 h对秀丽线虫的致死毒性(pLC₅₀计)顺序为: A (pLC₅₀＝2.948)＞C (2.685)≈D (2.581)＞B (1.508), 24 h的毒性顺序: A (3.173)＞D (2.955)≈C (2.819)＞B (1.580).可知, 母体A与其3种代谢产物在两个暴露时间(12 h和24 h)的致死毒性没有显著性差异, 但A、C及D的毒性都显著大于B.此外, A、B、C和D对秀丽线虫12 h的毒性顺序与青海弧菌0.25 h的毒性顺序相同, 表明敌敌畏及其代谢产物对不同营养级的指示生物, 可能具有相同的急性毒性顺序.但是, 对于慢性毒性, B对秀丽线虫的毒性表现与青海弧菌不同.

  2.2   各四元混合物的毒性

  通过均匀设计射线法(UD-Ray)从四元混合物体系(A-B-C-D)的大量混合物中选择具有不同混合比的5条代表性混合物射线, 记为R1、R2、R3、R4和R5.通过均匀表设计的这5条混合物射线的基本浓度组成(Basic concentration composition, BCC)^{[17, 39, 41]}见表S3a, 由BCC导出的各混合物射线中各组分的浓度分数或混合比见表S3b(青海弧菌发光抑制毒性试验)和表S3c(秀丽线虫致死毒性试验). 5条四元混合物射线在两个暴露时间下对青海弧菌的浓度-效应数据均可用Weibull函数有效拟合, 其回归参数(α和β)、拟合统计量(RMSE和R²)和每条射线的pEC₅₀/pLC₅₀列于表S1, 其浓度-效应关系如图 3(a). 5条四元混合物射线在两个暴露时间下对秀丽线虫的浓度-效应数据均可用Weibull函数有效拟合, 其回归参数(α和β)、拟合统计量(RMSE和R²)和每条射线的pEC₅₀/pLC₅₀列于表S2, 其浓度-效应关系如图 3(b)所示.

  图 3

  

  图 3.  5条混合物射线的浓度-效应曲线(实线:拟合曲线; 虚线: 95%观测置信区间)

  Figure 3.  The concentration-response curves of five mixture rays to Q67 (a) and C.elegans (b) where the solid curves refer to the fitted ones and the dashed ones to the 95% observation-based confidence intervals

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  由图 3(a)可知, 5条混合物射线(R1、R2、R3、R4和R5)在12 h对青海弧菌发光抑制毒性的浓度-效应曲线均位于0.25 h的浓度-效应曲线左侧, 表明这些混合物射线在12 h对青海弧菌的发光抑制毒性在各种浓度水平下均大于0.25 h的毒性, 具有明显的时间依赖特性.例如, 以pEC₅₀作为毒性指标, 在0.25 h时, 5条射线的pEC₅₀值分别是1.696、1.532、1.804、1.589和1.595, 而在12 h时, 5条射线的pEC₅₀值分别是2.096、2.206、2.135、2.207和2.215.

  由图 3(b)可知, 5条混合物射线在2个暴露时间下对于秀丽线虫致死毒性的浓度-效应曲线相互重叠, 在各个浓度水平下的毒性均基本相同, 或者说毒性不随暴露时间的延长而发生变化.结合具有时间依赖特性的青海弧菌毒性结果可知, 低营养级生物长期暴露在农药、代谢产物及它们的混合物环境中可导致更大的危害.

  2.3   敌敌畏和其代谢物的联合毒性

  为了定量地描述各种四元混合物在不同时间点的联合毒性或毒理学相互作用, 以含95%观测置信区间的组合指数^[21]定量地评估各个四元混合物的联合毒性.从四元混合物体系中通过UD-Ray方法选择的5条代表性混合物射线在不同效应或浓度水平下, 对青海弧菌发光抑制毒性终点的组合指数变化见图 4.可知, 5条混合物射线在两个暴露时间下对青海弧菌发光抑制毒性相互作用表现为低浓度加和与高浓度拮抗, 预测的风险阈值浓度低于实际值, 可以更安全地确保其环境浓度阈值, 12 h发生拮抗作用的效应区间明显窄于0.25 h.这表明采取组合指数评估敌敌畏及其代谢产物的水生环境风险是可行的.

  图 4

  

  图 4.  5条混合物射线对青海弧菌的组合指数及95%置信区间随效应水平的变化曲线(ADD为加和; ANT为拮抗)

  Figure 4.  The change of the combination index (—) and its 95% confidence intervals (-○-) to Q67 with the effect level where ADD refers to concentration addition and ANT to antagonism

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  各混合物射线在不同效应水平下对秀丽线虫致死毒性终点的组合指数变化见图 5.从图 5可知, 5条混合物射线在12 h对秀丽线虫的致死毒性相互作用均表现为加和, 而在24 h, 除射线R2和R5在某些效应水平出现一定程度的拮抗外, 另3条混合物射线在所有浓度水平下均为浓度加和.

  图 5

  

  图 5.  5条混合物射线对秀丽线虫的组合指数及95%置信区间随效应水平的变化曲线(ADD为加和; ANT为拮抗)

  Figure 5.  The change of the combination index (—) and its 95% confidence intervals (-○-) to C. elegans with the effect level where ADD refers to concentration addition and ANT to antagonism

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  对于不同混合比的混合物射线均具有浓度加和的体系即全局浓度加和的体系, 其中任意混合物的毒性均可以用浓度加和模型(Concentration addition, CA)有效预测^[39]. 图 5结果表明, 敌敌畏及其代谢产物组成的四元混合物体系对秀丽线虫的12 h致死毒性均可用CA模型有效预测.

  敌敌畏及其代谢产物组成的混合物诱导青海弧菌和秀丽线虫发生毒性相互作用(浓度加和或拮抗).已有研究表明拮抗可能是一些组分共同作用产生的结果, 而不仅仅是由一个关键组分诱导的^{[41, 46]}.例如含抗生素硫酸多粘菌素B的二元、三元、四元混合物体系对青海弧菌的联合毒性研究的结果表明拮抗作用的产生至少需要三个组分(含硫酸多粘菌素B)的共同诱导^[46].因此, 敌敌畏及其代谢产物组成的混合物, 对水生及土壤生物的联合毒性与混合物组分密切相关.

  3.   结论

  以敌敌畏及其三个代谢产物(二氯乙酸、二氯乙醇、磷酸二甲酯)为研究对象, 以水生生物青海弧菌和土壤生物秀丽线虫为受试生物, 测定了4种混合物组分及其混合物的毒性变化, 应用组合指数分析了各混合物的联合毒性规律.结果表明, 敌敌畏对青海弧菌的毒性大于其任意代谢产物的毒性.除二氯乙醇对秀丽线虫的毒性较小外, 敌敌畏和另2种代谢物的毒性相当.各四元混合物对青海弧菌的发光抑制毒性随着暴露时间的延长而增强, 其联合毒性均为低浓度加和与高浓度拮抗, 且拮抗作用存在明显的时间及浓度比依赖.各四元混合物射线对秀丽线虫在两个暴露时间点(12 h和24 h)的致死毒性没有显著性差异, 在12 h的联合毒性均为浓度加和, 而在24 h的联合毒性除射线R2和R5的某些浓度水平下具有轻微拮抗作用外都是浓度加和.

  4.   实验部分

  4.1   试剂

  敌敌畏、二氯乙酸、二氯乙醇、磷酸二甲酯均为优级纯试剂(基本信息参见表 1, 结构式见图 1), 均购买于美国Sigma公司.实验前用Milli-Q超纯水配制储备液并保存在棕色瓶内, 放置于4 ℃冰箱保存备用.

  表 1

  

  表 1  敌敌畏和它的3种代谢产物的CAS号、纯度、分子量及储备液浓度

  Table 1.  The chemical abstracts service register numbers (CAS RN), purities, molecular weights (M.W.) and stock concentrations of dichlorvos and its three metabolites

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  Chemical	CAS RN	Purity/ %	M.W/ (mol·g-1)	Stock/ (g·L-1)
  Dichlorvos (A)	62-73-7	99	221.0	8.605
  2, 2-Dichloroethanol (B)	598-38-9	99	115.0	246.3
  2, 2-Dichloroacetic acid (C)	79-43-6	98	128.9	35.34
  Dimethyl phosphate (D)	813-78-5	98	126.1	20.00

  4.2   对青海弧菌Q67的发光抑制毒性

  青海弧菌Q67由中国科学院生态环境研究中心提供, 菌种的培养与保存参考文献^[47].一倍液体培养基的配方参照文献^[48], 在上述溶液中加入2%的琼脂, 即固体培养基.二倍培养基的配方参考文献配制^[48].

  以不透明的96孔微孔板作为暴露实验的载体, 采用长短期毒性微板分析法^[49], 分别测试4种混合物组分及其各种四元混合物对青海弧菌Q67的急性(暴露0.25 h)和慢性发光抑制毒性(暴露12 h).单个物质或混合物的毒性表达为发光抑制率(E), 计算公式如下:

  $ E = \frac{{I_{0} - I}}{{I_{0}}} $

  (1)

  其中, I₀为空白对照的相对发光单位(relative light unit, RLU)平均值, I为各浓度梯度各3次测定的平均RLU.

  4.3   对秀丽线虫的致死毒性

  野生型秀丽线虫及其食物源脲嘧啶缺陷型大肠杆菌由同济大学医学院惠赠.大肠杆菌的培养、传代, 秀丽线虫的培养、传代, 秀丽线虫的同步化, 空白和对照组的设计, 以及致死率的测算参考文献进行^{[19, 20]}.为了探究暴露时间对致死率的影响, 在本研究中设置了两个暴露时间点(12 h和24 h).单个物质或混合物对秀丽线虫的毒性表达为致死率(L), 计算公式如下:

  $ L = (1 - \frac{{Cen}}{{Ben}}) \times 100\% $

  (2)

  其中, Ben为6个空白在某一特定时间点的秀丽线虫的平均数, Cen为归一化之后实际存活的秀丽线虫的数量.

  4.4   浓度-效应曲线拟合及毒性相互作用分析

  对于单个物质和混合物的浓度-效应曲线, 采用Weibull或Logit函数进行非线性回归, 并求出95%的观测置信区间^{[50, 51]}.非线性拟合及置信区间构建由APTox程序完成^[52], Weibull或Logit拟合函数公式分别如下:

  $ E = 1 - \exp ( - \exp (\alpha + \beta \cdot \lg (c))) $

  (3)

  $ E = \frac{1}{{1 + \exp ( - \alpha + \beta \cdot \lg (c))}} $

  (4)

  其中E表示效应, 即毒物对青海弧菌的发光抑制率或对秀丽线虫的致死率(0≤E≤1), c表示毒物的浓度, α为位置参数, β为斜率参数.拟合优度由决定系数(R²)和均方根误差(RMSE)描述, R²越高或RMSE越低, 拟合效果越好^[53].

  组合指数(CI)被广泛用于混合物毒性相互作用的评价. Liu等^[21]考虑了实验误差与拟合的不确定度, 构建了包括95%观测置信区间的组合指数方法.当置信区间的上限小于1时, 该混合物联合毒性为协同; 当CI置信区间下限大于1时, 该混合物联合毒性为拮抗; 当数值1处于置信区间内时, 则为加和作用.

  4.5   混合物射线的设计

  应用均匀设计射线法(UD-Ray)^[13]从敌敌畏及其三种代谢产物构建的四元混合物体系的大量混合物中选择代表性的5条混合物射线(R1, R2, R3, R4和R5), 根据射线的基本浓度组成计算每条混合物射线中各组分的浓度分数或混合比.每条射线按固定比射线设计安排12个具有不同总浓度的混合物点.

  
  
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  图 1  敌敌畏及其代谢物

  Figure 1  Dichlorvos and its three metabolites

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  图 2  敌敌畏及其3种代谢产物在不同暴露时间的浓度-效应关系图(●敌敌畏(A); ○二氯乙醇(B); ◇二氯乙酸(C); □磷酸二甲酯(D); 实线:拟合曲线; 虚线: 95%置信区间)

  Figure 2  The concentration-response curves of dichlorvos and its three metabolites to Q67 (a) and C.elegans (b) at different exposure times where ●, ○, ◇ and □ refer to dichlorvos (A), dichloroethanol (B), dichloroacetic acid (C) and dimethyl phosphate (D), respectively, the solid curves to the fitted ones and the dashed ones to the 95% observation-based confidence intervals

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  图 3  5条混合物射线的浓度-效应曲线(实线:拟合曲线; 虚线: 95%观测置信区间)

  Figure 3  The concentration-response curves of five mixture rays to Q67 (a) and C.elegans (b) where the solid curves refer to the fitted ones and the dashed ones to the 95% observation-based confidence intervals

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  图 4  5条混合物射线对青海弧菌的组合指数及95%置信区间随效应水平的变化曲线(ADD为加和; ANT为拮抗)

  Figure 4  The change of the combination index (—) and its 95% confidence intervals (-○-) to Q67 with the effect level where ADD refers to concentration addition and ANT to antagonism

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  图 5  5条混合物射线对秀丽线虫的组合指数及95%置信区间随效应水平的变化曲线(ADD为加和; ANT为拮抗)

  Figure 5  The change of the combination index (—) and its 95% confidence intervals (-○-) to C. elegans with the effect level where ADD refers to concentration addition and ANT to antagonism

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  表 1  敌敌畏和它的3种代谢产物的CAS号、纯度、分子量及储备液浓度

  Table 1.  The chemical abstracts service register numbers (CAS RN), purities, molecular weights (M.W.) and stock concentrations of dichlorvos and its three metabolites

  Chemical	CAS RN	Purity/ %	M.W/ (mol·g-1)	Stock/ (g·L-1)
  Dichlorvos (A)	62-73-7	99	221.0	8.605
  2, 2-Dichloroethanol (B)	598-38-9	99	115.0	246.3
  2, 2-Dichloroacetic acid (C)	79-43-6	98	128.9	35.34
  Dimethyl phosphate (D)	813-78-5	98	126.1	20.00

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