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• 1.   引言

  前沿新材料石墨烯(Graphene)是由碳原子通过sp²杂化轨道紧密排列组成的六边形蜂窝状二维晶体平面结构, 具有比表面积大、强度高、化学稳定性好、可修饰性强以及导电性好等优异性能, 被广泛应用于储氢材料、传感器^{[1, 2]}、电池^[3~5]、催化剂^[6]和电极材料^[7~13]等领域^[14].根据石墨烯材料^[15]的应用领域和范围的不同, 制备方法也不同, 石墨烯的制备技术发展迅速, 目前制备石墨烯的主要方法有机械剥离法、氧化石墨还原法、电化学法以及化学气相沉积(CVD)等.其中, 化学气相沉积(CVD)法可制备高质量、大面积的石墨烯, 结构缺陷小、性能优异, 可实现材料形状的控制, 获得越来越多的关注和应用^{[16, 17]}.石墨烯独特的二维结构赋予了其突出的物化和机械性能, 但二维石墨烯薄膜存在易碎及难以转移等问题, 而具有三维(3D)宏观立体结构的3D石墨烯不仅能够保持其固有性能, 更能将二维石墨烯的理化性能由纳米尺度扩展到宏观领域, 如利用模板CVD法合成的3D石墨烯泡沫^[18]和结合微纳加工工艺制备的3D可控石墨烯材料^[19]、单层石墨烯薄片的自组装构建的3D石墨烯膜^[20]以及3D打印技术制备的石墨烯支架材料^[21]等, 拓展了三维石墨烯材料在各个领域的应用^{[22, 23]}.

  石墨烯材料在生物医学技术方面具有高效作用, 近年来, 石墨烯及其衍生物在生物医学领域中被广泛应用于药物和基因输送、生物成像、生物检测、干细胞工程和肿瘤治疗等方面的研究中^[24~27].氧化石墨烯(Graphene Oxide, GO)表面存在的大量羧基基团使其能够被有效地功能化修饰. Liu等^[28]开创性地利用支化的聚乙二醇(PEG)对氧化石墨烯进行修饰, 制备纳米级药物载体, 通过非共价键π-π堆积的物理作用运载水不溶性的抗癌药物, 提供了石墨烯材料在药物输送方面的应用基础, 受到了许多研究者的关注, 相继开展了石墨烯材料的表面改性和功能化研究, 提高材料的生物相容性以及载体的药物负载率^[29].另一方面, 石墨烯结合阳离子型聚合物如聚乙烯亚胺、壳聚糖等亦被广泛用于基因载体的研究中, 研究表明, 聚合物修饰的石墨烯具有良好的生物相容性和较高的转染效率^{[30, 31]}.石墨烯独特的电化学和机械性能以及其特征的拉曼光谱G峰^{[32, 33]}, 促进了石墨烯量子点材料和石墨烯荧光复合材料的创新研究^[34], 使其在生物细胞成像和检测领域中大放异彩^[35~38].此外, 研究人员发现, 当石墨烯与细胞相互作用时, 会使得石墨烯中分布的电荷重新排列, 改变原子振动的能量, 利用拉曼光谱仪检测其变化, 可用于区分活跃的癌细胞和普通细胞, 在癌症早期诊断中具有潜在的应用^[39].在组织工程的应用上, 由于石墨烯材料具有高弹性、高强度及高柔韧性, 并且可以进行各种功能化修饰, 可用于水凝胶、纤维、薄膜等组织工程支架材料中^{[40, 41]}.我们课题组^[42]采用细胞生物学、材料学等手段, 系统研究了二维石墨烯薄膜对海马神经元细胞发育的影响, 发现石墨烯不仅对神经细胞具有良好的生物相容性, 且对神经突起的形成和生长具有显著的促进作用.进一步地, 我们首次提出了三维石墨烯生物支架的概念^[18], 系统地研究了其生物相容性、对神经细胞炎症与迁移行为特征的影响, 阐释了支架表面的微纳结构对神经干细胞定向分化行为的影响^[43~45].我们研究发现, 相对于二维石墨烯, 三维石墨烯支架具有多孔结构、合适的力学性能和良好的生物相容性, 不仅能促进神经干细胞的粘附、增殖, 更能促进神经干细胞向神经元细胞和星状胶质细胞分化.目前, 研究人员正深入地开展石墨烯材料在体外与体内二个层次对其诱导干细胞向成骨、成神经、成心肌、成脂分化等研究工作.

  随着石墨烯越来越多地被运用到医学领域, 为医学带来新的机遇和思路.然而, 材料在环境中的持久性和长期积累成了关键问题, 因此, 石墨烯的生物应用仍然存在诸多挑战和需解决的问题^[46].碳材料中, 相比于碳纳米管(CNTs)的生物降解, 石墨烯材料降解行为的研究还相对较少, 而石墨烯材料的降解在其未来应用于生物医学方面具有重要指导意义.因此石墨烯在医学应用中的生物相容性和生物可降解性是研究人员极其关注的热点.本文结合最新研究进展, 阐述石墨烯材料的生物安全和可降解性的研究进展, 有助于为石墨烯材料的体内研究提供重要的研究基础和指导意义, 促进石墨烯在生物医学领域的应用.

  2.   石墨烯的生物安全性和降解性

  作为生物医学材料的先决条件是无毒性和良好的生物相容性, 石墨烯及其衍生物由于采用不同的合成方法, 在合成过程中生物相容性亦有可能发生改变, 研究表明, 石墨烯材料的结构、浓度、表面修饰、尺寸和分散形态等都一定程度上影响着材料对细胞的毒性.目前, 常用的手段是通过表面修饰、改变空间构型、调控电子结构、构成复合材料等来改变材料的性能.在医学领域被研究最多的即是氧化石墨烯(GO), 其表面带有大量亲水性含氧官能团, 如OH、COOH、C＝O等, GO由于表面含氧量增加, 具有更好的亲水性表面, 显示出更好的生物相容性和水溶液稳定性, 同时有利于化学功能化修饰.良好的表面修饰对提高材料的生物相容性也是十分必要的, GO表面经过聚合物如聚乙二醇(PEG)、壳聚糖、葡聚糖或蛋白等修饰后, 都明显减少了毒性, 增强了材料的生物相容性; 同时, 石墨烯材料的尺寸对细胞毒性也有一定的影响, Zhang等^[47]报道了结构规整、超小尺寸(34 nm)的石墨烯纳米薄片, 与尺寸分别约为200和150 nm的石墨烯纳米薄片进行比较, 发现尺寸越小, 材料对细胞的毒性越小, 生物相容性越好; 然而, 当GO尺寸过小时, 也可能会抑制细胞的存活, Wang等^[48]发现在0.005 mg/mL浓度下, 330 nm的粒径范围内, 大于20 nm的石墨烯纳米粒子对小鼠胚胎干细胞具有较好的生物相容性, 而小于20 nm的石墨烯纳米粒子可能具有能参与抑制细胞存活机制的尺寸和物理性质, 从而导致细胞的死亡.在组织工程应用中, 我们组^[18]报道的三维石墨烯泡沫具有多孔结构, 用于小鼠神经干细胞的生长和增殖, 多孔结构为细胞提供了良好的粘附底物, 三维支架材料具有高度的生物相容性, 能为细胞提供良好的生长环境.此外, 由于GO良好的稳定性, 通常被用于功能复合制备复合型支架, 用于提高复合支架的强度和稳定性, 降低生物可降解材料的降解速率, 提供更持久的细胞生长周期, 促进细胞生长、增殖, 如与生物可降解的壳聚糖或聚己内酯(PCL)进行复合获得GO-CS或GO-PCL复合支架^{[49, 50]}, 充分发挥GO和生物可降解高分子的优点, 获得具有良好生物相容性、稳定的复合支架.

  体内实验方面, 目前已有实验表明未经修饰的石墨烯在肺、肝、脾、肾中有积累现象的发生.在体内肝脏、肾脏滞留较长时间后, 尽管材料最后可经肾脏和粪便排出体外, 降低对动物体的毒性, 然而已有体内实验表明石墨烯材料具有慢性毒性, Singh等^[51]发现了GO在小鼠体内诱发了肺部血栓栓塞. Zhang等^[52]通过静脉注射, 将GO材料注入小鼠体内, 发现GO主要聚集在小鼠的肺部, 当其浓度达到10 mg/kg时会引起炎症.然而, 通过PEG修饰后的GO注入小鼠体内后, 在肝脏和脾脏处聚集后三个月内未引起明显的损伤和炎症^[53]. Sasidharan等^[54]分别对未修饰、羧基化和PEG修饰的少层的石墨烯片(FLG), 即FLG、FLG-COOH和FLG-PEG在瑞士白化病小鼠体内毒性、器官分布和免疫反应进行了三个月时间的研究, 与其它研究结果相一致, 动物体内跟踪实验表明注射24 h后石墨烯主要在肺部聚集, 其次是脾脏、肝脏和肾脏, 在脑部和心脏等部位没有聚集.其中, FLG和FLG-COOH引起了肺、脾、肝和肾组织结构的损坏, 而FLG-PEG在三个月时间内没有引起明显的毒性和器官损伤.此外, 在石墨烯薄片层上共价键修饰右旋糖DEX, 通过¹²⁵I进行示踪, 发现材料也没有引起明显的毒性^[53]. Duch等^[55]研究发现石墨烯材料的不同形态影响着其在肺部的生物安全性, 相比于普朗尼克分散的石墨烯, 聚集态的石墨烯引起了肺部损伤.

  除了上述通过修饰手段和改变结构和尺寸来提高生物安全性, 当前, 我们更希望石墨烯材料应用于体内后可以实现体内生物降解, 而不会长期滞留在组织中, 有利于应用到临床中的体内移植.因此, 石墨烯的生物可降解性也成为了当前生物医用领域中极其重要的研究方向.

  碳材料常见的降解方法主要有化学降解和生物降解.氧化石墨烯(GO)通过化学方法如酸氧化^[56]、水热法^[57]、溶剂热法^[58]、微波法^[59]以及photo-Fenton反应(Fe²⁺/H₂O₂体系)^[60]等, 在环氧基团转变成羰基的过程中使得底层的碳-碳键断裂, 形成小的碳颗粒即纳米级的石墨烯量子点^[61], 可应用于石墨烯材料的降解.

  在生物降解方面, 已有研究发现微生物细菌对碳材料具有氧化作用, 有利于材料的降解. Zhang等^[62]报道了混合菌群在其它有机碳源的条件下, 可将碳纳米管降解为CO₂, 并且检测出芳香化合物碎片; Schreiner等^[63]利用白腐真菌与富勒烯经过32周的培养, 将其转化为CO₂, 部分转化为白腐真菌生物质; Liu等^[64]研究发现从石墨矿中分离的萘降解细菌可以氧化石墨烯材料, 当细菌和石墨烯材料接触后, 石墨烯材料可以发生电子传递, 材料的孔洞增多, 尺寸减少, 显示出降解的迹象. Girish等^[65]通过实验聚焦了在体内条件下石墨烯生物降解的关键问题, 他们利用共聚焦拉曼成像观察了石墨烯在小鼠的肺、肝脏、肾脏和脾脏组织中的3D图像(图 1), 并通过观察拉曼光谱中缺陷相关峰的形成、D和G带的线宽、I_D/I_G数值、峰值总体强度降低来鉴定三个月内被巨噬细胞吞噬的石墨烯结构的逐渐紊乱和降解, 发现与缺陷相关的D'带的形成、D和G带的线宽增加、I_D/I_G比值增加和总体强度降低, 验证了被组织来源的巨噬细胞吞噬的石墨烯生物降解行为.基因表达研究结果显示了第8 d的急性炎反应的发生, 这可能触发了巨噬细胞对石墨烯的反应.这项研究明确提供石墨烯体内生物降解的证据, 对石墨烯基材料在未来应用于生物医学方面有着巨大的指导意义.越来越多的研究小组着力于研究石墨烯材料在生物分子的作用下发生的降解行为.

  图 1

  

  图 1.  静脉注射24 h和3个月后石墨烯在小鼠的肺、肝脏、肾脏和脾脏组织的拉曼图像[红色代表石墨烯聚集体, 蓝色代表周围组织]

  Figure 1.  Raman images acquired from tissue sections of lung, liver, kidney and spleen obtained after 24 h (top) and 3 months (bottom) of intravenous injection of graphene [graphene aggregate (red) embedded within tissue (blue)]

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  在生物医学领域研究中, 碳材料的生物降解主要集中在酶促降解(图 2^[66]), 可分为有细胞和无细胞参与的酶促降解^[67].目前为止, 被应用于生物降解碳材料的酶主要有来源于植物辣根的辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)、来自炎性细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和小胶质细胞等)的氧化酶[髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)、嗜酸性粒细胞过氧化物酶(Eosinophil Peroxidase, EPO)和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XO)]以及来自真菌的木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase, LiP)等^{[68, 69]}.同时, 人体体内新陈代谢时, 物质氧化分解过程中可产生过氧化氢(H₂O₂), 呼吸链等电子传递过程中亦可产生超氧粒子, 超氧粒子可进一步生成H₂O₂, 这些H₂O₂在石墨烯材料体内酶降解过程中都起了至关重要的作用^[70].

  图 2

  

  图 2.  碳材料的酶促降解的概括图^[66]

  Figure 2.  Enzyme-catalyzed degradation of carbon nanomaterials

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  2.1   辣根过氧化物酶(HRP)

  HRP是一种含亚铁血红素的蛋白质, 是由酶蛋白和铁卟啉结合而成的糖蛋白, 亦是最早被用于生物降解碳材料的酶, 2008年, Star团队开创性地通过HRP生物降解了氧化的单壁碳纳米管^[71], 随后他们将HRP应用于生物降解石墨烯材料中^[72]. HRP活性位点中含有铁(Ⅲ)原卟啉IX, 未被激活时, HRP处于非活化状态, 血红素过氧化物酶处于铁氧化状态; 在过氧化氢(H₂O₂)存在下, HRP被激活, 其亚铁血红素活性位点被转化为含高价铁氧(Fe⁴⁺＝O)卟啉π阳离子自由基组成的化合物^[73], 该化合物中的高价铁通过两个连续的单电子转移步骤被还原, 当高价铁氧(Fe⁴⁺＝O)卟啉π阳离子被还原时, 氧化石墨烯(GO)被氧化, 在此过程, GO中叔羟基和环氧化物中的σ碳-碳键被断裂.他们将HRP与GO在PBS中H₂O₂存在下共同培养^[72], 每天加入H₂O₂, 通过软件预测了HRP酶的活性位点与GO的结合位点(图 3a). 8 d后, 材料片层上出现孔洞, 并且发现孔洞大小随着时间的延长而增大, 在20多天后, 大部分的GO能被降解(图 3b), 并且通过气相色谱-质谱分析了GO降解后的最终产物为CO₂.同时, 他们发现相同条件下, 还原氧化石墨烯(rGO)不能被HRP/H₂O₂降解, 因此, 在降解过程中, 氧化石墨烯的结构缺陷在酶氧化反应中起了重要作用, 氧化反应破坏晶格结构促进了降解.

  图 3

  

  图 3.  (a) 分子模拟软件(AutoDock Vina)计算模拟的HRP酶(从左至右)与氧化石墨烯、多孔的氧化石墨烯以及氧化石墨烯小片层的结合的示意图及(b)氧化石墨烯在与HRP/H₂O₂共同培养的0、8、12以及20 d的电镜图(第8 d图中箭头表示石墨烯基底面中孔洞的形成^[72])

  Figure 3.  (a) Binding poses of HRP on (from left to right) graphene oxide, holey graphene oxide, and a small sheet of graphene oxide calculated using molecular docking studies (AutoDock Vina) and (b) TEM micrographs of graphene oxide after 0, 8, 12, and 20 d of incubation with HRP and 40 μmol•L^－1 H₂O₂ (arrows indicate hole formation in the basal plane at day 8)

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  随着HRP/H₂O₂催化体系的发展, HRP酶也被应用到了三维石墨烯(3D-GFs)的降解, 3D-GFs作为新型的组织工程三维支架材料, 移植到体内后达到修复效果后, 支架的降解也是极其重要的, 三维支架的降解可以减少由支架手术切除或者老化而导致体内感染的风险. 3D-GFs多孔结构极大地促进了材料的氧化能力, 进一步促进其生物降解能力. Loeblein等^[74]首次通过HRP/H₂O₂体系降解3D-GFs, 并且提出了3D-GFs的降解机理, 主要经历两个阶段, 第一个阶段中, 3D-GFs单个域之间的中断和小颗粒/薄片的剥落, 大量的石墨薄片从3D-GFs支架的表面分离, 导致支架整体厚度减小.第二个阶段则是颗粒/薄片的溶解, 首先是尺寸较大的粒子进一步分解成较小的颗粒, 石墨薄片的边界被逐渐腐蚀掉直至为单层, 随后, 单单层石墨烯的边缘逐渐被溶解, 并在层内产生孔隙, 最终降解为CO₂.此外, 通过氧等离子的预处理可以调控生物降解的速率.

  2.2   髓过氧化物酶(MPO)

  MPO是存在于髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)中的一种血红素蛋白酶, 是血红素过氧化物酶家族成员之一. MPO的酶降解机理与细菌和其它会导致生物组织发炎的侵入性材料的感染过程相关.在炎症发生过程中, 会产生嗜中性粒细胞, 聚集在感染区域并分泌MPO, MPO可催化氯离子和H₂O₂之间的化学反应而产生强氧化剂, 如次氯酸, 这些氧化剂具有抗菌特性, 并且能够降解聚酯型的移植物、胞外糖和氧化碳材料等.

  Kurapati等^[75]对人嗜中性白细胞衍生的人髓过氧化物酶(hMPO)催化降解石墨烯材料进行了研究, 提出相应GO降解机制: hMPO为高阳离子蛋白, 与带负电荷的氧化石墨烯材料结合开始酶催化过程, 催化产生的强氧化剂次氯酸和反应自由基中间体, 裂解石墨烯中的羟基、环氧官能团和邻近C—C、C＝C键, 使得石墨烯形成多孔、无定形的形状.研究表明hMPO催化的生物降解与GO的亲水性、表面负电荷、胶体稳定性有关.在MPO作用下, 较分散的GO能够完全分解掉, 而聚集的GO难以被降解.石墨烯的分散性取决于石墨烯材料表面的含氧基团, 材料最可能开始分解的地方主要集中在石墨烯晶格中碳原子与氧原子结合的地方.石墨烯晶格上少量暴露的氧化性亲水官能团会导致材料的聚集, 胶体稳定性减弱, 从而产生沉淀难以降解.此外, 表面电荷通过对氧化石墨烯和生物酶之间结合能力的影响也可以影响降解行为.这项研究提供了一种安全降解石墨烯基材料且对环境无害的新方法.随着酶促降解的发展, HPO以及MPO也逐渐被尝试应用到其它惰性材料的酶促降解研究中, 如有“白色石墨烯”之称的六方氮化硼(hBN)^[76].

  另两种常用于降解碳材料的酶为来自炎细胞的酶嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)和黄嘌呤氧化酶(XO). EPO是含血红素的卤代过氧化物酶, 有68%的序列与中性粒细胞MPO相同. EPO是人类肺中主要的氧化剂生成酶之一, 在炎症状态下诱发, 主要利用H₂O₂催化双电子氧化还原反应, 氧化卤化物形成相应的次卤酸, 并产生活性基中间体, 参与碳材料的降解过程; XO广泛分布在哺乳动物组织中, 通过产生活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的氧化过程在嘌呤代谢中起重要作用, 可以代谢主要存在哺乳动物的肝脏中的各种分子.在材料表面修饰嘌呤衍生物, 可以促进XO与材料表面的嘌呤作用, 在嘌呤分子氧化成尿酸的过程中, XO产生的活性氧主要为超氧化物, 该超氧化物结合外加的H₂O₂, 能产生的高活性自由基HO•, 具有高还原电位, 可对碳材料进行氧化和降解.上述这两种酶多用于碳纳米管降解的研究^{[77, 78]}, 据我们所知, 目前还没有这两种酶对石墨烯材料的生物降解的相关研究.

  2.3   木质素过氧化物酶(LiP)

  LiP是由白腐真菌产生的一种木质酶, 是植物细胞壁中的纤维素的组分之一, 是真菌分泌的一种含铁血红素的糖基化细胞外蛋白过氧化物酶.研究表明, LiP含Fe³⁺、卟啉环和血红素辅基, 可利用H₂O₂及有机过氧化物为受体, 催化一系列的底物, 其催化作用具有非特异性. LiP可以断裂聚合物芳香环, 如木质素和其它二氯苯基乙烷和多氯联苯等有机分子, 形成氧化侧链和芳香残留物, 氧化反应期间, 藜芦醇(VA, LiP的二级代谢物, 作为电子中介体)作为自由基介质, 协助LiP和基底之间电子传递, VA阳离子自由基的形成可以直接氧化化学物质^[79].此外, LiP比HRP和MPO具有更高的氧化还原电位^[80~82], 与VA结合, 具有高的酶活性. Lalwani等^[83]将氧化石墨烯纳米带(GONRs)和还原氧化石墨烯纳米带(rGONRs)分别与H₂O₂共同培养, 实验结果表明材料表面出现孔洞, 孔径随时间的增加而增大, 利用拉曼光谱分析表明, 96 h后, GONRs被完全降解, rGONRs被部分降解.同时, 他们通过对照实验研究发现了藜芦醇可以加快降解的速度.因此, 自然界中广泛存在的白腐真菌能够使得在环境中存在的石墨烯有效降解, 具有非常重要的意义.

  3.   石墨烯酶促降解的调控

  石墨烯碳材料的结构、组成和性质对其降解行为有着重要影响, 因此, 通过异质原子掺杂、表面功能化修饰等手段, 可以改变材料的物理化学性质, 从而调控碳材料的酶促降解.

  3.1   异质原子掺杂

  将异质原子(硼、氮、磷和硫等)掺杂到碳材料中可以改变碳材料的化学组成、原子排布以及电子结构^[84], 赋予材料新的电磁性质、物理化学性质、光化学性质、光学性质以及结构性质^[85].而结构缺陷位点在碳材料的酶促降解中具有关键的作用, 因此, 将异质原子嵌入到碳材料的晶格、缺陷或边缘等处, 可以进一步导致材料结构的缺陷, 增强材料与酶的结合作用, 促进碳材料的降解.异杂原子中, 氮原子的原子序数和尺寸与碳原子接近, 掺杂到碳材料中相对容易, 被广泛地应用于碳材料的异质原子掺杂中, 氮源有乙二胺、尿素、乙腈、吡啶、氨气等.氮原子比碳原子多一个电子, 掺杂的氮原子与碳材料的石墨结构不相容, 更偏向于位于不连续的石墨壁的边缘形成悬空键, 因此在整个石墨壁结构中形成氮官能化的缺陷位点. Star团队^[86]在研究多壁碳纳米管(MWNTs)的酶降解时提出了其由侧壁缺陷促成的“逐层”降解的机理, 并通过在原位合成过程中掺杂氮原子来研究异质原子对降解的影响.氮掺杂多壁碳纳米管(n-MWNTs)在石墨结构中引入更多的缺陷, 这些缺陷位点不仅存在于外部石墨层中, 也存在于所有石墨壁中, 当表层剥离后, 内部的缺陷位点有助于酶促氧化反应, 在HRP/H₂O₂条件下在80 d后能实现完全降解.然而普通处理的羧基化的多壁碳纳米管(o-MWNTs)在相同条件下不能实现完全降解.

  石墨烯掺氮的方法可分为直接生成型和后期处理型两大类, 前者在生长石墨烯及其衍生物时, 同时加入含有碳源和氮源的物质, 主要为化学气相沉积法(CVD)和溶剂热合成法等, 通过控制合适的CVD参数, 如生长温度、气体流量比、生长时间等控制掺杂石墨烯的含氮量和氮原子类型; 后者是在合适的条件下用含氮物对已制备好的石墨烯及其衍生物进行掺杂, 主要为热处理、等离子体处理(图 4)等.然而, 目前石墨烯掺杂异质原子主要应用在电池、电化学传感器以及超级容器等领域中^[87], 异质原子掺杂促进石墨烯降解还有待进一步研究.受碳纳米管相关研究的启发, 利用掺杂氮原子引起结构缺陷, 引入强氧化分子提高石墨烯材料与酶的作用, 促进石墨烯材料的降解, 是值得深入研究的课题.

  图 4

  

  图 4.  等离子体处理制备氮掺杂石墨烯的示意图^[88]

  Figure 4.  A schematic illustration of the plasma doping process in preparing N-doped graphene

  In the plasma process, the nitrogen atoms replace the carbon atoms. Inset shows possible nitrogen configurations.

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  3.2   表面功能化修饰

  如前所述, 由于表面含氧官能团的不同, 在相同条件下氧化石墨烯(GO)和还原氧化石墨烯(rGO)在相同HRP/H₂O₂酶催化体系下的降解速率不同^[72].通过GO的表面改性功能化^[89], 改变其表面上的官能团可以调控碳材料的生物降解^[90]. Bianco团队^[77]就碳纳米材料的降解提出了“Degradation-by-design”的概念, 将特定的分子通过共价键键合到碳材料中提高酶的催化活性, 他们首先将其用在碳纳米管的修饰来提高其生物降解能力, 随后将这一概念延伸到了GO的酶促降解中.他们^[91]利用香豆素和儿茶酚的衍生物(HRP的特异性配体), 即7-羟基叠氮基香豆素(AZC)和二羟基苯甲酸(DHBA)对GO的表面进行了功能化修饰, 分别得到GO-AZC和GO-DHBA.这两种衍生物修饰GO后增强了酶促作用, 可以吸引酶接近其活性位点, 促进GO和酶之间的电子转移, 从而增加氧化速率, 提高降解速率.通过拉曼光谱中D和G带强度和比值、动态光散射(DLS)中粒径和粒径分布的变化以及电镜中结构形貌的变化研究了材料的降解行为, 结果表明, 在HRP/H₂O₂条件下, 功能化的GO-AZC和GO-DHBA比GO具有更快更有效的生物降解能力.此外, 他们利用三甘醇二胺(TEG)功能化修饰GO获得了GO-TEG, 用来研究游离的氨基对生物降解过程的影响, 结果发现TEG上自由氨基(NH₂)的存在降低了GO的生物降解速率, 他们推测这是由于氨基与HRP酶上的正电荷发生了静电排斥, 降低了酶和GO的作用.总体上, 在HRP/H₂O₂酶催化下, 降解的速率为GO-AZC≥GO-DHBA＞GO＞GO-TEG(结构式如图 5所示), 进一步地通过分子模拟研究了HRP活性位点与GO上的分子作用的距离, 结合凝胶电泳的测试结果证实了这些结论.

  图 5

  

  图 5.  不同共价键修饰的氧化石墨烯的分子结构(为了简化, 每个GO片层只显示一个功能基团)

  Figure 5.  Molecular structures of the different covalently functionalized GO conjugates (for simplicity, the structures show only one functional group in each GO sheet)

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  适当的表面修饰可以增强GO的酶促降解速率, 但一些表面修饰或过多的功能基团却会导致酶促降解速率的降低, 这取决于表面修饰的分子的性质.良好的表面修饰可以提高材料的生物相容性, 但同时也可能导致降解速率的下降. Liu团队^[92]研究发现聚乙二醇(PEG)和牛血清蛋白(BSA)修饰的GO虽然能提高GO的生物相容性和生理稳定性, 但是与未修饰的GO相比, PEG和BSA的修饰却抑制了HRP的酶促降解行为, 不能被降解, 这可能是由于PEG和BSA的空间位阻作用导致了酶和GO的相互作用的减弱, 从而减缓了GO的生物降解.为此, 他们利用新型的可断裂的PEG化方法对由Hummer法制得的GO进行了修饰, 在GO表面修饰含有二硫键(-S-S-)的PEG(图 6a), 二硫键在体内谷胱甘肽(GSH)作用下可以断裂.他们所制备的GO-SS-PEG兼顾到生物相容性的同时也能实现酶促降解. GO-SS-PEG具有较好的生物相容性, 其中的双硫键可被细胞内高浓度的GSH断裂, 从而使得GO更易接触到酶的活性中心点, 继而实现降解(图 6b), 相比没有二硫苏糖醇(DTT)或者没有HRP/H₂O₂酶条件下, GO-SS-PEG在DTT和HRP/H₂O₂酶催化条件下能够被降解.此外, GO-SS-PEG与未修饰的GO相比, 大大降低了GO在小鼠肺部的聚集(图 6c).这项研究为纳米材料的表面化学修饰在生物医学领域的应用提供了重要的方法.

  图 6

  

  图 6.  (a) GO-SS-PEG的合成示意图、(b) GO-SS-PEG在有DTT和没有DTT条件下以及有或没有HRP酶催化条件下的紫外-可见-近红外光谱和相应的GO溶液的图片及(c) ¹³¹I标记的GO-SS-PEG和GO在Balb/C小鼠中的体内分布

  Figure 6.  (a) Schematic illustration of the preparation of GO-SS-PEG, (b) UV-Vis-NIR spectra and inner photos of 0.03 mg/mL GO-SS-PEG samples without (left) or with (right) DTT-pretreatment, before and after HRP-induced biodegradation for 4 d and (c) biodistribution of ¹³¹I-labeled GO-SS-PEG and GO in Balb/C mice

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  因此, 在GO表面修饰其它酶特异性分子, 或修饰具有吸引酶作用的催化底物, 系统研究其生物降解行为, 具有重要的研究意义.

  4.   石墨烯生物降解的表征方法

  石墨烯生物降解的表征可参考利用碳材料生物降解的表征手段, 结合实验和理论方法来验证^[69], 实验方法上有扫描电镜(SEM)、电子自旋共振(ESR)、原子力学显微镜(AFM)、透射电镜(TEM), 拉曼(Raman)光谱、可见光近红外(Vis-NIR)光谱等, 具体表征目的见表 1, 其中, TEM、Raman和Vis-NIR光谱是较为常见的表征手段.理论上, 可以通过分子对接、分子动态模拟和同源模建方法进行模拟检测酶蛋白质和材料的作用和距离, 进行验证.

  表 1

  

  表 1  研究碳材料生物降解的主要表征方法^[69]

  Table 1.  Main characterization methods used to investigate biodegradation of carbon materials

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  表征方法	表征目的
  扫描电镜(SEM)	观察碳材料降解过程中的形貌变化; 研究材料是否被功能化
  电子自旋共振(ESR)	识别自由基的形成; 显示材料在生物降解过程中的酶活性
  原子力学显微镜(AFM)	表征生物酶和碳材料的结合以及碳材料降解碎片的形貌和尺寸
  14C标记	追踪碳材料降解的最终产物
  液相/气相色谱-质谱联用技术	识别碳材料生物降解的中间体或最终产物
  圆二色谱(CD)	分析碳材料和蛋白质之间的相互作用
  X射线衍射(X-ray diffraction)	观察碳材料的生物降解过程
  衰减全反射红外光谱(ATR-IR)	研究碳材料微生物降解过程中材料的功能基团
  透射电镜(TEM)	观察碳材料降解过程中的结构形貌变化
  拉曼(Raman)光谱	通过观察D和G带强度、比值的变化来分析碳材料的降解过程
  可见光近红外(Vis-NIR)光谱	通过M1和S2带的变化监测碳材料的降解

  5.   结论与展望

  石墨烯材料的发展迅猛, 在各个领域都具有重要的应用前景.石墨烯材料具有良好的生物相容性, 在生物医学技术方面具有高效作用, 但其商业化应用还处于初期阶段, 所带来的环境问题和长期安全问题目前都还处于待解决中, 研究石墨烯材料的生物降解在生物医学方面具有巨大的意义.目前, 石墨烯材料的生物降解主要集中在酶促降解, 人体体内新陈代谢时, 物质氧化分解过程中可产生过氧化氢, 结合体内活性酶的作用, 达到对石墨烯材料的生物降解.石墨烯材料的结构、组成和性质对其降解行为有着重要影响, 通过异质原子掺杂、表面功能化修饰等手段, 可以改变材料的物理化学性质, 从而调控石墨烯材料的酶促降解.

  有关石墨烯材料的降解成果至今还较少, 石墨烯材料生物降解问题的系统研究还有待完善, 科研工作者还需从降解过程中具体降解机理、石墨烯结构变化的规律和生物降解的代谢途径等方向进一步探索研究, 为石墨烯材料实现体内应用提供有效的支撑.

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  图 1  静脉注射24 h和3个月后石墨烯在小鼠的肺、肝脏、肾脏和脾脏组织的拉曼图像[红色代表石墨烯聚集体, 蓝色代表周围组织]

  Figure 1  Raman images acquired from tissue sections of lung, liver, kidney and spleen obtained after 24 h (top) and 3 months (bottom) of intravenous injection of graphene [graphene aggregate (red) embedded within tissue (blue)]

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  图 2  碳材料的酶促降解的概括图^[66]

  Figure 2  Enzyme-catalyzed degradation of carbon nanomaterials

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  图 3  (a) 分子模拟软件(AutoDock Vina)计算模拟的HRP酶(从左至右)与氧化石墨烯、多孔的氧化石墨烯以及氧化石墨烯小片层的结合的示意图及(b)氧化石墨烯在与HRP/H₂O₂共同培养的0、8、12以及20 d的电镜图(第8 d图中箭头表示石墨烯基底面中孔洞的形成^[72])

  Figure 3  (a) Binding poses of HRP on (from left to right) graphene oxide, holey graphene oxide, and a small sheet of graphene oxide calculated using molecular docking studies (AutoDock Vina) and (b) TEM micrographs of graphene oxide after 0, 8, 12, and 20 d of incubation with HRP and 40 μmol•L^－1 H₂O₂ (arrows indicate hole formation in the basal plane at day 8)

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  图 4  等离子体处理制备氮掺杂石墨烯的示意图^[88]

  Figure 4  A schematic illustration of the plasma doping process in preparing N-doped graphene

  In the plasma process, the nitrogen atoms replace the carbon atoms. Inset shows possible nitrogen configurations.

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  图 5  不同共价键修饰的氧化石墨烯的分子结构(为了简化, 每个GO片层只显示一个功能基团)

  Figure 5  Molecular structures of the different covalently functionalized GO conjugates (for simplicity, the structures show only one functional group in each GO sheet)

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  图 6  (a) GO-SS-PEG的合成示意图、(b) GO-SS-PEG在有DTT和没有DTT条件下以及有或没有HRP酶催化条件下的紫外-可见-近红外光谱和相应的GO溶液的图片及(c) ¹³¹I标记的GO-SS-PEG和GO在Balb/C小鼠中的体内分布

  Figure 6  (a) Schematic illustration of the preparation of GO-SS-PEG, (b) UV-Vis-NIR spectra and inner photos of 0.03 mg/mL GO-SS-PEG samples without (left) or with (right) DTT-pretreatment, before and after HRP-induced biodegradation for 4 d and (c) biodistribution of ¹³¹I-labeled GO-SS-PEG and GO in Balb/C mice

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  表 1  研究碳材料生物降解的主要表征方法^[69]

  Table 1.  Main characterization methods used to investigate biodegradation of carbon materials

  表征方法	表征目的
  扫描电镜(SEM)	观察碳材料降解过程中的形貌变化; 研究材料是否被功能化
  电子自旋共振(ESR)	识别自由基的形成; 显示材料在生物降解过程中的酶活性
  原子力学显微镜(AFM)	表征生物酶和碳材料的结合以及碳材料降解碎片的形貌和尺寸
  14C标记	追踪碳材料降解的最终产物
  液相/气相色谱-质谱联用技术	识别碳材料生物降解的中间体或最终产物
  圆二色谱(CD)	分析碳材料和蛋白质之间的相互作用
  X射线衍射(X-ray diffraction)	观察碳材料的生物降解过程
  衰减全反射红外光谱(ATR-IR)	研究碳材料微生物降解过程中材料的功能基团
  透射电镜(TEM)	观察碳材料降解过程中的结构形貌变化
  拉曼(Raman)光谱	通过观察D和G带强度、比值的变化来分析碳材料的降解过程
  可见光近红外(Vis-NIR)光谱	通过M1和S2带的变化监测碳材料的降解

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