English

• 1.   引言

  早在1996年, Barton等^[1]就在DNA分子中观察到了正电荷(空穴)可以沿着DNA链进行传输.这一发现合理地解释了DNA链中离氧化剂很远的碱基也能被氧化损伤的事实^[2~4]. DNA传输空穴的这一特性促进了分子电子器件学的发展, 具有重要的应用价值^[5~8].通常认为, 空穴沿着DNA链传递是空穴通过鸟嘌呤碱基(G)而发生的多步短距离跳跃过程^[9].在形成DNA链的所有四个碱基中, 由于G碱基具有最低的氧化还原电势^[10], 因此空穴最终会被G碱基捕获, 产生鸟嘌呤自由基阳离子(G^•+).如果G^•+没有被DNA周围的溶剂捕获, 可以进一步将空穴传递给下一个G碱基, 产生新的G^•+.一旦新产生的G^•+与周围溶剂如水分子发生相互作用时, 正电荷就会转移给水分子, 发生G^•+脱质子反应形成鸟嘌呤中性自由基G(-H)^•:

  $ {{\rm{G}}^{ \bullet + }} \to {\rm{G}}{\left( { - {\rm{H}}} \right)^ \bullet } + {{\rm{H}}^ + } $

  (1)

  最终导致空穴沿着DNA分子传递中断^[11~14], 由此可见, G^•+脱质子的速率直接影响了空穴传递的效率.因此, 揭示DNA中G^•+脱质子反应机理, 获得重要的动力学参数, 如速率常数和活化能等, 对于如何设计DNA结构作为分子电子器件是非常重要的.

  在双链DNA中, 由于鸟嘌呤胞嘧啶碱基对(GC)中G^•+的N(1)位质子的酸度系数pK_a (3.9)稍小于C碱基N(3)位质子化的pK_a (4.3)^{[15, 16]}, 因此双链DNA中的G碱基被单电子氧化为G^•+后, 质子会首先从G^•+的N(1)位点通过氢键转移到C碱基的N(3)位上, 最终在C碱基上被水分子捕获^[17~19].这一脱质子过程的速率常数约为10⁶到10⁷ s^－1, 完全可以与空穴传递过程竞争, 因而导致空穴在双链DNA中只能传递大约200 Å^[20].

  近来的研究发现高度有序的DNA二级结构—G-四链体具有比双链更高的空穴传递效率, 有望成为比双链DNA更理想的传导空穴的载体^[21~23]. G-四链体(图 1)是富含鸟嘌呤的DNA单链在一价阳离子(如K⁺和Na⁺)的诱导下首先通过G碱基间Hoogsteen氢键形成G-四分体, 并进一步堆积形成的四链结构^[24].如图 1所示, G-四分体中的每个G碱基都与相邻的两个G碱基存在氢键作用, 这使得G碱基中的两个脱质子位点:氨基质子N(2)-H (pK_a＝4.7)和亚氨基质子N(1)-H (pK_a＝3.9)所处的环境非常复杂, 因此G-四链体中脱质子的位点和速率有可能与单个碱基或双链DNA中不一样.我们课题组利用纳秒激光闪光光解技术, 通过瞬态吸收光谱测量、动力学测量、同位素效应实验和pK_a值分析, 确定了G-四链体中G^•+脱质子的位点不是常规的亚氨基质子N(1)-H, 而是环外氨基中未形成氢键的自由质子N(2)-H, 即与溶剂接触的质子N(2)-H^[14].同时测得此位点发生脱质子反应的速率常数约为10⁵ s^－1, 如人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃中为2.1×10⁵ s^－1, 比双链中G^•+脱质子速率常数慢了1~2个数量级. G-四链体中这种慢的N(2)-H脱质子速率势必会减弱与空穴传递的竞争, 提高G-四链体空穴传递的效率.

  图 1

  

  图 1.  人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃单电子氧化后脱质子过程示意图(红色为被氧化的G碱基)

  Figure 1.  Deprotonation process of human telomere G-quadruplex AG₃(T₂AG₃)₃ after one-electron oxidation

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  已有文献表明DNA双链需要必要的水分子来维持π-π堆积的二级结构, 才能够实现传输电荷的功能^[25].同样作为通过π-π堆积形成的DNA二级结构, G-四链体传输电荷的基本条件也应与之相似.在G-四链体的晶体结构的报道中, 已经发现了大量水分子的存在.这些水分子大部分布居在磷酸骨架周围, 少量布居在G碱基的周围.尽管已有理论研究报道了水分子对双链DNA脱质子动力学的影响^{[11, 17, 26]}, 但G-四链体如何与水分子作用, 进而发生N(2)-H脱质子反应的机理还不清楚; 表征这一过程的重要动力学参数—活化能也未见报道.目前的机理研究仅确定了G-四链体独特的脱质子位点和脱质子速率常数.为给基于G-四链体结构而进行的分子电子器件设计提供更多机理上的认识, 需要进一步深入研究G-四链体脱质子动力学.

  在本工作中, 我们在前期研究的基础之上, 对G-四链体中G^•+脱质子过程展开了实验与理论两方面的研究.近期的研究结果已表明^[14], 对于一般的G-四链体, 单电子氧化形成G^•+后会脱掉环外自由的氨基质子N(2)-H, 但当G-四链体loop的碱基序列中含有G碱基时, 单电子氧化G-四链体后loop上G碱基的亚氨基质子N(1)-H也会脱掉, 这一过程类似单个G碱基脱质子反应, 会干扰G-四链体中G^•+脱N(2)-H的研究.为了确保研究的体系只是单纯的G-四链体脱N(2)-H的过程, 我们选取了loop上不含G碱基的人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃作为研究对象.实验上, 使用具有强氧化性的SO₄^•-作为氧化剂氧化G-四链体产生G^•+, 通过纳秒时间分辨的激光闪光光解方法测量了不同温度下G^•+脱质子的瞬态光谱和动力学过程; 进一步利用阿伦尼乌斯(Arrhenius)方程得到了G-四链体中G^•+脱质子活化能的实验值为20.0±1.0 kJ/mol.理论上, 使用密度泛函M062X方法在6-31G(d)基组水平下对这一过程进行了量子化学计算.通过比较不同溶剂化模型下所得到的能垒, 得到了不同数目、位置的水分子对脱质子过程的影响.结合实验得到的活化能, 确定了最合适的溶剂化模型.这一模型下所得到的势能面合理描述了G-四链体脱N(2)-H质子的动力学过程.这些数据不仅提供了一种可能的单电子氧化后G-四链体后G^•+脱氨基质子的机理, 还为更好地理解DNA中空穴传递过程, 发展DNA分子作为分子电子器件提供了有价值的动力学信息.

  2.   结果与讨论

  2.1   圆二色谱(CD)表征G-四链体结构

  由于G-四链体结构在圆二色谱(circular dichroism, 简称CD)上有特征的吸收峰, 因此, CD光谱通常被用来判断DNA序列是否形成了G-四链体结构.根据文献报道^{[14, 24]}, 人体端粒序列AG₃(T₂AG₃)₃在Na⁺环境下可以形成反平行提篮式G-四链体结构.本实验中, 我们使用CD光谱对于单链AG₃(T₂AG₃)₃所形成的G-四链体结构进行了确认.如图S1所示, CD光谱在297和248 nm处有特征的正峰, 而在265 nm处是特征的负峰.这是典型的反平行G-四链体结构的CD光谱, 由此结果可证明AG₃(T₂AG₃)₃在Na⁺环境下的确形成了反平行结构的G-四链体^{[14, 24]}.

  2.2   瞬态吸收光谱方法测量G-四链体单电子氧化后脱质子速率常数和活化能

  瞬态吸收光谱技术可以实时观测激发态分子和瞬态中间体的衰减或生成动力学过程.本工作希望利用该技术, 通过测量不同温度下人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃中G^•+脱质子动力学, 实验上得到G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃单电子氧化后脱质子过程的活化能.实验结果将提供G-四链体中脱质子反应的重要动力学信息, 另一方面也会为理论描述G-四链体中G^•+脱质子机理提供可比较的实验值.

  根据文献[14], 355 nm激光光解过硫酸钠(Na₂S₂O₈)溶液可以产生具有强氧化性的硫酸根自由基负离子(SO₄^•-), 随即, 瞬时产生的SO₄^•-会进一步氧化人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃产生G^•+(Eqs. 2, 3),

  $ {{\rm{S}}_2}{\rm{O}}_8^{2 - }{\rm{ + h}}\nu \to 2{\rm{SO}}_4^{ \bullet - } $

  (2)

  $ {\rm{G}} + {\rm{SO}}_4^{ \bullet - } \to {{\rm{G}}^{ \bullet + }} + {\rm{SO}}_4^{2 - } $

  (3)

  使用355 nm激光光解400 mmol/L的Na₂S₂O₈缓冲溶液(pH＝7.5)后, 溶液在310~550 nm范围内都有吸收, 并且在440 nm处有最强吸收峰, 这和Shafirovich等^[27]所报道的SO₄^•-的吸收光谱一致, 说明光解后的产物是SO₄^•-由于Na₂S₂O₈光解离过程是很快的, 通常只需要≈14 ns, 因此, SO₄^•-的生成动力学并不会干扰之后的G^•+的生成和衰减动力学测量.根据实验中所测得的吸光度, 体系中瞬时产生的SO₄^•-浓度为15 µmol/L.这个浓度远远小于体系中G-四链体的浓度(链浓度为333 µmol/L, 所含G碱基浓度为4 mmol/L).因此, 在这种条件下, SO₄^•-氧化G-四链体的双分子反应变为准一级反应(Eq. 3), 且每个G-四链体中应该只有一个碱基被氧化.原则上, 这个被氧化的碱基可以是G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃中所有的碱基, A、G和T.但是, 由于G碱基在这些碱基中具有最低的氧化还原电势, 空穴传递最终被G碱基捕获.而且, 这个电荷转移过程非常快, 50 ns内即可完成.这使得G-四链体中最终被SO₄^•-氧化的碱基只是G碱基.

  为获得人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃单电子氧化后的脱质子反应活化能, 我们首先观测了300 K时的瞬态吸收光谱.在测量中, 使用高浓度([G]＝4 mmol/L)的G-四链体确保了在此条件下G^•+脱质子反应为决速步^[14]. 图 2a是300 K时人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃被SO₄^•- (15 µmol/L)氧化后1和10 µs的瞬态吸收光谱.如图 2a所示, 在1 µs的光谱上, 观察到三个吸收峰, 分别位于400, 440和480 nm.随着反应的进行, 400, 440和480 nm处的吸收峰衰减, 而640 nm处有新的吸收峰形成(10 µs光谱).由于355 nm激光光解纯的G-四链体溶液并不产生任何信号, 因此可以判断这些信号应与SO₄^•-和G-四链体的化学反应相关.

  图 2

  

  图 2.  (a) 300 K和(b) 280 K时355 nm激光辐照人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃ ([G]＝4 mmol/L)+Na₂S₂O₈ (400 mmol/L)磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)在1 µs(红色)及10 µs(黑色)时刻的光谱; (c) 300 K, 355 nm激光分别辐照人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃ ([G]＝4 mmol/L)+Na₂S₂O₈ (400 mmol/L)(红色)和纯Na₂S₂O₈ (400 mmol/L)(黑色)磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)所得到的440 nm处动力学曲线及(d) 300 K, 355 nm激光辐照人体端粒G-四链体([G]＝4 mmol/L)+Na₂S₂O₈ (400 mmol/L)磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)后, 480和640 nm处的动力学曲线

  Figure 2.  Transient UV-vis absorption spectra for human telomere G-quadruplex AG₃(T₂AG₃)₃ ([G]＝4 mmol/L)+Na₂S₂O₈ (400 mmol/L) in buffer solution (pH＝7.5) after 355 nm laser photolysis at (a) 300 K; (b) 280 K; (c) kinetics traces at 440 nm after excitation of Na₂S₂O₈ (400 mmol/L) solution in the absence or presence of human telomere G-quadruplex ([G]＝4 mmol/L) at 300 K and (d) kinetics traces for G^•+ decay at 480 nm and G(N(2)-H)^• growth at 640 nm at 300 K

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  1 μs时刻吸收光谱上440 nm的吸收峰最可能来自SO₄^•-.首先因为SO₄^•-在440 nm有特征吸收峰.其次, 如图 2c所示, 纯的SO₄^•-在440 nm的自衰减动力学是非常缓慢的, 但当G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃存在时, 440 nm吸收峰的衰减动力学明显加快了, 这说明G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃与SO₄^•-发生化学反应, G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃有效猝灭了SO₄^•-在440 nm的吸收峰.对于1 μs时刻吸收光谱上400和480 nm处的吸收峰, 它们和文献报道的G^•+吸收峰的位置类似, 光谱形状也相同, 因此, 这两个吸收峰主要来自于G^•+的吸收^{[14, 17]}.为归属10 μs时刻吸收光谱上出现的新峰(640 nm), 我们测量了它的生成动力学, 发现它与480 nm处G^•+吸收峰的衰减动力学在时间尺度上是一致的(图 2d), 这暗示着这个新峰可能对应着G^•+的衰减产物.据文献报道^{[14, 15, 17, 28]}, 中性溶液中G^•+衰减的主要路径是快速的脱质子.因此, 推测新峰应该与G^•+脱质子产物有关.考虑到脱质子产物G(N(1)-H)^•在600 nm之上只有平缓的吸收, 而G(N(2)-H)^•在600 nm以上有明显的吸收峰, 因此我们将640 nm处的新峰归属为G^•+脱质子产物G(N(2)-H)^•.这些归属与之前报道的结果完全一致^[14].

  正如Eq. 1所示, G^•+的衰减对应着中性自由基G(N(2)-H)^•的生成, 因此G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃中脱质子速率常数可以通过拟合G(N(2)-H)^•的生成动力学而获得. 图 3a展示了300 K时640 nm处光谱的生成动力学曲线.这条动力学曲线可以用双指数方程拟合得到一个快的生成过程(258 ns)和一个慢的生成过程(4.0 μs).这一拟合结果与之前文献报道的数据相近, 因此我们也将快的生成过程归属为SO₄^•-氧化G碱基生成G^•+的过程, 慢的生成过程归属为G^•+脱质子过程.通过拟合640 nm处吸收峰慢的生成动力学曲线, 得到了300 K时G-四链体中G^•+脱N(2)-H的速率常数为2.5×10⁵ s^－1, 与之前报道^[14]的数据相近.

  图 3

  

  图 3.  水溶液(a)和重水溶液(b)中, 不同温度下测得的640 nm处光谱的归一化动力学曲线及水溶液(c)和重水溶液(d)中, 脱质子速率常数随温度的变化(黑色方框)及其拟合曲线(红色直线)

  Figure 3.  Normalized kinetic traces at 640 nm at different temperatures in (a) H₂O buffer and (b) D₂O buffer, arrhenius plots of the deprotonation rate constants at temperatures in the range of 280~300 K in steps of 5 K, with the activation energy indicated in (c) H₂O buffer and (d) D₂O buffer. Solid line is the fitting line

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  进一步, 我们做了不同温度下脱质子速率常数的测量.温度变化的测量区间选取在室温附近280~300 K, 每隔5 K进行一次测量.在这一区间内, CD光谱显示人体端粒G-四链体构型保持稳定^[29], 瞬态吸收光谱显示G-四链体被单电子氧化后衰减过程也没有发生变化. 图 2b给出了280 K时人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃ ([G]＝4 mmol/L)被SO₄^•- (15 µmol/L)氧化后的瞬态吸收光谱.与300 K时的瞬态吸收光谱相比较, 280 K时得到1 μs的光谱上也观察到三个吸收峰, 位于400, 440和480 nm; 随着反应的进行, 10 µs光谱也显示为400 nm, 440 nm和480 nm处的吸收峰衰减, 而640 nm处有新的吸收峰生成.这表明在280 K时, 人体端粒G-四链体被SO₄^•-氧化后仍然首先形成G^•+, 随即G^•+脱掉环外自由的氨基质子N(2)-H形成中性自由基G(N(2)-H)^•. 280 K时瞬态吸收光谱控制实验证实了在280~300 K的温度变化范围内, 我们所测量的640 nm处光谱的生成动力学数据代表了SO₄^•-氧化G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃和G-四链体中G^•+脱质子形成G(N(2)-H)^•的过程.

  图 3a还给出了280~295 K下测得的640 nm光谱的生成动力学曲线.从图中可以看出, 随着反应温度的降低, 脱质子速率逐渐变慢.进一步通过拟合640 nm处慢的生成动力学过程, 得到不同温度下的G-四链体中G^•+脱质子速率常数k(H₂O)(表 1).根据阿伦尼乌斯方程, 反应速率常数与温度有如下关系:

  $ {\rm{ln}}k={\rm{ln}}A - {E_{\rm{a}}}/RT $

  (4)

  表 1

  

  表 1  水和重水缓冲溶液中, 不同温度下人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃中G^•+脱质子速率常数

  Table 1.  Deprotonation rate constants of G^•+ in human telomere G- quadruplex AG₃(T₂AG₃)₃ at different temperatures in H₂O and D₂O buffer

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  T/K	k(H2O)/×105 s－1	k(D2O)/×105 s－1	KIE
  280	1.5±0.1	0.9±0.05	1.7
  285	1.7±0.1	1.1±0.1	1.5
  290	1.9±0.1	1.3±0.1	1.5
  295	2.3±0.1	1.5±0.1	1.5
  300	2.5±0.1	1.8±0.1	1.4

  如图 3c所示, lnk对1000/T作图具有很好的线性关系, 由直线的斜率可以得到脱质子活化能E_a(H₂O)＝20.0±1.0 kJ/mol.人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃中G^•+脱N(2)-H的活化能与之前报道的1-甲基脱氧鸟嘌呤脱N(2)-H的活化能基本相同(19.9±1.0 kJ/mol)^[30].这两者数据一致说明了G-四链体结构(G-四分体的堆积及G-四分体中G碱基之间的氢键)不会对G^•+脱氨基质子的势垒产生大的影响.实际上, 单电子氧化G-四链体之后, G-四链体中只会产生一个失电子中心, 即G^•+, 并且理论计算已经证明这个失电子中心主要局域在G-四分体中的某一个G碱基之上^[31]; 在这种情况下, G-四链体中G^•+的脱氨基质子过程的活化能应该和自由G碱基的类似, 因而才会在G-四链体中得到与单个碱基脱氨基质子类似的活化能.这一结论为进一步建立G-四链体中G^•+脱质子的理论模型提供了指导.

  我们还在重水中测量了G-四链体中G^•+脱质子速率常数k(D₂O)及活化能E_a(D₂O).如表 1和图 3b所示, 在280~300 K的温度区间内, 重水中G-四链体中G^•+脱质子速率常数k(D₂O)明显变慢, 表现出1.4~1.7的动力学同位素效应[KIE＝k(H₂O)/k(D₂O)].其中, 295 K时的KIE值与前期G-四链体脱质子工作得到的数据相同, 也与之前文献报道的单电子氧化自由G碱基后脱质子研究中得到的数据(KIE＝1.7)相近.不同温度下的KIE值进一步证明了我们所测量的动力学过程始终对应着G^•+脱质子反应. 图 3d显示了重水中G^•+脱质子的速率常数随温度的变化规律也遵循阿伦尼乌斯方程.由此, 也确定了重水中脱质子活化能[E_a(D₂O)＝22.2±0.9 kJ/mol], 比在水中高约2 kJ/mol.

  2.3   密度泛函(density functional theory, 简称为DFT)方法计算G-四链体单电子氧化后脱质子过程

  为了深入理解G-四链体中G^•+脱质子过程, 揭示溶剂水分子与G-四链体相互作用机理, 我们使用了密度泛函M062X方法在6-31G(d)基组水平下对这一过程进行了量子化学计算.之所以选用这样的泛函和基组, 首先因为密度泛函M062X已经被证明在计算包含自由基的开壳层体系的构型及能量时可以取得较好的结果^{[32, 33]}; 其次, 我们也比较了其它密度泛函, 如B3LYP和WB97XD, 在相同的基组水平下(相同的初始构型)得到的计算结果, 发现这些密度泛函得到的势垒和实验值相差很大(见图S2);最后, 我们还使用了带有弥散的6-31+G(d)基组对计算结果进行了单点能校正, 经过校正的能垒和实验值相差增大, 因此本文只讨论了M062X泛函在6-31G(d)基组水平下计算的结果.

  为了缩短计算机时, 选用了G-四分体平面(不包含磷酸和戊糖部分)作为简化的模型来研究G-四链体中G^•+脱质子过程. G-四链体中G^•+脱氨基质子的活化能与1-甲基鸟嘌呤脱质子活化能一致的实验事实表明: G-四链体的构型不会对G^•+脱质子活化能产生大的影响, 因此这种体系上的简化处理应该是合理的^{[14, 30]}.为了尽可能接近真实体系(四个G碱基在Na⁺的稳定下通过Hoogsteen氢键连接), 在G-四分体的中心添加了Na⁺.计算结果表明Na⁺的添加有助于反应物、过渡态、产物构型计算的收敛.同时, 因为Na⁺离子的添加, 被氧化后的G-四分体计算模型体系中存在着两个正电荷.初步的电荷分析结果(表S1)表明一个正电荷主要分布在Na⁺ (0.854|e|), 另一个则主要分布在G-四分体的一个G碱基上(0.948|e|).因此, 本工作对于G-四链体脱质子环境的理论模拟是围绕这个G^•+的微环境展开的.连续溶剂化模型是反映溶剂化效应的一种常见方法.除了这种方法, 在目标分子的周围添加显性水分子的方法也逐渐被采用^[34~36], 并已经在G、GC碱基对等体系的量子化学计算中取得了与实验一致的合理结果^{[35, 36]}.本工作借鉴了前人的研究经验, 通过添加显性水分子来模拟G^•+脱质子位点附近的溶剂效应, 同时使用极化连续介质模型(简称PCM, 连续溶剂化模型的一种)来模拟远离脱质子位点的溶剂化效应.

  应用这两种方法去处理G^•+的溶剂化效应时, 显性水分子的位置和个数是需要重点考虑的.首先, 我们没有在G₁中(即G^•+)的N(1)-H, N(2)-H_c, O(6)和N(7)的附近添加与之相互作用的显性水分子.尽管N(1)-H和N(2)-H_c在脱质子位点[自由的氨基质子N(2)-H_a]附近, 但它们与G₂碱基形成了氢键, 因此没有空间再添加水分子; 同样, 远离脱质子位点的O(6)和N(7)也与G4碱基形成了氢键, 也没有空间添加水分子.其次, 我们也忽略了C(8)-H和N(9)附近的水分子对微环境的贡献.一方面由于C(8)-H和N(9)都远离脱质子位点, 与它们作用的水分子应该对脱质子过程的影响不大; 另一方面也因为C(8)-H和N(9)位点自身的特点.根据文献报道, 水分子可与C(8)-H形成一个相当弱的氢键, 键长有3.3 Å.但同时, 这个水分子还可以与磷酸基团中的氧原子形成更强的氢键.显然, 这个水分子对磷酸骨架的影响应比对G碱基的影响更强; 对于N(9)位点, 它在真实的环境中与戊糖基相连, 也会导致没有空间添加水分子.

  根据G-四链体晶体结构的文献报道^{[37, 38]}, 水分子主要与G碱基的N(2)-H和N(3)形成强的氢键.因此, 我们重点考虑了与N(2)-H_a和N(3)形成强氢键的两个水分子的贡献, 并建立了3H₂O-PCM溶剂模型.如图 4所示, 两个水分子W1和W2分别放置在G-四分体中G^•+脱质子位点N(2)-H_a和N(3)附近, W1与W2之间通过氢键连接; 在远离G^•+的位置还放置了第3个水分子W3, 它与W1和G^•+都不形成氢键, 只与第二个水分子W2形成氢键.添加这个水分子的目的是为了帮助W2将脱掉的质子局域在W2上.计算结果发现如果没有W3, 质子将无法从G^•+上脱除, 脱质子产物也不能形成(详见下文).

  图 4

  

  图 4.  3H₂O-PCM模型中, 在M062X/6-31G(d)理论水平上优化得到的G-四分体中G^•+脱质子过程中反应物(R)、过渡态(TS)以及产物(P)的结构和所对应的相对能量(所有的能量都经过零点能矫正, 并且以反应物的能量为零点进行校正; 其中碳、氧、氮和氢原子以及钠离子分别用灰色、红色、蓝色、白色和粉色小球表示)

  Figure 4.  Optimized structures and relative energies obtained at the M062X/6-31G(d) level for G^•+deprotonation in a G-quartet under the 3H₂O-PCM model (all energies given are relative to the reactant complex. Carbon, oxygen, nitrogen, hydrogen atoms and sodium ion are denoted with gray, red, blue, white and pink balls, respectively)

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  在3H₂O-PCM溶剂模型下, 我们优化了G-四分体中G^•+脱质子过程中的反应物、过渡态以及产物的结构, 并得到了每个结构所对应的相对能量, 构建了脱质子过程的反应势能面. 图 4展示了这些结果.被氧化后的G碱基和3个H₂O首先通过氢键形成了一个复合物.随着反应的进行, 被氧化的G碱基中的N(2)-H_a键的键长逐渐变长, 质子逐渐靠近水分子W1, 这促使W1中的一个氢原子H_b逐渐远离W1, 靠近W2中的氧原子.随着这个氢原子的继续移动, 过渡态结构形成.在这个过渡态结构中, H_a还未脱离N(2), H_b与W1和W2均不成键.经过这个过渡态结构后, H_b与W2成键, 形成H₃O⁺, H_a与W1的氧原子成键, 完全脱离N(2)原子, 形成了脱质子产物G(N(2)-H)^•.为了确认势能面中正电荷在各物种上的分布, 我们做了自然键轨道(Natural Bond Orbital, 简称为NBO)分析.如表 2所示, 在反应初始时刻, 质子几乎都分布在G^•+(0.910|e|), 周围水分子保持中性(0.059|e|); 当形成过渡态分子时, 质子被周围的水分子W1和W2所共享; 当形成脱质子产物时, 质子已经被转移到W2上, 形成H₃O⁺.这一质子迁移路径, 清楚地描述了质子从G-四分体的G^•+上转移到第一层水的过程.考虑到质子在纯水中的迁移效率极高, 几乎无势垒^{[39, 40]}, 因此G^•+脱N(2)-H过程主要克服的势垒就是质子转移到第一层水的能垒.正如所期待的那样, 理论计算的能垒和我们实验所测得的活化能仅相差6.4 kJ/mol, 基本一致.这表明使用3个水分子和PCM模型相结合的方法来模拟G-四链体中G^•+脱质子过程的环境是合理的, 也说明此模型下所建立的势能面是可以描述G-四链体中G^•+脱N(2)-H的过程.

  表 2

  

  表 2  3H₂O-PCM模型下G-四分体中G^•+脱质子过程中各结构的电荷分布(|e|)

  Table 2.  Charge distribution (|e|) of species in G^•+ deprotonation in the G-quartet in 3H₂O-PCM model

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  	G•+ (in a G-quartet)	W1	W1…H…W2	W2	W3
  R	0.910	0.013	—	0.004	0.042
  TS	0.187	—	0.738	0.108	0.069
  P	0.159	0.068	—	0.702	0.089

  为了进一步验证3H₂O-PCM模型的合理性, 我们还比较了3H₂O-PCM模型和其它几个水分子模型的结果.首先, 将3H₂O-PCM模型中的水分子W3去除, 保留W1和W2(即不改变添加位置), 尝试建立2H₂O-PCM溶剂化模型.然而, 在此模型下, 未能得到过渡态和脱质子产物的优化构型.尽管多次尝试不同的过渡态和产物的初始结构, 但它们在多步优化后总是收敛到反应物的构型.这一结果充分说明去除W3会影响到G^•+脱质子过程.在表述G-四链体中G^•+脱质子过程时, 必须添加水分子W3.其次, 考虑到相邻碱基G₂中的C(8)-H距离脱质子位点较近, 与它形成氢键的水分子是否也需要包含在溶剂化模型中?如上文所述, C(8)-H与水分子形成的氢键有3.3 Å.因此, 我们尝试在距离C(8)-H位置3.3 Å处添加水分子W4.然而, 无论水分子放置的方向如何, 计算结果显示添加的水分子W4总是会逐渐靠近C(8)-H, 并与C(8)-H、W1形成氢键.由于W4恰好处在质子迁移路径(G^•+→W1→W2)的反方向上, 使得W1传输质子的能力削弱, 导致了计算值与实验结果不符合(图S3).由此可见, 在G₂的C(8)-H附近, 在不考虑磷酸骨架的情况下, 添加一个符合G-四链体晶体结构数据的水分子是不可行的.我们也尝试了在其它远离脱质子位点处添加水分子, 因没有影响到脱质子路径, 计算结果与3H₂O-PCM结果相似, 这说明没有必要增加更多这类远离脱质子位点的水分子了.这些结果进一步证明了3H₂O-PCM模型的合理性.

  需要指出的是, 我们的计算没有考虑G-四分体之间的π-π堆积, 也没有考虑戊糖和磷酸基团对G^•+脱质子势垒的影响, 这些因素可能会对理论估计的势垒值有一定影响.如果运用分子动力学模拟或量子力学与分子模拟结合的方法对真实体系进行计算, 可能会得到与实验测量值更接近的结果.但模型体系所得到的能垒值与实验值基本吻合, 说明重点考虑脱质子位点微环境的量化计算结果基本反映了G-四链体中G^•+脱N(2)-H质子的过程.

  3.   结论

  利用纳秒激光闪光光解技术, 结合量子化学计算方法, 研究了人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃中G^•+脱质子反应.实验上观测到300 K时自由基阳离子G^•+和中性自由基G(N(2)-H)^•的瞬态吸收光谱, 确定了在G-四链体中G^•+脱质子生成G(N(2)-H)^•的反应过程; 通过测量640 nm处吸收峰的生成动力学, 拟合得到了300 K时G-四链体被单电子氧化后脱质子速率常数为2.5×10⁵ s^－1; 进一步测量不同温度下的脱质子速率常数, 并根据阿伦尼乌斯公式计算得到了G-四链体中G^•+脱质子的活化能为20.0±1.0 kJ/mol.为确保变温实验的可靠性, 还测量了280 K时人体端粒G-四链体单电子氧化后的瞬态吸收光谱, 发现在280 K时的光谱与室温下获得的光谱一致.变温瞬态吸收光谱的结果说明在温度变化区间G-四链体被单电子氧化后仍然是脱掉环外自由的氨基质子N(2)-H.此外, 还得到了重水中脱质子速率常数和活化能[E_a(D₂O)＝22.2±0.9 kJ/mol].明显的KIE值验证了不同温度下, 所测量的动力学过程始终是脱氨基质子N(2)-H过程.理论上, 为了深入理解G-四链体中G^•+脱质子过程, 采用了3个显性水分子和连续溶剂化模型相结合的方法来模拟G-四链体中G^•+脱质子过程, 建立了G-四链体中G^•+脱质子模型: 3H₂O-PCM模型.在此模型下, 使用M062X密度泛函, 在6-31G(d)基组水平下计算得到了G-四链体中G^•+脱质子势能曲线, 并确定了脱质子的势垒为26.4 kJ/mol.此外, 还通过建立不同水分子模型研究了水分子数目和位置对G-四链体中G^•+脱质子过程的影响, 理论上验证了3H₂O-PCM模型的合理性.结合实验上相吻合的活化能值, 3H₂O-PCM模型计算结果清楚地揭示了G-四链体中G^•+脱质子过程的物理图像, 也为DNA分子在电子器件方面的应用提供了重要的动力学信息.

  4.   实验部分

  4.1   样品以及G-四链体的合成

  DNA寡核苷酸人体端粒序列AG₃(T₂AG₃)₃是从生工生物工程(上海)股份有限公司购买, 纯度为HPLC级别.单链的浓度通过测定260 nm处的吸光度然后通过朗伯比尔定律计算得到, 人体端粒序列的摩尔消光系数为228500 L•mol^－1•cm^－1. G-四链体是通过如下方法合成:首先将人体端粒寡核苷酸溶解在100 mmol/L的pH＝7.5磷酸钠缓冲溶液中, 然后加热至90 ℃并且在该温度下持续加热10 min, 随后以0.5 ℃/min的速度冷却至室温, 最后将该溶液在4 ℃的冰箱中过夜.形成的G-四链体可以用圆二色谱(CD)来确定.磷酸钠缓冲溶液是从北京索莱宝科技有限公司购买, 过硫酸钠是从Sigma-aldrich公司购买, 所有的样品都是直接使用, 没有进行再次处理.

  4.2   圆二色谱(CD)

  CD光谱是通过Jasco-815分光偏振计获得.测量中我们使用1 cm光程的石英比色皿, 并且以1000 nm/min的速度来采集200~320 nm的光谱, 重复三次, 最后所得到的数据是三次测量的平均值.在测量中, G-四链体的浓度为20 µmol/L, 缓冲溶液被单独测量并且作为本底从实际样品所测得的光谱中扣除, 以保证得到的光谱只是G-四链体本身的光谱.

  4.3   激光闪光光解

  我们通过使用配备有Nd:YAG激光器的纳秒激光闪光光解仪Edinburgh LP920得到纳秒时间分辨的瞬态吸收光谱.样品被355 nm脉冲激光激发, 分析检测光由450 W脉冲氙灯产生, 装备有光电倍增管的单色器可以采集300~700 nm的光谱用来分析, 所得到的数据用在线软件LP920分光光度计来分析.为了确保所得到的实验数据的准确性, 每次实验得到的数据都是重复三次取平均值.

  4.4   不同温度下样品的制备

  将含有G-四链体([G]＝4 mmol/L)和Na₂S₂O₈ (400 mmol/L)的溶液放入液氮低温恒温器(牛津仪器Optistat DN), 通过温度控制器设定到实验所需要的温度恒温1 h, 以保证低温恒温装置反应腔体和样品温度达到稳定, 待温度稳定后进行激光闪光光解实验.

  4.5   理论计算方法

  反应物、过渡态和产物的优化构型、能量及自然键轨道(NBO)结果均在M062X/6-31G(d)理论水平上计算获得.通过振动频率分析确认反应物和产物无虚频, 过渡态有且仅有一个虚频.在此基础之上, 依据反应途径的内禀反应坐标(IRC)理论, 进行了相应的极小能量途径计算, 以正确关联过渡态和相应的反应物和产物, 所得到的能量都经过了零点能矫正.计算中的溶剂效应则采用显性水分子结合经典的极化连续介质模型(PCM)进行模拟.我们还使用了带有弥散的6-31+G(d)基组对计算结果进行了单点能校正.表S2显示经过校正的能垒与实验值相差增大.此外, 我们也使用了其它密度泛函, 如B3LYP和WB97XD, 在相同的基组水平下对G-四链体中G^•+脱质子反应进行了研究(计算的初始构型和使用M062X泛函时保持一致).但是计算所得到的脱质子反应势垒(B3LYP: 36.0 kJ/mol; WB97XD: 42.3 kJ/mol)和实验值相差很大(见图S2).这些结果说明我们选用密度泛函M062X方法在6-31G(d)基组水平计算G^•+脱质子过程是合理的.所有的计算都是通过Gaussian 09程序包进行的^[41].

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  图 1  人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃单电子氧化后脱质子过程示意图(红色为被氧化的G碱基)

  Figure 1  Deprotonation process of human telomere G-quadruplex AG₃(T₂AG₃)₃ after one-electron oxidation

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  图 2  (a) 300 K和(b) 280 K时355 nm激光辐照人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃ ([G]＝4 mmol/L)+Na₂S₂O₈ (400 mmol/L)磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)在1 µs(红色)及10 µs(黑色)时刻的光谱; (c) 300 K, 355 nm激光分别辐照人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃ ([G]＝4 mmol/L)+Na₂S₂O₈ (400 mmol/L)(红色)和纯Na₂S₂O₈ (400 mmol/L)(黑色)磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)所得到的440 nm处动力学曲线及(d) 300 K, 355 nm激光辐照人体端粒G-四链体([G]＝4 mmol/L)+Na₂S₂O₈ (400 mmol/L)磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)后, 480和640 nm处的动力学曲线

  Figure 2  Transient UV-vis absorption spectra for human telomere G-quadruplex AG₃(T₂AG₃)₃ ([G]＝4 mmol/L)+Na₂S₂O₈ (400 mmol/L) in buffer solution (pH＝7.5) after 355 nm laser photolysis at (a) 300 K; (b) 280 K; (c) kinetics traces at 440 nm after excitation of Na₂S₂O₈ (400 mmol/L) solution in the absence or presence of human telomere G-quadruplex ([G]＝4 mmol/L) at 300 K and (d) kinetics traces for G^•+ decay at 480 nm and G(N(2)-H)^• growth at 640 nm at 300 K

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  图 3  水溶液(a)和重水溶液(b)中, 不同温度下测得的640 nm处光谱的归一化动力学曲线及水溶液(c)和重水溶液(d)中, 脱质子速率常数随温度的变化(黑色方框)及其拟合曲线(红色直线)

  Figure 3  Normalized kinetic traces at 640 nm at different temperatures in (a) H₂O buffer and (b) D₂O buffer, arrhenius plots of the deprotonation rate constants at temperatures in the range of 280~300 K in steps of 5 K, with the activation energy indicated in (c) H₂O buffer and (d) D₂O buffer. Solid line is the fitting line

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  图 4  3H₂O-PCM模型中, 在M062X/6-31G(d)理论水平上优化得到的G-四分体中G^•+脱质子过程中反应物(R)、过渡态(TS)以及产物(P)的结构和所对应的相对能量(所有的能量都经过零点能矫正, 并且以反应物的能量为零点进行校正; 其中碳、氧、氮和氢原子以及钠离子分别用灰色、红色、蓝色、白色和粉色小球表示)

  Figure 4  Optimized structures and relative energies obtained at the M062X/6-31G(d) level for G^•+deprotonation in a G-quartet under the 3H₂O-PCM model (all energies given are relative to the reactant complex. Carbon, oxygen, nitrogen, hydrogen atoms and sodium ion are denoted with gray, red, blue, white and pink balls, respectively)

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  表 1  水和重水缓冲溶液中, 不同温度下人体端粒G-四链体AG₃(T₂AG₃)₃中G^•+脱质子速率常数

  Table 1.  Deprotonation rate constants of G^•+ in human telomere G- quadruplex AG₃(T₂AG₃)₃ at different temperatures in H₂O and D₂O buffer

  T/K	k(H2O)/×105 s－1	k(D2O)/×105 s－1	KIE
  280	1.5±0.1	0.9±0.05	1.7
  285	1.7±0.1	1.1±0.1	1.5
  290	1.9±0.1	1.3±0.1	1.5
  295	2.3±0.1	1.5±0.1	1.5
  300	2.5±0.1	1.8±0.1	1.4

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  表 2  3H₂O-PCM模型下G-四分体中G^•+脱质子过程中各结构的电荷分布(|e|)

  Table 2.  Charge distribution (|e|) of species in G^•+ deprotonation in the G-quartet in 3H₂O-PCM model

  	G•+ (in a G-quartet)	W1	W1…H…W2	W2	W3
  R	0.910	0.013	—	0.004	0.042
  TS	0.187	—	0.738	0.108	0.069
  P	0.159	0.068	—	0.702	0.089

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