使用新型芳基硼酸酯保护基高效合成双环肽BI-32169

引用本文: 宋慧, 刘超, 吴仪君, 胡宏岗, 阎芳. 使用新型芳基硼酸酯保护基高效合成双环肽BI-32169[J]. 化学学报, 2018, 76(2): 95-98. doi: 10.6023/A17100473 shu

Citation: Song Hui, Liu Chao, Wu Yijun, Hu Honggang, Yan Fang. Efficient Synthesis of Bicyclic Peptide BI-32169 Utilizing a Novel Aryl Boronate Ester Protecting Group[J]. Acta Chimica Sinica, 2018, 76(2): 95-98. doi: 10.6023/A17100473 shu

使用新型芳基硼酸酯保护基高效合成双环肽BI-32169

宋慧 ^a, ,
刘超 ^b, ,
吴仪君 ^a, ,
胡宏岗 ^{b,
,} ,
阎芳 ^{a,
,}

a.
潍坊医学院药学院潍坊 261053
b.
第二军医大学药学院有机化学教研室上海 200433

通讯作者: 胡宏岗, E-mail: hhu66@smmu.edu.com; 阎芳, E-mail: Yanfang303@163.com

基金项目:

项目受山东省自然科学基金、国家自然科学基金（Nos.ZR2016HL57，81700167）资助

摘要: 芳基硼酸酯作为一种新型的多肽固相合成保护基，相比较烯丙基等传统保护基具有脱除条件简便、高效以及脱保护试剂绿色环保等优势.采用标准9-芴甲氧羰基（Fmoc）固相合成策略，通过固相环合方法，以芳基硼酸酯作为Asp侧链保护基成功首次合成具有独特双环结构的人胰高血糖素受体多肽类抑制剂BI-32169.该方法合成效率高，操作简便，能够为其他类似环肽的化学全合成提供参考.

关键词:

English

Efficient Synthesis of Bicyclic Peptide BI-32169 Utilizing a Novel Aryl Boronate Ester Protecting Group

Song Hui ^a, ,
Liu Chao ^b, ,
Wu Yijun ^a, ,
Hu Honggang ^{b,
,} ,
Yan Fang ^{a,
,}

a.
Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Weifang Medical University, Weifang 261053
b.
Department of Organic Chemistry, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433

Corresponding author: Hu Honggang, hhu66@smmu.edu.com; Yan Fang, Yanfang303@163.com

Received Date: 30 October 2017
Available Online: 15 February 2018
Fund Project:

Project supported by the Natural Science Fund of Shandong Province and the National Natural Science Foundation of China (Nos. ZR2016HL57, 81700167)

Abstract: Developed as novel protecting groups for solid-phase peptide synthesis, aryl boronate ester based amino acid building blocks exhibit many advantages over Alloc/Allyl groups and other traditional protecting groups due to their environmental-friendly deprotection conditions and high deprotection efficiency. These protecting groups have been found to exhibit all of the chemical properties compatible to the standard Fmoc(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) solid-phase peptide synthesis and to be orthogonal to other protection groups, such as ^tBu (tert-butyl), pbf (2, 2, 4, 6, 7-penta-methyldihydroben zofuran-5-sulfonyl), Trt (trityl) and Boc (t-Butyloxy carbonyl). In this paper, the aryl bronate ester protected Asp was employed to synthesize a lactam-bridged bicyclic peptide, BI-32169 ([Gly-Leu-Pro-Trp-Gly-Cys-Pro-Ser-Asp]-Ile-Pro-Gly-Trp-Asn-Thr-Pro-Trp-Ala-Cys), which is a human glucagon receptor peptide inhibitor, via on-resin cyclization and solution phase oxidative folding. First of all, the Fmoc-Asp(pDobb)-OH (pDobb, dihydroxyborylbenzyl pinacol ester) was successfully synthesized via esterification between Fmoc-Asp-O^tBu and 4-(4, 4, 5, 5-tetramethyl-1, 3, 2-dioxaborolan-2-yl) followed by deprotection of ^tBu with trifluoroacetic acid. Subsequently, the fully protected linear peptide was obtained by incorporating Fmoc-Asp(pDobb)-OH into peptide backbone through standard SPPS using HCTU/DIPEA as the coupling reagent and base. The following release of pDobb group on Asp side chain and deprotection of the N-terminal Fmoc group on solid support provided the linear peptide containing a free Asp residue and an N-terminal amino group. The critical cyclization step was accomplished on resin using PyAOP/HOAt/NMM, followed by resin cleavage and global deprotection with TFA/Phenol/Water/TIPS to give the monocyclic peptide. Finally, the intramolecular disulfide bond was formed through oxidative folding in an aqueous environment with 10% DMSO to provide the final bicyclic target, BI-32169, with a total yield about 27%. In summary, the human glucagon receptor peptide inhibitor BI-32169 was successfully synthesized utilizing an aryl boronate ester based amino acid building block via an on-resin cyclization and solution phase oxidative folding strategy. This convenient and efficient synthetic route could provide a way for chemical total synthesis of BI-32169 and other analogues.

Key words:

1   引言

糖尿病是一项公认的世界性医学难题.最近的一项流行病学调查显示, 2010年中国成人糖尿病患病率已达11.6%, 且呈迅速增长趋势^[1].目前糖尿病治疗药物及其作用靶标呈现多样化趋势, 降糖药物的研究已成为热点^[2].有关研究表明除胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损可导致糖尿病外, 空腹状态下高胰高血糖素血症和糖负荷后的胰高血糖素抑制作用的缺失也会引起糖尿病^[3].因此, 在受体水平上拮抗胰高血糖素作为一种治疗糖尿病手段, 具有重要的潜在应用价值^[4].在寻找新型胰高血糖素拮抗剂的过程中, Potterat小组^[5]发现链霉菌属微生物Streptomyces sp. (DSM 14996)的培养液中获得的多肽BI-32169显示出对人胰高血糖素受体抑制活性(IC₅₀＝440 nmol/L), 可以作为具有良好研发前景的抗糖尿病药物先导化合物, 具有较高的研究和应用价值.

经过MS和NMR结构鉴定发现^[6], BI-32169是由19个氨基酸残基组成的双环肽, 其结构中第9位天冬氨酸残基侧链羧基与N端甘氨酸残基氨基形成酰胺键构成第一个环状结构.第6位与9位半胱氨酸残基侧链巯基间形成二硫键最终形成双环结构(图 1).由于BI-32169独特的双环结构, 化学合成挑战具有一定的难度, 至今国内外未见相关文献报道.

图1 BI-32169的结构式 Figure1. The structural formula of BI-32169

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直链多肽的环合是环肽合成的关键步骤, 主要分为液相环合与固相环合策略^[7].液相环合是较为经典的环合策略, 其将直链多肽从固相载体上切下后, 在溶液中进行环合, 但由于其繁琐的纯化操作以及对环合条件的苛刻要求, 该方法效率和产率都较为低下^[8].固相环合策略是在直链多肽合成完毕后, 直接在固相载体上进行环合, 因此具有操作简便、易于纯化以及产率高等优点^[9].然而, 由于其需要在固相载体上完成环合, 该策略依赖于正交保护基团的引入.近年来随着多肽固相合成正交保护基团的迅猛发展, 极大地推动了固相环合策略的应用^[10].前期我们团队开发出一种新型芳基硼酸酯保护基:苄氧羰基硼酸频哪醇酯(pDobz, p-dihydroxy-borylbenzyloxycarbonyl pinacol ester)与苄基硼酸频哪醇酯(pDobb, dihydroxyborylbenzyl pinacol ester, 图 2), 其与Boc, ^tBu, pbf和Trt等保护基有着良好的正交性^[11].此外, 该保护基在氮氧化物与弱酸的处理下, 能够快速高效脱除.与传统Alloc/Allyl保护基相比, 解决了其重金属残留、操作条件苛刻、操作过程费时以及难以解保护等缺点^[12], 可以作为固相环合策略中正交保护基团的理想选择.

图2 BI-32169的合成策略(星号代表侧链保护基团) Figure2. The chemical synthesis of BI-32169. The resin-bound peptides were protected on side chains at asterisk sites. The following protecting groups for amino acid side chains were used: tert-butyl (^tBu; for Thr, Ser), tert-butyloxycarbonyl (Boc; for Trp) and trityl (Trt; for Asn, Cys).

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本文利用pDobb作为天冬氨酸侧链正交保护基团, 采用Fmoc多肽固相合成策略完成直链多肽的合成, 而后成功脱除pDobb并在树脂上完成酰胺键环合.最后在液相中完成二硫键的氧化折叠, 较为高效地完成了BI-32169的首次化学全合成.

2   结果与讨论

首先以Fmoc-Asp-O^tBu为起始原料, 获得pDobb保护的天冬氨酸[Fmoc-Asp(pDobb)-OH]后^[11], 我们以Rink Amide Resin树脂为载体, 利用6-氯苯并三氮唑-1, 1, 3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)/N, N-二异丙基乙胺(DIPEA)为缩合体系, 合成带有pDobb保护基团的直链多肽1a.此后利用N-甲基-N-苯基苯胺N-氧化物和三氟乙酸(TFA)在固相上脱除pDobb得到环合前体1b, 在(3H-1, 2, 3-三唑并[4, 5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyAOP)/1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)/N-甲基吗啡啉(NMM)的作用下完成固相环合得到1c, 最后利用切割试剂将单环肽从树脂上切下, 在含有10% DMSO的磷酸盐缓冲溶液中进行氧化折叠, 最终实现BI-32169的全合成(图 2).

2.1   [Fmoc-Asp(pDobb)-OH]的合成

以Fmoc-Asp-OtBu为起始原料DCM为溶剂, 分别加入(4-(4, 4, 5, 5-四甲基-1, 3, 2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-苯基)-甲醇, N, N'-二环己基碳二亚胺(DCC), 4-二甲基氨基吡啶(DMAP), 反应完成后, 经萃取、浓缩、纯化得到Fmoc-Asp(pDobb)-O^tBu, 使用TFA/DCM (1:3, V/V)脱除氨基酸C端保护基, 最终获得Fmoc-Asp(pDobb)-OH, 路线如图 3所示^[11]. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.88 (d, J＝4.0 Hz, 2H), 7.75 (d, J＝4.0 Hz, 2H), 7.69 (d, J＝4.0 Hz, 2H), 7.65 (t, J＝4.0 Hz, 2H), 7.42~7.36 (m, 4H), 7.32 (t, J＝4.0 Hz, 2H), 5.14 (s, 2H), 4.44~4.40 (m, 1H), 4.29~4.28 (m, 2H), 4.23~4.21 (m, 1H), 2.92~2.88 (m, 1H), 2.77~2.73 (m, 1H), 1.27 (s, 12H); ¹³C NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 174.22, 171.87, 157.74, 145.68, 145.63, 142.60, 141.23, 136.36, 129.51, 128.94, 128.82, 127.11, 127.07, 121.99, 85.54, 67.63, 67.40, 52.31, 48.48, 37.80, 26.51. ESI-MS m/z calcd for C₃₂H₃₄BNO₈ 571.24, found [M+H]⁺ 572.39, [M－H]^－ 570.11.

图3 Fmoc-Asp(pDobb)-OH的合成路线 Figure3. Synthesis route of Fmoc-Asp(pDobb)-OH. Reagents and conditions: (a) Fmoc-Asp-O^tBu, 4-(4, 4, 5, 5-tetramethyl-1, 3, 2-dioxaboro-lan-2-yl)-phenyl)-methanol, DCC, DMAP, DCM, r.t., 4 h; (b) TFA/DCM (1:3, V/V), r.t., 2 h.

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2.2   多肽的合成

2.2.1   BI-32169主链片段的合成

使用Rink Amide Resin树脂为载体(载样量＝0.27 mmol/g), HCTU/DIPEA为缩合体系, 20%哌啶/DMF溶液为脱保护试剂, 依次偶联Fmoc保护的氨基酸与Fmoc-Asp(pDobb)-OH, 合成直链多肽1a.取少量树脂进行痕量切割, 通过高分辨质谱(HR-Q-TOF-MS)确认分子量(图 4).分子式: C₁₁₇H₁₄₇BN₂₄O₂₈S₂, 理论值: 2412.019, 测量值[M+3H]⁺为805.0467.

图4 1a反相高效液相色谱图和高分辨质谱图 Figure4. RP-HPLC and HR-Q-TOF-MS analysis of 1a

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2.2.2   侧链芳基硼酸酯保护基的脱除及固相环合

采用N-甲基-N-苯基苯胺N-氧化物(5 equiv.)/DCM溶液处理树脂, 而后脱除N端Fmoc保护基, 最后在TFA/间甲酚(m-cresol)/DCM (5:20:75, V/V/V)混合溶液的作用下完成pDobb保护基的脱除, 得到环合前体1b. 取少量树脂进行痕量切割, 通过HR-Q-TOF-MS确认分子量(图 5).分子式: C₉₅H₁₃₀N₂₄O₂₄S₂, 理论值: 2055.8971, 测量值[M+2H]⁺为1028.9681.

图5 1b反相高效液相色谱图和高分辨质谱图 Figure5. RP-HPLC and HR-Q-TOF-MS analysis of 1b

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2.2.3   固相环合与肽链片段的切割

采用PyAOP (5 equiv.)/HOAt (5 equiv.)/NMM (10 equiv.)为缩合体系进行固相环合得到单环多肽1c.利用切割试剂(三氟乙酸/苯酚/水/三异丙基硅烷, 88:5:5:2, V/V/V/V)将肽链从树脂上切下并同时解除所有侧链保护基, 得到单环粗肽1c, 产物不经纯化可直接进行下一步.通过HR-Q-TOF-MS确认分子量(图 6).理论值: 2037.8866, 分子式: C₉₅H₁₂₈N₂₄O₂₃S₂, 测量值[M+2H]⁺为1019.9624.

图6 1c反相高效液相色谱图和高分辨质谱图 Figure6. RP-HPLC and HR-Q-TOF-MS analysis of 1c

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2.2.4   多肽的氧化折叠

将1c溶解在盐酸胍磷酸盐缓冲液(6 mol/L Gn•HCl/100 mmol/L Na₂HPO₄), 形成0.5 mg/mL溶液后调整溶液pH为7.4.加入10% DMSO溶液作为氧化剂进行折叠^[13], 通过RP-HPLC监测反应完全后, 粗品经制备高效液相色谱纯化、冻干, 得到白色粉末74 mg, 总产率为27%.通过HR-Q-TOF-MS确认分子量(图 7).理论值: 2035.8709, 分子式: C₉₅H₁₂₆N₂₄O₂₃S₂, 测量值[M+Na]⁺为2058.8792.确认为目标产物BI-32169.

图7 BI-32169反相高效液相色谱图和高分辨质谱图 Figure7. RP-HPLC and HR-Q-TOF-MS analysis of the BI-32169

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3   结论

BI-32169作为一种潜在的治疗糖尿病的多肽先导化合物, 具有较好的应用与市场价值.而由于其独特的双环结构使得其化学合成难度较大.本文利用新型芳基硼酸酯正交保护基, 通过固相环合策略, 首次报道了BI-32169的化学全合成.该合成方法合成效率高, 操作简便, 能够为其他类似环肽的化学全合成提供参考.
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图 1 BI-32169的结构式

Figure 1 The structural formula of BI-32169

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图 2 BI-32169的合成策略(星号代表侧链保护基团)

Figure 2 The chemical synthesis of BI-32169. The resin-bound peptides were protected on side chains at asterisk sites. The following protecting groups for amino acid side chains were used: tert-butyl (^tBu; for Thr, Ser), tert-butyloxycarbonyl (Boc; for Trp) and trityl (Trt; for Asn, Cys).

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图 3 Fmoc-Asp(pDobb)-OH的合成路线

Figure 3 Synthesis route of Fmoc-Asp(pDobb)-OH. Reagents and conditions: (a) Fmoc-Asp-O^tBu, 4-(4, 4, 5, 5-tetramethyl-1, 3, 2-dioxaboro-lan-2-yl)-phenyl)-methanol, DCC, DMAP, DCM, r.t., 4 h; (b) TFA/DCM (1:3, V/V), r.t., 2 h.

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图 4 1a反相高效液相色谱图和高分辨质谱图

Figure 4 RP-HPLC and HR-Q-TOF-MS analysis of 1a

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图 5 1b反相高效液相色谱图和高分辨质谱图

Figure 5 RP-HPLC and HR-Q-TOF-MS analysis of 1b

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图 6 1c反相高效液相色谱图和高分辨质谱图

Figure 6 RP-HPLC and HR-Q-TOF-MS analysis of 1c

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图 7 BI-32169反相高效液相色谱图和高分辨质谱图

Figure 7 RP-HPLC and HR-Q-TOF-MS analysis of the BI-32169

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