活性天然产物靶标蛋白的鉴定

周怡青 肖友利

引用本文: 周怡青, 肖友利. 活性天然产物靶标蛋白的鉴定[J]. 化学学报, 2018, 76(3): 177-189. doi: 10.6023/A17110484 shu
Citation:  Yiqing Zhou, Youli Xiao. Target Identification of Bioactive Natural Products[J]. Acta Chimica Sinica, 2018, 76(3): 177-189. doi: 10.6023/A17110484 shu

活性天然产物靶标蛋白的鉴定

    作者简介: 周怡青副研究员本科毕业于浙江大学生物工程系, 2011年在香港大学获得博士学位, 研究方向为有机化学, 导师为杨丹教授.此后他在北京大学潘峥婴研究员实验室进行博士后研究, 研究方向为药物化学和化学生物学.2014年加入中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 研究内容为基于化学蛋白质组学的活性小分子靶标鉴定;
    肖友利研究员2000年本科毕业于山东大学化学系, 2005年在中国科学院上海有机化学研究所获得博士学位, 研究方向为金属有机化学, 导师为丁奎岭院士.此后他分别在美国波士顿大学刘平华(Pinghua Liu)教授实验室和哈佛大学医学院Jon Clardy教授实验室进行博士后研究及Research Fellow工作, 研究方向为天然产物合成中酶学催化机制与活性功能.2012年底于中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所开始独立研究工作, 课题组主要利用化学生物学方法结合多组学的策略解析活性天然产物的生物合成途径和作用靶标;
    通讯作者: 肖友利, ylxiao@sibs.ac.cn
  • 基金项目:

    项目受国家自然科学基金(Nos.21572243,21502206)和中国科学院先导B培育项目(No.XDPB0402)资助

    国家自然科学基金 21502206

    中国科学院先导B培育项目 XDPB0402

    国家自然科学基金 21572243

摘要: 天然产物是创新药物的重要来源,确定活性天然产物的靶标蛋白和作用机制是新药开发的关键.在本篇综述中,对近二十年来在活性天然产物靶标鉴定领域出现的新技术和新方法进行简要的回顾和总结,通过实例重点介绍化学蛋白质组学和生物物理学方法在天然产物靶标蛋白鉴定方面的应用,讨论各种策略的优势和不足,并对其适用范围,应用前景和发展趋势作了前瞻性的展望.

English

  • 天然产物(Natural products, NPs)是自然界的生物在进行生命活动过程中合成的代谢产物.源于天然产物的药物已经被广泛用于治疗多种重大疾病, 如心血管疾病、恶性肿瘤、免疫疾病和传染性疾病等[1].相较于化学合成的小分子药物, 天然产物在结构新颖性、生物相容性和功能多样性等方面具有明显的优势, 并且在长期进化过程中得到自然筛选优化[2, 3].在新药研发和临床用药中天然产物及其衍生物占有很大比重.据统计在1939年至2016年间, 美国食品及药物管理局(FDA)批准的上市药物中, 有相当数量含有天然产物的分子片段(50%以上), 甚至直接来源于天然产物[4].因此, 利用天然产物进行药物设计是现代创新药物产生的有效途径[5].

    活性天然产物与细胞内靶标相互作用, 是其发挥作用的基础.基于天然产物新药发现的第一个关键步骤就是靶点的确定[6].在药物研发的起始阶段明确药物分子的靶点, 有助于深入研究其作用机制, 并尽早发现其可能存在的毒副作用, 进而从结构上进行有针对性的改造, 降低药物研发成本.在生物体内, 包括天然产物在内的小分子化合物(Compound)通过结合大分子靶标(Target), 在基因组(Genome), 转录组(Transcriptome), 蛋白质组(Proteome)和代谢组(Metabolome)等各个层面引起表型(Phenotype)变化.由于蛋白质是细胞功能的主要执行者, 大分子靶标在多数情况下是与天然产物相互作用的蛋白质, 即靶点蛋白.根据小分子-靶点-表型三者之间的逻辑关系, 天然产物靶点鉴定的策略可以分为两大类[7]:首先, 以小分子天然产物为起点筛选靶标蛋白, 或被称作逆向策略(Reverse strategy), 包括化学蛋白质组学(Chemical proteomics), 化学基因组学(Chemical genetics)和生物物理学(Biophysics)等方法; 其次, 根据天然产物引起的表型变化或与之相关的已知信号通路和作用网络推测并确定天然产物的靶标, 也称作正向策略(Forward strategy), 主要包括差异基因组学/蛋白质组学分析, 细胞形态分析等方法.本文将通过近二十年来的代表性实例介绍这些靶标鉴定的方法策略.

    不同于传统的基于蛋白质定性定量的蛋白质组学(Proteomics), 化学蛋白质组学(Chemical proteomics)借助分子探针特异性靶向与化学小分子具有相互作用的亚蛋白质组, 从而找到包括天然产物在内的小分子的靶点蛋白[8].作为化学蛋白质组学技术的核心要素, 分子探针的实质是利用连接链将活性分子骨架和报告基团(固相介质, 荧光或生物素等)相连而合成的活性分子衍生物[9].其中, 活性分子骨架与靶标蛋白相互结合, 报告基团则能够标记或富集靶标蛋白.将被富集的蛋白洗脱和酶解后即可通过质谱进行鉴定.利用化学蛋白质组学策略进行靶标鉴定的策略大致分为以下两种: (1)设计以天然产物结构为基础的亲和性探针(Affinity-based Probe), 在蛋白质组中富集与之结合的蛋白[10]; (2)以天然产物分子骨架中特定官能团活性/功能为基础选择相应的活性探针(Activity-based Probe), 并利用竞争性策略筛选与天然产物分子相关的蛋白质及其活性位点[11].随着靶标鉴定复杂性的增加, 用于化学蛋白质组学研究的分子探针设计也更加多功能化.此外, 高分辨质谱技术和定量蛋白质组学的快速发展也为靶标鉴定提供了更先进的研究手段.以下将结合文献实例对这些方法进行详细阐述(图 1).

    图 1

    图 1.  基于亲和蛋白质组分析策略: (a)固定化天然产物分子; (b)天然产物生物素化探针; (c)基于天然产物自身反应活性(红色部分)的带有生物正交反应基团(炔基)的探针; (d)基于光亲和基团的炔基修饰的天然产物探针
    Figure 1.  Affinity-based profiling of protein targets of natural products (NPs): Workflows of target identification through (a) immobilized NPs; (b) Biotinylated NP probes; (c) bioorthogonal probes based on intrinsic reactivity of NPs; (d) bioorthogonal photoaffinity probes
    2.1.1   基于天然产物的亲和蛋白质组分析

    截至目前, 被称作基于亲和性蛋白质组分析(Affinity-based Protein Profiling, AfBPP)或者以化合物为中心的化学蛋白质组学(Compound-Centric Chemical Proteomics, CCCP)的亲和层析技术是活性天然产物靶点鉴定中最为常用的方法[10].早期的研究策略将天然产物通过化学方法共价固定化于生物相容的惰性树脂, 如琼脂糖凝胶或磁珠上, 再用这种树脂作为诱饵来钓取活性蛋白质组中能与之产生相互作用的蛋白质(图 1a).早在20世纪90年代, 哈佛大学Schreiber团队[12]利用固载小分子的亲和层析方法在小牛胸腺和人脾细胞裂解液中分离出了天然免疫抑制剂FK506的结合蛋白FKBP12及其复合物, 并发现了环肽天然产物Trapoxin与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的特异性结合[13].另外一种被广泛使用的亲和纯化方法是将天然产物与生物素(Biotin)相连, 然后通过固载链霉亲和素(Avidin/Streptavidin)的亲和层析进行分离富集.该方法的一个优点是生物素修饰的天然产物可以在进行纯化分离之前与细胞或组织裂解液中的蛋白质充分接触, 甚至可以直接进入细胞与靶标蛋白相互结合(图 1b).烟曲霉素(Fumagillin)是一种从烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)中分离出的具有极强的抑制血管生成作用的天然产物. 90年代后期, 耶鲁大学的Crews研究组[14]和约翰霍普金斯大学的Liu研究组[15, 16]几乎同时报道了利用生物素化的探针在血管内皮细胞中发现Fumagillin共价不可逆结合甲硫氨酸氨基肽酶MetAP2, 抑制其甲硫氨酸水解酶活性, 进而影响新生蛋白N端甲硫氨酸的切除, 干扰蛋白质的成熟、细胞定位和功能, 最终实现抑制血管生成的作用. 图 2列举了具有代表性的用于亲和层析的树脂或探针[14~32], 其中涵盖了多个中药天然产物明星分子, 如醉茄素(Withaferin A)[20], 腺花素(Adenanthin)[28], 雷公藤甲素(Triptolide)[29]和黄连素(Berberine)[30]等.时至今日, 这种最为直接的亲和层析方法仍然在靶标鉴定领域得到广泛应用.最近, 来自奥地利的科学家利用固定化的青蒿素发现在胰岛α细胞中, 青蒿素结合gephyrin蛋白并激活细胞信号的主要开关GABA受体, 使产生胰高血糖素(Glucagon)的胰岛α细胞转变为产生胰岛素(Insulin)的胰岛β细胞, 从而为开发I型糖尿病的全新疗法奠定基础[26].此外, 日本理化研究所的Osada研究组[33, 34]开发了一种光亲和交联技术, 将天然产物通过光亲和基团如芳基双吖丙啶(Aryl diazirine)随机固定到树脂上.树脂上的光亲和基团与天然产物的不同位点发生反应, 随机产生了一系列的天然产物光催化交联树脂, 从而避免了单一化学修饰导致的与靶点蛋白结合力的改变.利用该方法Ito研究组[35]发现了奇霉素B1 (Spectomycin B1)通过直接结合SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) E2连接酶而抑制蛋白的SUMO化修饰.

    图 2

    图 2.  用于靶点蛋白鉴定的固定化天然产物树脂或生物素化天然产物探针实例.固定化天然产物的树脂与细胞裂解液混合孵育后, 可以直接对靶标蛋白进行富集和鉴定; 生物素化探针与活性蛋白质组(活细胞或细胞裂解液)孵育后, 通过固载链霉亲和素(Avidin/Streptavidin)的树脂对靶标蛋白进行分离富集和鉴定(蓝色代表衍生化基团)
    Figure 2.  Representative natural product-immobilized matrix or biotinylated natural products for target identification. NP-immobilized affinity matrix can be applied directly in target enrichment and identification; For biotinylated NP probes, living cells or cell lysates were incubated with the probes, and binding proteins were enriched by avidin/streptavidin-coated matrix for further identification (Blue: reporting group and linker)

    尽管诸如生物素亲和标签或固定化小分子这样经典的探针设计被广泛应用, 这类策略的一个缺陷在于引入位阻较大的亲和标签很容易导致化合物的活性降低甚至丧失.生物正交化学反应的发展, 例如铜催化的叠氮-炔点击反应(Click Reaction)等使这些问题得到了很大程度上的缓解[36].事实上, 在天然产物骨架引入生物正交反应基团是近十年来应用最为广泛的靶点鉴定策略之一.通过有机合成在小分子上引入炔基等生物正交基团对于化合物原有化学性质干扰相对较小, 可以在活细胞或细胞裂解液中与靶标蛋白结合; 随后利用点击反应再将叠氮修饰的报告基团(生物素或荧光)连接到探针-靶标蛋白复合物上, 并对靶标进行检测、富集和鉴定(图 1c).英国帝国理工大学的Tate研究组, 德国慕尼黑工业大学的Sieber研究组以及新加坡国立大学的林青松研究组在这方面取得了众多研究成果, 在蛋白质组层面解析了一系列活性天然产物的作用靶标, 如花姜酮(Zerumbone)[37], 胆固醇(Cholesterol)[38], 羟基德里辛(4-Hydroxyderricin)[39], 阿西维辛(Acivicin)[40], 姜黄素(Curcumin)[41], 穿心莲内酯(Andrographolide)[42]以及青蒿素(Artemisinin)[43]等. 图 3列举了近年来具有代表性的利用生物正交反应基团进行衍生化的天然产物探针实例[37~51].本课题组近年来也利用炔基修饰的探针解析了青蒿素[45]和藤黄酸(Gambogic acid)[46]抗癌相关的靶标蛋白.此外, 为了避免铜作为催化剂对生物相容性的影响, 一些新型生物正交反应被开发并用于小分子靶点鉴定相关研究, 包括环张力诱导的叠氮-炔基环加成反应以及四嗪与环状烯烃或环状炔烃间发生的逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应等[52].

    图 3

    图 3.  用于靶点蛋白鉴定的基于天然产物原生反应活性的生物正交探针实例:探针与活性蛋白质组(活细胞或细胞裂解液)孵育后, 与其靶标蛋白不可逆共价结合, 随后通过生物正交反应引入报告基团进行靶标富集和鉴定(蓝色部分代表报告基团和连接链)
    Figure 3.  Representative bio-orthogonal probes for target identification of NPs with intrinsic relativities. Native proteomes were incubated with probes and covalent bond was formed. Probe-labelled proteins were subjected to target enrichment and identification (Blue: reporting group and linker)

    需要注意的是, 由于炔-叠氮环加成生物正交反应需要铜的催化, 在反应前一般会加入去垢剂如SDS (Sodium dodecyl sulfate)以防止蛋白变性沉淀.因此, 使用该策略的一个先决条件是小分子与靶标蛋白已经形成共价不可逆的结合.因此, 事实上图 2中所有天然产物均含有潜在的共价修饰氨基酸残基的活性基团.但是, 对于其它天然产物而言, 其与靶标蛋白的结合通常是一种非共价可逆的相互作用, 简单的生物正交反应技术并不再适用.随着基于亲和蛋白质组分析策略的不断改进, 光亲和标记技术(Photoaffinity labeling, PAL)的发展很好地解决了这个问题[53].将引入光亲和基团的探针与具有活性的蛋白质组(活细胞或非变性的细胞裂解液)孵育后, 经特定波长的光照射分解产生高活性的自由基中间体, 与靶标蛋白不可逆共价结合.随后通过生物正交反应引入或直接通过报告基团或进行靶标富集和鉴定(图 1d).常用的光亲和基团包括二苯甲酮(Benzophenone)、芳基叠氮(Aryl azide)、双吖丙啶(Diazirine)等.早期研究中, 二苯甲酮由于性质稳定且易于合成被广泛应用, 但其空间位阻相对较大, 且紫外激发时间相对较长; 近年来, 体积小巧而效率更高的双吖丙啶基团在光亲和标记中得到越来越广泛的应用.需要注意的是, 光亲和基团自身也有特定的结合蛋白, 比如双吖丙啶能够特异性结合电压依赖性阴离子通道(Voltage-dependent anion channel, VDAC)家族的蛋白[54, 55], 因此需要通过对照实验加以鉴别.通过光亲和探针进行靶标识别代表性天然产物包括著名抗生素环孢菌素(Cyclosporine A)[56], 万古霉素(Vancomycin)[57], 天然非选择性激酶抑制剂星形孢菌素(Staurosporine)[58], 人体重要代谢物胆固醇(Cholesterol)[59]和胆酸(Bile acid)[60], 以及其它一些具有药用价值的生物碱和萜类天然产物. 图 4列举了这些具有代表性的天然产物光亲和探针[56~65].本课题组[65]也利用带有双吖丙啶和炔基标签修饰的探针发现由金钱松根皮提取的天然产物土荆皮乙酸(Pseudolaric acid B)与跨膜蛋白CD147的胞外IgC2结构域结合, 进而抑制癌细胞的迁移、增殖和转移.最近, Sieber研究组[66]合成了一系列基于人内源性多肽激素强啡肽(Dynorphin, DYN)的光亲和探针, 通过化学蛋白质组学策略发现炎症感染过程中绿脓杆菌通过膜受体蛋白ParS介导相关防御机制.

    图 4

    图 4.  用于靶点蛋白鉴定的含有光亲和基团的天然产物探针:探针与活性蛋白质组(活细胞或细胞裂解液)孵育后, 在紫外激发下光亲和基团分解并产生高活性的自由基中间体, 与其靶标蛋白不可逆共价结合, 随后通过生物正交反应引入或直接通过报告基团或进行靶标富集和鉴定. (蓝色部分代表报告基团和连接链, 紫色部分代表光亲和基团)
    Figure 4.  Representative photoaffinity probes for target identification. Native proteomes were incubated with probes and irradiated by UV. Photoaffinity groups were activated and covalent bond was formed between probe and protein target. Finally photo-labelled proteins were subjected to target enrichment and identification. (Blue: reporting group and linker; purple: photoaffinity group)

    以上三类AfBPP/CCCP策略, 即直接亲和纯化, 基于生物正交反应的亲和纯化, 以及光亲和技术辅助的亲和纯化代表了当今主流的活性天然产物靶标蛋白的鉴定方法及其发展方向.除此以外, 研究人员还开发出了一系列基于特定化学和酶反应机理的精巧的靶标识别策略.为了解决光亲和探针位阻较大而标记效率低的缺点, 日本京都大学的Hamachi研究组[67]开发了一种称作LDT化学(Ligand-directed Tosyl Chemistry)的基于报告基团转移的靶点鉴定方法.该方法首先在天然产物分子上引入带有对苯磺酰基的报告基团.天然产物骨架与靶标蛋白结合后, 拉近了探针与蛋白表面的亲核性氨基酸残基的距离; 随后, 具有亲核性的残基进攻苯磺酰基并被报告基团共价修饰, 天然产物小分子脱离; 最后通过报告基团可以进行靶点标记和鉴定工作.通过该方法, 研究人员利用苯磺酰修饰的FK506分子在细胞中特异性标记了FKBP12蛋白.与LDT方法类似, 利用基于苯氧乙酰基的报告基团转移方法(Acyl transfer dye), 研究人员鉴定了天然产物Marinopyrrole A的靶标蛋白actin[68].北京大学李笑宇研究组[69]发展了一种称为DNA介导的亲和标记(DNA-Programmed Affinity Labeling, DPAL)的小分子靶标蛋白识别技术.该技术将小分子通过单链DNA修饰(捕获探针), 在小分子“捕获”靶标蛋白后, 通过另一条碱基互补配对的并含有光亲和基团和报告基团的DNA链(结合探针)实现靶标蛋白的标记、富集和鉴定.相比传统的光亲和探针, 该策略将光亲和基团和报告基团与小分子化合物分别置于两条互补的DNA链中, 消除了光亲和基团对小分子和蛋白质结合影响, 提高了低丰度和低亲和力靶标蛋白的识别能力.韩国首尔国立大学的Park研究组[70]利用不同荧光基团标记探针组和对照组所富集的蛋白, 经由二维凝胶电泳分离根据荧光差异(Fluorescence difference in two-dimensional gel electrophoresis, FITGE)鉴定小分子的特异性靶标.此外, 将可切割基团引入靶标鉴定的探针体系, 可以将被富集的蛋白在固相树脂上通过酶解、酸解、光解或还原剂等各种方式洗脱, 不仅减少了背景假阳性蛋白, 还可以获得天然产物与靶标蛋白的结合位点等重要信息[71].本课题组[72]利用带有可酸解结构的叠氮-生物素(DADPS)富集并鉴定了青蒿素与疟原虫翻译调节肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein, TCTP)蛋白的结合肽段, 证明了青蒿素过氧桥键独特的激活和自由基非定点共价修饰机制.

    2.1.2   基于活性蛋白质组分析的竞争性策略

    尽管基于AfBPP/CCCP的靶标鉴定策略得到广泛应用, 仍然有一些不足逐渐暴露出来.首先, 对于结构复杂的天然产物进行衍生化修饰可能降低或者失去原有的活性; 其次, 亲和纯化过程会引入大量的非特异结合蛋白.虽然某些非特异靶标可以通过对照实验加以甄别, 但高丰度蛋白和黏附性强的蛋白的干扰依然比较突出.因此, AfBPP/CCCP策略无法准确判断靶标蛋白的生理相关性, 需要通过更深层次的生化和细胞实验进行验证.

    基于活性蛋白质组分析(Activity-based Protein Profiling, ABPP)是由Cravatt团队[73]开发的研究蛋白质功能的技术.它运用基于活性探针(Activity-based Probe)在蛋白质组中特异性地标记处于功能状态下的蛋白质, 反映了蛋白质在生命体中的功能状态, 在经典蛋白质组学与功能蛋白质组学间起到桥梁作用.因此, 该技术被更多地应用于蛋白活性位点的发现以及相关小分子抑制剂的筛选.现有的基于活性探针可以大致分为两类[11]: (1)靶向水解酶、蛋白激酶、金属蛋白酶和糖苷酶等几个蛋白家族的探针; (2)靶向蛋白质组中各种活泼氨基酸残基, 如半胱氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸等的探针.由于很多含有亲电基团的活性天然产物通过共价修饰靶标蛋白中活性较高的氨基酸位点产生生理效应, 可以利用前述第二类靶向氨基酸残基的活性探针通过竞争性ABPP策略反向鉴定靶标蛋白.如图 5所示, 蛋白质组中的活性氨基酸残基被天然产物共价修饰后, 无法再被相应的活性探针标记.因此, 通过比较天然产物处理前后活性探针对蛋白及其活性位点(Active site)的标记差异, 即可筛选出天然产物共价修饰的靶标蛋白.近年来, 半胱氨酸活性探针已被用于含有亲电基团的天然产物姜黄素(Curcumin)和内源亲电代谢物Hydroxynonenal (HNE)的靶点筛选工作[74, 75].本课题组[76]通过定量质谱技术在HeLa细胞和裂解液中筛选了多个雷公藤红素(Celastrol)靶点蛋白, 通过比较发现早期利用AfBPP策略鉴定的一些靶标并不完全与生理相关.利用类似的竞争性策略, Nomura课题组[77]发现醉茄素(Withaferin A)共价修饰蛋白磷酸酶PP2A复合物PPP2R1A调节亚基的377位半胱氨酸残基, 导致蛋白激酶AKT失活并抑制乳腺癌细胞增殖.最近, 北京蛋白质组研究中心杨靖团队[78]也利用半胱氨酸活性探针, 在不同浓度亲电天然产物存在下, 基于定量质谱技术通过多通道活性巯基筛选(Multiplexed thiol reactivity profiling, MTRP)策略解析了一系列天然产物的靶标蛋白谱, 为高通量鉴定生理靶点提供了新的思路.相关定量蛋白质组学技术将在下一节中进行介绍.

    图 5

    图 5.  竞争性基于活性蛋白质组分析与SILAC定量质谱联用策略鉴定含有亲电反应基团的天然产物靶标蛋白
    Figure 5.  Target identification of electrophilic natural products utilizing competitive activity-based protein profiling combined with SILAC-based quantitative proteomics

    相比传统的AfBPP/CCCP策略, 竞争性ABPP策略最大的优势在于无需进行繁琐的探针合成, 特别适用于天然丰度低, 难于进行化学修饰的复杂天然产物, 同时能够避免化学衍生对天然产物的结构和活性造成影响.但是, 其局限性同样不可回避:首先, 现有的活性探针仅仅局限于半胱氨酸、赖氨酸等少数几种氨基酸残基, 因此该策略仅对能和这些氨基酸残基反应的天然产物适用; 其次, 实验结果可能会受到天然产物引起的间接效应, 如活性位点的后修饰以及蛋白降解的影响, 而非天然产物的直接结合.综上所述, 竞争性ABPP策略的应用面不如AfBPP/CCCP广泛, 但对含有活性亲电骨架的天然产物的生理靶标鉴定能起到非常有效的补充作用.

    2.1.3   靶点鉴定辅助技术

    近年来, 新兴生化技术和仪器的高速发展也为化学蛋白质组学研究带来更多的便利.特别是高分辨蛋白质谱技术的飞速发展使得对蛋白质组进行高通量的定量鉴定成为可能.如前所述, 非特异结合是天然产物靶标识别中一个普遍存在的问题.将定量质谱技术应用于化学蛋白质组学领域, 可以显著提高天然产物靶点鉴定的效率和准确性.目前最为常用的定量质谱技术包括基于活细胞中氨基酸稳定同位素标记(Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture, SILAC)[79]技术, 同位素标签相对与绝对定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification, ITRAQ)[80]技术, 以及串联质量标记(Tandem Mass Tag, TMT)[81]技术等.其中, SILAC技术利用标记的氨基酸在细胞培养过程中对蛋白进行稳定同位素标记, 利用蛋白水解后肽段在一级质谱的分子量差异进行定量比较; ITRAQ/TMT技术则对蛋白质水解后的肽段进行稳定同位素标记, 利用标记试剂在二级质谱上碎裂产生的报告离子对多肽进行定量分析.在定量化学蛋白质组学中, 通过对比探针组、对照组以及竞争组等在亲和纯化后富集到的蛋白质组或肽段组的定量差异, 可以有效降低由非特异结合造成的假阳性率.事实上, 近年来定量蛋白质组学已经成为主流技术并应用于前述多项天然产物靶标鉴定的实例中[82].

    此外, 为解决AfBPP/CCCP策略中低丰度蛋白难于富集和检测的问题, Smith等[83]发展了基于噬菌体展示技术的靶标放大识别方法.具体做法是, 将外源蛋白的基因序列整合到噬菌体外壳蛋白基因中, 使外源基因跟随外壳蛋白一起表达, 并在噬菌体的表面“展示”.被展示的蛋白可以被小分子识别, 并通过前述亲和层析方法富集.随后洗去未结合的游离噬菌体, 结合的噬菌体可以经繁殖扩增, 然后进行孵育和下一轮亲和层析, 经过多轮“富集-洗脱-扩增”后, 与小分子结合的噬菌体被多次富集, 然后通过质谱鉴定富集的噬菌体上展示的蛋白, 即小分子的靶点蛋白. Jin等[84]利用噬菌体展示技术, 通过固定化阿霉素(Doxorubicin)筛选T7噬菌体人类肝脏的cDNA文库, 得到了阿霉素的靶点蛋白hNopp140, 从而揭示了阿霉素的抗肿瘤机制.来自东京理科大学的Sakaguchi研究组[85]利用生物素化的喜树碱(Captothecin)也通过噬菌体展示技术富集特异性结合肽段并推测了多个潜在的靶标蛋白.此外, 蛋白微阵列是一种更为直接的利用高通量筛选分析靶标蛋白的技术[86].将研究的蛋白纯化后固定于固体支持物表面形成蛋白微阵列, 并将带有荧光或者同位素标记小分子与蛋白芯片孵育, 然后通过荧光扫描/放射自显影技术进行检测.当然, 由于将全蛋白质组构建展示文库或者蛋白芯片是非常巨大的工程, 而且一部分蛋白并不能够被分泌表达, 限制了噬菌体展示和蛋白微阵列技术的广泛应用.

    尽管基于化学蛋白质组学的小分子靶点鉴定策略取得了广泛应用和长足发展, 其缺陷也已经很明确:这些方法都需要对天然产物分子进行化学修饰, 从而影响到天然产物原有的活性, 或者阻碍天然产物与真正靶点蛋白的结合, 从而影响靶标鉴定的最终结果.此外, 对一些结构复杂难以合成且自然界丰度极低的天然产物进行化学修饰可能相当困难.因此, 研究者开发出了一系列不需要对小分子药物进行结构改造的靶标筛选方法.天然产物结合后, 靶蛋白的抗蛋白酶水解能力、抗氧化能力以及热稳定性都会发生变化, 由此衍生出多种基于蛋白稳定性的靶标筛选技术.除此以外, 相比化学蛋白质组学技术, 这些基于蛋白稳定性变化的生物物理学方法, 可以高效筛选混合物的靶标蛋白, 因此特别适用于传统中药复方药物的靶点识别.

    2.2.1   基于小分子亲和性的蛋白稳定性筛选技术

    2009年, 来自美国加州大学圣迭戈分校的Huang研究组[87]提出了一种名为依赖于靶点稳定性的药物亲和反应(Drug affinity responsive target stability, DARTS)的小分子药物靶标辨识技术.其原理是当天然产物小分子结合靶标蛋白后, 可能阻碍蛋白酶与靶点蛋白消化位点的作用, 导致蛋白消化不完全.这些在小分子结合前后抗酶解稳定性发生变化的蛋白可以通过电泳检测, 随后利用生物质谱确定小分子直接作用的靶点蛋白(图 6).通过Rapamycin-FKBP12模型实验验证了该策略的可行性后, 该研究组利用DARTS策略鉴定了多酚天然产物白藜芦醇(Resveratrol)的蛋白靶标eIF4A.

    图 6

    图 6.  依赖靶点稳定性的药物亲和反应的天然产物靶标蛋白鉴定策略
    Figure 6.  Target identification of natural products by drug affinity responsive target stability (DARTS)

    2014年, Huang研究组[88]发现三羧酸循环中的重要的代谢中间产物α-酮戊二酸(α-KG)能够延长线虫的寿命, 运用DARTS策略发现α-KG通过直接结合ATP合成酶β亚基(ATP5B)降低ATP合成能力并减少氧的消耗, 增强线虫和哺乳动物细胞的自噬作用, 从而揭示了α-KG介导长寿的机制.同年, Fleta-Soriano等[89]采用DARTS策略鉴定了一种黏细菌代谢产物Ratjadone A通过结合CRM1/Exportin-1蛋白最终起到抑制人免疫缺陷病毒HIV感染的作用.第二军医大学的研究人员也利用DARTS策略鉴定了雷公藤红素(Celastrol)类似物NST-001的潜在靶标蛋白脂肪酸合酶(Fatty acid synthase, FAS)[90].近期, 意大利萨莱诺大学的研究人员应用DARTS技术确定了萜类天然产物Laurifolioside在PC-3和MCF-7细胞中直接作用于内涵素重链(Clathrin heavy chain 1)蛋白, 并抑制内涵素介导的内吞作用[91]. DARTS策略的优势在于整个实验操作简便, 特别适用于鉴定亲和力较差但丰度较高的蛋白靶标, 但结果可能会受到非直接靶标的干扰, 特别是在活细胞体系中[87].

    2.2.2   基于小分子亲和性的蛋白热稳定性筛选技术

    2013年, 来自瑞典科学家开发了一种名为细胞热稳定性迁移试验(Cellular Thermal Shift Assay, CETSA)的新工具, 用于直接检测各类药物与细胞中靶标蛋白的结合[92, 93].其核心概念是:当药物分子结合靶标蛋白时会表现出热稳定性的变化.早期, 该方法更多通过免疫印迹实验(Western blot)应用于靶标验证工作, 因此必须依赖于合适的抗体, 从而限制了该方法的无偏见性.随着平行多通道定量蛋白质组学技术(iTRAQ/TMT)的发展, 来自欧洲分子生物学实验室的Savitski研究组[94]开发出一种全新的基于蛋白质热稳定性的高通量靶标筛选方法——蛋白质组热稳定性分析技术(Thermal Proteome Profiling, TPP).其具体做法是, 在活细胞和细胞裂解液层面同时准备若干个等份(通常是10个)的对照样品(DMSO)和用天然产物小分子处理的样品.将各组中的每个等份样品进行不同温度的热处理, 并通过超高速离心(100000 g)除去变性/聚集的蛋白质.剩余的可溶蛋白通过SDS-PAGE分离后, 进行胶内酶解并对肽段进行稳定同位素标记.将不同温度处理的样品混合后进行离线肽段分级, 最后利用定量质谱分析肽段的相对含量并得到每个蛋白在小分子处理组和对照组的熔化曲线并计算熔点值Tm(即某蛋白绝对量减少一半时的温度), 根据小分子处理组和对照组的熔点变化值ΔTm来指示小分子和蛋白有无直接作用(图 7).一般认为, 只有在活细胞和细胞裂解液层面同时观察到Tm值在加入小分子后同向变化的蛋白才有可能是小分子的直接靶标.在用ATP分子进行概念验证后, 作者通过TPP方法鉴定了50多个星形孢菌素(Staurosporine)的靶标蛋白, 其中包括一个与亚铁血红素Heme生物合成相关的蛋白亚铁螯合酶(Ferrochelatase, FECH).进一步研究发现, 该酶是很多激酶抑制剂类药物引起光毒性副反应有关的脱靶蛋白(off target).早期的TPP方法仅适用于可溶性胞浆蛋白, 随后, 研究人员发现在裂解缓冲液中加入少量去垢剂(0.4% NP-40)并不会引起热变性/聚集蛋白的复溶, 从而将该策略的应用拓展到与小分子相互作用的膜蛋白上[95].同时, 来自奥地利等国的科研人员改进了TPP方法的实验细节, 使之更易于操作[96].比如, 在分离变性/聚集蛋白时使用普通的低速离心(17000 g); 采用超滤辅助样品制备(Filter Aided Sample Preparation, FASP)的方法进行溶液酶切; 以及数据处理过程的优化.

    图 7

    图 7.  依赖蛋白质组热稳定性差异的天然产物靶标蛋白鉴定策略[88]
    Figure 7.  Target identification of natural products by thermal proteome profiling (TPP)[88]

    最近, Savitski研究组[97, 98]更新并发展了一种二维蛋白质组热稳定性分析技术(Two-dimensional thermal proteome profiling, 2D-TPP), 即同时引入反应温度和药物浓度两个变量:首先, 按前述TPP方法获得蛋白相对含量的温度响应曲线; 其次, 固定加热温度, 通过改变小分子的浓度获得浓度响应曲线.通过结合TMT技术进行蛋白定量, 作者找到了上市药物帕比司他(Panobinostat)的脱靶蛋白.不过, 该策略应用于天然产物靶标鉴定的案例尚无报道.随着高分辨质谱技术的不断发展, 基于热稳定性的靶标鉴定技术在未来具有很大应用前景.

    此外, Park研究组[99]发展了一项基于二维电泳胶内荧光差异的蛋白质组热稳定性分析技术(Thermal stability shift-based fluorescence difference in two-dimensional gel electrophoresis, TS-FITGE).其起始操作与TPP类似, 即对小分子药物处理组和对照组分别在不同温度下变性, 高速离心取可溶性蛋白质.此后, 将不同荧光标记试剂分别加入对照组(Cy3, 绿色)和实验组(Cy5, 红色).将相同处理温度的实验组和对照组混合并进行二维电泳, 再经图像自动处理技术可以得到混合点的两种荧光标记的比值并定量.利用该策略, 作者首先验证了一个结构复杂的天然产物草苔虫素(Bryostatin 1)的靶标, 并鉴定了一种结构简单的不利于探针化修饰的天然苯乙胺生物碱Hordenine的靶标核仁磷蛋白(Nucleophosmin, NPM).相比TPP方法, TS-FITGE技术的最大优势在于无需使用成本较高的稳定同位素标记试剂, 能够通过荧光信号直观地看到靶蛋白的Tm值变化.

    2.2.3   基于氧化速率的蛋白稳定性筛选技术

    基于类似的思路, 研究人员开发出另一种鉴定靶蛋白的方法, 即基于氧化速率的蛋白稳定性测试(Stability of Proteins from Rates of Oxidation, SPROX)[100].蛋白质结合底物后在氧化环境中更为稳定, 相对需要更多氧化剂将其氧化.通过比较不同复合物氧化到相同程度需要的氧化剂量, 就可以衡量不同蛋白质和底物分子的相互作用强度.具体操作上, SPROX也将用DMSO(对照组)和小分子处理(样品组)的蛋白质混合物等分, 加入不同浓度的变性剂和氧化剂(过氧化氢), 使暴露的甲硫氨酸侧链被氧化标记.甲硫氨酸的氧化程度用于报告在每种变性剂浓度下的折叠平衡, 利用定量质谱, 得到两条有无小分子存在下的SPROX曲线, 根据半变性时的变性剂浓度差ΔC1/2值, 就能指示小分子和蛋白有无作用.

    但是很明显, SPROX方法的局限性在于必须通过检测含有甲硫氨酸的多肽来定量.这也限制了该方法的无偏见性以及进一步应用.

    2.2.4   基于色谱共洗脱的筛选技术

    利用色谱共洗脱进行靶标识别(Target identification by chromatographic co-elution, TICC)的技术是由加拿大多伦多大学Emili团队[101]开发的一种通过液相色谱在非变性条件下检测小分子与靶标的相互作用的方法.小分子与靶标结合后, 其在液相色谱的保留时间会发生显著迁移, 与靶标蛋白的保留时间一致.随后, 利用质谱检测与小分子同时洗脱的蛋白, 就能获得候选靶标蛋白的信息.利用该策略, Emili研究组[101]首先利用已知的小分子配体-靶标复合物, 包括Radicicol-Hsp90, Sordarine-EIF2等验证了概念的可行性, 并鉴定了抗真菌天然产物4513-0042的靶标蛋白Erg6p.该策略的优势在于可以检测到低丰度和低亲和度的靶标蛋白, 但其局限性也相当明显, 如无法检测共价作用的靶标, 其它共洗脱蛋白的干扰, 以及对蛋白稳定性要求较高等.

    在蛋白质组学技术兴起之前, 基因组突变筛选是最常用的活性小分子靶标筛选方法之一.该策略针对模式生物或细胞进行各种遗传操作, 如基因突变、敲除或过表达等建立筛选克隆库, 根据小分子处理后各个克隆存活率来筛选其靶标.最后, 表达相关基因并验证小分子与蛋白是否直接相互作用.由于与人类基因组表达谱类似度高, 酵母是最为常用的筛选体系.多伦多大学Boone团队[102, 103]建立了一系列酵母单基因敲除的突变体接受小分子敏感性的检测, 并鉴定了多个结构复杂的海洋抗真菌天然产物Papuamide B, Stichloroside和Theopalauamide的作用靶点. Supek等[104]建立了7000多个随机基因过表达的酵母突变体库用于小分子靶标的筛选.此外, 斯坦福大学Giaever团队[105], 默克公司Lum等[106], 以及多伦多大学Andrews团队[107]在这一领域也有诸多工作, 不过他们的大部分成果集中于合成的药物化学分子.

    随着结构生物学与计算化学的发展, 通过反向分子对接(Inverse Docking)方法进行小分子靶标鉴定的概念被首次提出.该策略以小分子化合物为探针, 在已知结构的数据库内搜寻可能与之结合的蛋白, 通过研究小分子和已知结构的靶点蛋白之间的相互作用, 预测药物潜在的作用靶点[108].作为一种补充策略, 反向分子对接已经成为确定小分子化合物潜在靶标的有效工具之一.其操作过程大致可以归纳为: (1)潜在靶点蛋白结构数据库的收集和准备; (2)调整小分子配体姿势; (3)对各种潜在的小分子-蛋白结合进行评分和排序.目前已经开发了许多用于反向对接的靶标数据库, 包括TTD, PDTD, TargetDB和DART等[109~114].比较流行的用于反向对接的程序包括新加坡国立大学开发的INVDO-CK[115], 上海药物所蒋华良团队开发的TarFisDock[116]和PharmMapper[117], 英国利兹大学Jackson团队开发的Reverse Screen 3D[118], 国立台湾大学开发的IdTarget[119]等. Park等基于反向对接策略, 利用Glide反向对接工具[120]在HDTD数据库中发现了人参皂苷的四种潜在靶标蛋白MEK1, EGFR, Aurora A和thrombin以及其它可能与毒副作用相关的靶蛋白[121].目前, 通过化学生物信息学手段进行靶标预测依旧处于初级阶段, 其应用与推广仍然受到诸多因素影响, 如靶点信息不完备、准确性有待进一步提高等.

    与以天然产物为起点的逆向靶标鉴定策略不同, 正向策略通过多组学层面的表型变化以及该变化所对应的细胞信号通路等已知信息来间接地推测出化合物的直接靶点和作用模式(Mode of action, MOA).相关表型筛选方式包括差异基因组学筛选, 差异蛋白质组学筛选, 细胞形态学比较和细胞活性筛选等.

    早期的差异基因组学策略通过检测小分子处理前后基因表达水平的改变获得其特征表达谱, 进而研究小分子作用的信号通路上的相关基因及其调控网络, 以期推测小分子的作用靶标[122].但是, 基因表达谱的变化也不能直接确定药物靶标分子, 因此在天然产物靶标鉴定领域的应用存在着很大的局限性.作为化学生物学学科的创始人之一, Schreiber等[123]在2016年提出了结合差异基因组学和大数据分析相结合筛选小分子靶标蛋白及作用模式的新策略.研究人员将481种小分子化合物加入823种人类癌细胞系中, 将其细胞毒性与基础转录水平的变化相关联, 通过大数据分析和比较对小分子的作用机制和直接靶标产生了全新的认识.尽管该策略在靶标鉴定领域也存在一定的缺陷, 比如某些靶标在基因层面可能不存在差异, 或者差异表达的基因并不影响细胞毒性等, 该策略对一些已知的具有细胞毒性的包括天然产物在内的小分子化合物的生理靶标的无偏鉴定提供了很好的补充.

    差异蛋白质组学研究方法通过比较小分子作用前后细胞中蛋白质相对丰度上的差异来研究天然产物的作用机制.这些变化为寻找药物作用靶标提供了依据.早期二维凝胶电泳与质谱技术联用是蛋白组学研究的常用方法.通过提取天然产物小分子处理前后细胞的总蛋白质组进行二维电泳, 研究表达量发生改变的蛋白质在细胞生命过程中发挥的作用, 不仅可以明确药物对生物体生命过程造成的影响, 也可以用来推测天然产物的作用机制, 为其靶标确定奠定基础.此后, 荧光差异二维凝胶电泳技术(Two dimension difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)使二维凝胶电泳技术有了新的发展.定量蛋白质组学技术的成熟使研究者能够获得大量低丰度蛋白的信息.近年, 这方面的研究涵盖了藤黄酸、青蒿素、雷公藤红素等天然产物[124~129].

    但是, 差异蛋白质组学方法鉴定天然产物的直接靶标蛋白是非常困难的.只有极少的实例通过表达谱的变化推测出直接靶标. Towbin等[130]发现海绵中提取的天然产物Bengamide的类似物LAF389处理细胞后, 14-3-3γ蛋白在二维电泳胶的位移发生改变.进一步通过二级质谱发现该位移是由其N端甲硫氨酸未被切除所导致.据此推测, Bengamide类天然产物的靶标蛋白很可能是甲硫氨酸氨基肽酶MetAP家族蛋白.最后, 作者通过体外酶活抑制和体内敲除实验证明了这一靶标蛋白.

    顾名思义, 细胞形态学比较是基于小分子处理前后各细胞器的形态变化快速筛选小分子靶标和作用模式的方法[131].该方法同样由日本理化研究所Osada等[132]提出, 该研究团队根据200多个活性化合物处理后细胞形态的变化提出了12个相关参数, 通过一定的算法和统计学工具对这些参数进行数据处理, 获得相似度和可靠性的相关打分, 按照打分推测小分子化合物的靶标和作用模式.该方法操作极为简单且可重复性强, 只需要在普通显微镜下观测明场细胞和细胞核染色图像.利用细胞形态学比较结合差异蛋白质组学筛选, 该团队鉴定了一系列药物分子以及活性天然产物鱼藤酮(Rotenone)和白藜芦醇(Resveratrol)的作用靶标[126].

    NCI-60筛选是在20世纪80年代后期由美国国立癌症研究所(National Cancer Institute, NCI)提供的最早用于表型筛选的系统之一. NCI-60细胞系是用于抗癌药物测试的癌细胞样本群.早期该系统多用于天然药物的筛选, 并鉴定了超过200多个具有抗癌活性的天然产物. Shoemaker等[133]提出可以将任一未知靶点的化合物的NCI-60筛选数据与已知药物进行对比, 并建立了一套比较算法(COMPARE algorithm), 从而获取其靶标和作用模式的相关信息. Hamel等[134]利用该方法推测并鉴定了天然产物大田软海绵素Halichondrin B靶向Tubulin蛋白并抑制微管聚合.近年来, 由于NCI-60细胞系历经几千代的培养, 其基因组成和行为均发生了改变.为此, NCI决定转为使用人源性肿瘤组织异种移植(Patient-derived tumor xenograft, PDX)模型, 从而更接近其原生的生长环境.

    来自加拿大的Linington团队[135]将细胞形态学筛选、细胞活性筛选与高分辨率非靶向代谢物组学分析相结合, 开发了一种名为Compound Activity Mapping的天然产物生物活性和化合物结构预测平台.应用该平台, 该团队发现了一类新的天然产物家族Quinocinnolino-mycins能够引起内质网应激(ER stress)和蛋白质解折叠(protein unfolding).尽管无法给出直接的靶标蛋白信息, 该研究提供了一种高通量筛选天然产物和作用模式的方法.

    雷公藤甲素(Triptolide), 又称雷公藤内酯醇, 是一种具有强烈的抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等活性的萜类天然产物.由于其结构中含有多个活性基团, 对其探针化的同时保留其原有生理活性相当困难.尽管此前多个课题组利用化学蛋白质组学方法鉴定了多个靶点蛋白[29, 136~138], 但仍无法完全解释其抗炎生理功能.结合早先文献报道的相关信息[139~141], Liu课题组[142]利用同位素标记的核苷酸和氨基酸, 系统地研究了雷公藤甲素对细胞核内DNA复制, RNA转录和蛋白质翻译的调控作用, 并发现其通过RNA聚合酶Ⅱ抑制RNA转录.随后通过体外生化实验及体内同位素探针标记发现雷公藤甲素共价结合通用转录因子TFIIH的XPB大亚基的342位半胱氨酸, 从根本上解释了雷公藤甲素的抗癌和抗炎分子机制[143].运用类似策略, 该课题组[144]近期鉴定了海洋天然产物Agelastatin A通过直接作用于核糖体核心区域的肽键转移酶抑制蛋白质翻译, 从而表现出强烈的抗肿瘤活性.尽管这类由天然产物在核内信号通路入手, 逐步缩小范围推测其靶标蛋白的方法非常精妙, 但并不具备广泛适用性.

    天然产物靶标蛋白的鉴定和相关研究在新药研发领域具有重要的理论指导意义和实用价值.随着近年来基因组学和蛋白质组学技术快速发展, 并与有机化学、生物物理学、生物信息学等学科的进一步交融, 多种小分子化合物靶标鉴定的策略应运而生.基于化学蛋白质组学的直接亲和富集的方法仍是目前小分子靶标鉴定的主流方案, 而生物物理学技术的发展则为逆向策略非标记(Label free)无偏见性寻靶提供了新的选择.此外, 基于表型的正向靶标鉴定策略针对逆向策略的缺陷提供了很好的补充和辅助(图 8).这些新方法的应用更加明确地阐明天然药物的作用机制及可能的毒副作用, 从而为从分子水平上进行新药研发提供重要的理论基础.

    图 8

    图 8.  基于天然产物-靶标-表型的正向(红色)和逆向(蓝色)靶标蛋白鉴定策略
    Figure 8.  Forward (red) and reverse (blue) strategies for target identification of natural products

    必须注意的是, 不管是正向还是逆向策略得到的靶标蛋白信息都是“潜在的(potential)”或“推测的(putative)”, 有时潜在靶标蛋白的数量可能有上百个, 需要在物理结合和生理功能层面作进一步验证.为了降低靶标验证的工作量, 可以同时选取多种策略进行靶标鉴定.比如, Savitski等[97]在筛选帕比司他的靶点蛋白的研究中同时采用了2D-TPP和AfBPP的策略, 获得了精确的靶点信息并成功验证.

    中药是我国传统文化的宝贵财富.但是, 一些中药复杂体系的“多成分、多靶点”的协同作用模式, 使其直接靶标的鉴定更是困难, 因此严重制约了中药的国际化进程.因此, 通过前述各种化学生物学研究策略和技术手段鉴定中药天然产物复杂体系的直接靶标, 可以从根本阐明其发挥生物学功能的基础, 在中药来源的天然药物开发过程中有着重要的意义和广阔的应用前景.

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  • 图 1  基于亲和蛋白质组分析策略: (a)固定化天然产物分子; (b)天然产物生物素化探针; (c)基于天然产物自身反应活性(红色部分)的带有生物正交反应基团(炔基)的探针; (d)基于光亲和基团的炔基修饰的天然产物探针

    Figure 1  Affinity-based profiling of protein targets of natural products (NPs): Workflows of target identification through (a) immobilized NPs; (b) Biotinylated NP probes; (c) bioorthogonal probes based on intrinsic reactivity of NPs; (d) bioorthogonal photoaffinity probes

    图 2  用于靶点蛋白鉴定的固定化天然产物树脂或生物素化天然产物探针实例.固定化天然产物的树脂与细胞裂解液混合孵育后, 可以直接对靶标蛋白进行富集和鉴定; 生物素化探针与活性蛋白质组(活细胞或细胞裂解液)孵育后, 通过固载链霉亲和素(Avidin/Streptavidin)的树脂对靶标蛋白进行分离富集和鉴定(蓝色代表衍生化基团)

    Figure 2  Representative natural product-immobilized matrix or biotinylated natural products for target identification. NP-immobilized affinity matrix can be applied directly in target enrichment and identification; For biotinylated NP probes, living cells or cell lysates were incubated with the probes, and binding proteins were enriched by avidin/streptavidin-coated matrix for further identification (Blue: reporting group and linker)

    图 3  用于靶点蛋白鉴定的基于天然产物原生反应活性的生物正交探针实例:探针与活性蛋白质组(活细胞或细胞裂解液)孵育后, 与其靶标蛋白不可逆共价结合, 随后通过生物正交反应引入报告基团进行靶标富集和鉴定(蓝色部分代表报告基团和连接链)

    Figure 3  Representative bio-orthogonal probes for target identification of NPs with intrinsic relativities. Native proteomes were incubated with probes and covalent bond was formed. Probe-labelled proteins were subjected to target enrichment and identification (Blue: reporting group and linker)

    图 4  用于靶点蛋白鉴定的含有光亲和基团的天然产物探针:探针与活性蛋白质组(活细胞或细胞裂解液)孵育后, 在紫外激发下光亲和基团分解并产生高活性的自由基中间体, 与其靶标蛋白不可逆共价结合, 随后通过生物正交反应引入或直接通过报告基团或进行靶标富集和鉴定. (蓝色部分代表报告基团和连接链, 紫色部分代表光亲和基团)

    Figure 4  Representative photoaffinity probes for target identification. Native proteomes were incubated with probes and irradiated by UV. Photoaffinity groups were activated and covalent bond was formed between probe and protein target. Finally photo-labelled proteins were subjected to target enrichment and identification. (Blue: reporting group and linker; purple: photoaffinity group)

    图 5  竞争性基于活性蛋白质组分析与SILAC定量质谱联用策略鉴定含有亲电反应基团的天然产物靶标蛋白

    Figure 5  Target identification of electrophilic natural products utilizing competitive activity-based protein profiling combined with SILAC-based quantitative proteomics

    图 6  依赖靶点稳定性的药物亲和反应的天然产物靶标蛋白鉴定策略

    Figure 6  Target identification of natural products by drug affinity responsive target stability (DARTS)

    图 7  依赖蛋白质组热稳定性差异的天然产物靶标蛋白鉴定策略[88]

    Figure 7  Target identification of natural products by thermal proteome profiling (TPP)[88]

    图 8  基于天然产物-靶标-表型的正向(红色)和逆向(蓝色)靶标蛋白鉴定策略

    Figure 8  Forward (red) and reverse (blue) strategies for target identification of natural products

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  • 通讯作者:  肖友利, ylxiao@sibs.ac.cn
  • 收稿日期:  2017-11-06
  • 网络出版日期:  2018-03-15
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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