纳米孔道单分子检测结直肠癌MicroRNAs

引用本文: 胡正利, 杜冀晖, 应佚伦, 彭岳一, 曹婵, 龙亿涛. 纳米孔道单分子检测结直肠癌MicroRNAs[J]. 化学学报, 2017, 75(11): 1087-1090. doi: 10.6023/A17090433 shu

Citation: Hu Zhengli, Du Jihui, Ying Yilun, Peng Yueyi, Cao Chan, Long Yi-Tao. Single-Molecule Analysis of Colorectal Cancer-associated MicroRNAs via a Biological Nanopore[J]. Acta Chimica Sinica, 2017, 75(11): 1087-1090. doi: 10.6023/A17090433 shu

纳米孔道单分子检测结直肠癌MicroRNAs

胡正利 ^a, ,
杜冀晖 ^b, ,
应佚伦 ^a, ,
彭岳一 ^a, ,
曹婵 ^a, ,
龙亿涛 ^{a,
,}

a.
华东理工大学化学与分子工程学院结构可控先进功能材料及其制备教育部重点实验室上海 200237
b.
深圳大学附属南山医院中心实验室深圳 518052

通讯作者: 龙亿涛, E-mail: ytlong@ecust.edu.cn

基金项目:
项目受国家重点研发计划（No.2017YFC0906500）、国家自然科学基金（No.21505043）、上海市教育委员会科研创新项目（No.2017-01-07-00-02-E00023）和中央高校基本科研业务费（Nos.222201714012，222201718001，222201717003）资助

摘要: MicroRNA（miRNA）可用于癌症的早期诊断、预后判断，其分析检测具有重要临床意义.结直肠癌的发生、发展与miRNA 21、miRNA 92等的异常表达明显相关.本研究设计了以poly（dT）_n为引导链的DNA探针（probe）并尝试使用α-溶血素（α-HL）纳米孔道单分子检测方法检测结直肠癌miRNAs.miRNA·probe复合物分子穿过α-HL纳米孔道限域空间时，由于probe链长、序列不同导致probe-α-HL相互作用不同，miRNA 92·probe 92、miRNA 21·probe 21、miRNA 16·probe 16输出为形态、阻断时间不同的多台阶特征信号，实现了三种miRNAs的有效区分.实验证明，此方法可以用于检测血清实际样品.因此，未来有望使用α-HL构建miRNA超灵敏单分子生物传感器.

关键词:

English

Single-Molecule Analysis of Colorectal Cancer-associated MicroRNAs via a Biological Nanopore

Hu Zhengli ^a, ,
Du Jihui ^b, ,
Ying Yilun ^a, ,
Peng Yueyi ^a, ,
Cao Chan ^a, ,
Long Yi-Tao ^{a,
,}

a.
Key Laboratory for Advanced Materials & School of Chemistry and Molecular Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
b.
Central Laboratory, Affiliated Nanshan Hospital, Shenzhen University, Shenzhen 518052, China

Corresponding author: Long Yi-Tao, ytlong@ecust.edu.cn

Received Date: 22 September 2017
Available Online: 15 November 2017
Fund Project:
Project supported by the National Key R & D Program of China (No. 2017YFC0906500), the National Natural Science Foundation of China (No. 21505043), Innovation Program of Shanghai Municipal Education Commission (No. 2017-01-07-00-02-E00023) and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nos. 222201714012, 222201718001, 222201717003)

Abstract: MicroRNAs (miRNAs), 18~22 nucleotides in length, are a class of single-strand noncoding short RNAs and have been used as biomarkers for diagnosis and prognosis of cancers. Herein, an α-hemolysin (α-HL) nanopore was adapted for the colorectal cancer-associated miRNAs analysis, with the merits of high-throughput, ultra-sensitivity and no requirements of amplification/labelling. DNA probes, consisting of a signal tag in each end and a response element in the middle section, were designed. The response element could be well-matched with miRNA and utilized for specific recognition of the target miRNA, while the signal tag increased the capture rate of the miRNA·probe complex. Due to the poor stacking of thymine residues, poly(dT)_n need to overcome a high entropic barrier when traversing through the α-HL nanopore confined space, resulting in distinct double-level blocked events, which contributes to the visualized differences in signal shape and prolonged duration. Thus, poly(dT)_n was selected as the signal tag of probe. Added in the cis side of α-HL, miRNA·probe was forced to traverse across the nanopore confined space under the potential of 140 mV through a pair of Ag/AgCl electrodes (cis grounded). Typical three-stage blocked event was observed, reflecting the translocation process:capture and dissociation of miRNA·probe, translocation of probe, temporarily residence and translocation of miRNA. Stage 1 (S1) represented the process from capture of miRNA·probe complex to translocation of the entire probe. The typical blocked events of miRNA 92·probe 92 showed a two-level S1, where Level 1 (L1) with a current blockage of 0.57±0.01 was generated mainly by translocation of the poly(dT)₄₀ signal tag. As the duration is associated with DNA length, probe 21 with smaller poly(dT)₂₀ signal tag was designed to detect miRNA 21, resulting in a shorter L1 of miRNA 21·probe 21 whose duration (t_D-L1) was 1/3 of that for miRNA 92·probe 92. As the signal shapes vary with DNA sequences, probe 16 with signal tag of poly(dC)₄₀ was used to sense miRNA 16, with miRNA 16·probe 16 producing a different single-level S1 with miRNA 92·probe 92 and miRNA 21·probe 21. The statistical results demonstrated that the three kinds of miRNA·probe produced different durations for S1 (t_D-S1), possibly indicating the differences in probe-α-HL interaction. Therefore, miRNA 92, miRNA 21 and miRNA 16 could be well identified by t_D-L1 (signal shape) and t_D-S1 (duration). Moreover, the serum sample have been tested. Hence, α-HL nanopore can be applied to build ultrasensitive single molecule biosensor for miRNA.

Key words:

1.   引言

MicroRNAs (miRNAs)是一类长度为18~22碱基的内源性非编码微小RNAs, 其基因表达模式与多种癌症发生、发展有关, 且miRNA表达谱不同则癌症表型不同^[1], 可用于癌症的早期诊断、预后判断, 具有重要的临床意义.结直肠癌是临床发病率和死亡率最高的癌症之一, 它与miRNA 21、miRNA 92在内的多种miRNAs的异常表达有明确关系.目前, 标准检测方法Northern杂交法(Northern blotting)对低丰度的miRNA检测灵敏度低^[2], 常用的实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和微阵列芯片法存在错误扩增、非特异性杂交等问题^[3], 而其他的方法则大多需要对目标分子进行特殊标记或化学修饰.纳米孔道单分子检测技术是一种高灵敏的分子检测平台, 该方法具有分辨率高、无需标记或特殊放大、操作简便、成本低等优势. 1996年, α-溶血素(α-HL)生物纳米孔道已应用于检测核酸^[4], 自此至今二十多年, 各新型生物纳米孔道相继出现^[5~8], 纳米孔道单分子检测技术的应用相应扩展到DNA测序^{[7, 9]}、多肽结构^[10~12]、生物弱相互作用^[13~15]以及临床检测^[16]等研究领域.由于不同分子的占位效应以及与孔道内氨基酸残基的相互作用不同, 待测物分子通过纳米孔道限域空间时离子流的改变不同, 特征信号的阻断程度和时间不同^{[17, 18]}.基于此, 纳米孔道可以有效区分不同种类的待测物, 实现单分子水平高灵敏的特异性检测.

本研究设计了能够特异性识别目标miRNA的DNA探针(probe), probe由中间的识别区和两端的引导链组成, 识别区只能与目标miRNA完全互补配对, 可用于miRNA的特异性检测^[19]. α-HL最窄处为1.4 nm^[20], 只允许单链核酸分子通过, 双链核酸分子需完成解链后以单链的形式过孔, 在probe两端编入引导链可以增加α-HL对miRNA•probe复合物分子的捕获率.本研究旨在利用α-HL纳米孔道对miRNA•probe双链分子的高灵敏分辨, 实现结直肠癌miRNAs的高效检测.在之前的研究中, 我们发现由于胸腺嘧啶之间的碱基堆积力较差, poly(dT)₄₅在穿过α-HL时需要克服构象熵垒, 产生易分辨的“两台阶”特征阻断信号^[21], 这不仅使信号形态具有可视化的差异, 还延长了整个分子的穿孔时间.基于poly(dT)_n的上述特性, 本研究设计了以poly(dT)₄₀为引导链的probe 92检测miRNA 92, 并尝试检测了血清实际样品.由于单链核酸穿孔时间与链长有关, 缩短引导链的长度, 得到引导链为poly(dT)₂₀的probe 21.根据分子穿孔信号的形状与核酸序列有关, probe16的引导链编码为poly(dC)₄₀.实验结果表明, 由于probes引导链长度或序列的差异, miRNA 92•probe 92、miRNA 21•probe 21、miRNA 16•probe 16三种复合物分子产生了形状、阻断时间差异明显的多台阶特征电流信号, 该特征信号可用来有效区分miRNA 92、miRNA 21和miRNA 16.

2.   结果与讨论

2.1   单个miRNA分子检测

实验原理如图 1b所示, 磷脂双分子层将检测池分成cis和trans两个腔室, α-HL在磷脂双分子层上自组装成单个纳米孔道, 连通两个腔室的电解质溶液, 为离子流的形成提供了纳米孔道限域空间.本研究设计了特异性识别miRNA 92的probe 92, 该探针由两端的均聚引导链poly(dT)₄₀和中间的特定识别区组成(图 1a).由于双链DNA很难进入纳米孔道限域空间并完成穿孔, 所以在识别区两端增加了引导链poly(dT)₄₀来提高miRNA 92•probe 92复合物分子的捕获率; 而识别区可以与miRNA 92完全互补配对, 有利于实现特异性检测(表S1).在外加电压驱动下, 单个miRNA 92•probe 92复合物分子被捕获并穿过α-HL纳米孔道, 产生单个离子流阻断事件, 输出为单个电流阻断信号, 表现为特征多台阶电流阻断事件(图 1b).

图 1

图 1. (a) miRNA 92•probe 92复合物分子结构示意图. Probe 92由两端的poly(dT)₄₀引导链和中间的识别区组成. (b)左:α-溶血素纳米孔道测定单个miRNA原理图; 右: miRNA 92•probe 92特征阻断信号. (c) miRNA 92•probe 92通过生物纳米孔道过程的示意图.特征信号由三部分组成:阶段1 (S1)代表从miRNA•probe分子被α-HL纳米孔道捕获、双链解链到probe 92穿孔的过程, 阶段2 (S2)是由miRNA 92在α-HL纳米孔道内短暂停留造成的, 阶段3 (S3)表示miRNA 92穿孔过程.其中S1表现为双台阶阻断, 定义第一个电流台阶为Level 1 (L1), L1是poly(dT)₄₀穿过α-HL纳米孔道的行为标志

Figure 1. (a) The structural model of miRNA 92•probe 92 complex. The probe 92 was composed of a poly(dT)₄₀ signal tag (blue box) at each end and a response element in the center (red box). (b) Left: schematic of miRNA detection by an α-HL nanopore. Right: typical blocked event for miRNA 92•probe 92. (c) Illustration of a miRNA 92•probe 92 complex molecule translocating through an α-HL nanopore. The typical three-stage blockade reflects the translocation process of miRNA 92•probe 92: stage 1 (S1) represents the process from capture of miRNA 92•probe 92 complex to translocation of the entire probe 92, stage 2 (S2) is induced by the temporarily residence of miRNA 92 in the vestibule of an α-HL nanopore and stage 3 (S3) indicates the translocation of miRNA 92. The typical blocked events of miRNA 92•probe 92 show a two-level S1, where Level 1 (L1) with a current blockage of 0.57±0.01 is generated mainly by translocation of the poly(dT)₄₀ signal tag

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2.2   单个miRNA•probe特征信号分析

根据已有报道^[19], 可推测miRNA•probe复合物分子的穿孔机理如图 1c所示: (1)在外加电场驱动下, 单个miRNA•probe复合物分子进入α-HL纳米孔道, 改变纳米孔道限域空间内的离子浓度, 开始产生阻断电流信号; (2) miRNA•probe在α-HL纳米孔道前庭解链成单链的miRNA和probe, 随后probe的引导链穿过α-HL纳米孔道的最窄处; (3)在引导链的带动下完成整个probe的穿孔; (4) miRNA在α-HL孔道前庭停留一段时间; (5)单链miRNA完成穿孔行为, 电流恢复至开孔电流状态. Stage 1(S1)代表从miRNA•probe复合物分子被α-HL纳米孔道捕获到probe分子穿孔的过程, 是实现miRNA特异性检测的关键步骤.定义t_D为单分子穿孔事件的阻断时间, I/I₀为单分子穿孔时造成的电流阻断程度, I₀为无分子穿孔时的单个纳米孔道的开孔电流, I为单个待测物分子在孔内时的阻断电流. S1的阻断时间为t_D-S1=21.11±2.56 ms, 为单链RNA穿孔时间的将近100倍(图 2a)^{[19, 22]}.因此, 目标miRNA借助probe在时间尺度得到了放大. miRNA 92•probe 92在I/I₀=0.57±0.01处产生的t_D-L1=1.12±0.05 ms的特征阻断Level 1(L1)是poly(dT)₄₀穿过α-HL纳米孔道的行为标志^[21], 柔性poly(dT)₄₀在被捕获和穿孔时需要克服构象熵垒, 延长了probe-α-HL的作用时间, 表现为阻断时间的增加.基于此, 本研究尝试测定了实际样品中的miRNA 92, 即在血清样品中加入probe 92, 混合物退火处理后加入检测池中进行测定, 得到了如图 2b的多台阶特征阻断信号, 这与标准样品的miRNA 92•probe 92阻断信号形态一致, 这表明α-HL可以用于血清实际样品的检测.

图 2

图 2. (a) miRNA 92•probe 92过孔的特征阻断电流信号L1以及S1的阻断时间的柱状统计图. (b)血清样品中miRNA 92的检测

Figure 2. (a) Duration histograms of L1 and S1 for miRNA 92•probe 92. (b) Analysis of miRNA 92 in the serum sample

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2.3   三种miRNAs的有效区分

鉴于probe识别区只能与目标miRNA进行完全互补配对, 如果不同的miRNA•probe穿过α-HL纳米孔道时可以产生不同的特征阻断信号, 那么就有可能实现多种miRNAs的有效区分.根据上文讨论可知, 引导链poly(dT)₄₀可以产生特异性的L1, 文献报道DNA的链长不同, 其特征阻断时间不同^[23].基于此, 设计了以poly(dT)₂₀为引导链的probe 21来检测miRNA 21(表S1). miRNA 21•probe 21的L1阻断时间t_D-L1=0.36±0.03 ms, 约为miRNA 92•probe 92的L1阻断时间的1/3(图 3c). miRNA 21•probe 21的t_D-S1=4.94±0.19 ms, 小于miRNA 92•probe 92的21.11±2.56 ms(图 2a和图 3a).由于核酸序列改变可能造成信号形态的差异, 采用了引导链为poly(dC)₄₀的probe 16来检测miRNA16(表S1).miRNA 16•probe 16产生了形态不同于miRNA 92•probe 92、miRNA 21•probe 21的特征阻断信号, 这是因为poly(dC)₄₀穿过α-HL纳米孔道时产生脉冲型信号而不是类似于poly(dT)_n的两台阶特征信号, 所以miRNA 16•probe 16穿孔后输出为单台阶的S1(图 3b)^[23]. miRNA 16•probe 16的t_D-S1=7.93±0.64 ms, 介于miRNA 92•probe 92、miRNA 21•probe 21之间(图 3c).因此, 通过调控probe引导链的长度或序列, 可以引起miRNA 92•probe 92、miRNA 21•probe 21、miRNA 16•probe 16三种复合物分子特征信号的改变, 具体表现为t_D-L1(信号形态)以及t_D-S1(阻断时间)的差异, 并据此实现miRNA 92、miRNA 21、miRNA 16三种miRNAs的有效区分.

图 3

图 3. (a) miRNA 21•probe 21过孔的特征阻断电流信号以及S1的阻断时间的柱状统计图. (b) miRNA 16•probe 16过孔的特征阻断电流信号以及S1的阻断时间的柱状统计图. (c) miRNA 92•probe 92、miRNA 21•probe 21以及miRNA 16•probe 16特征阻断信号的L1和S1阻断时间的比较, 误差棒来源于各柱状图拟合值的标准误差

Figure 3. (a) Typical current blockage and t_D histogram of S1 for miRNA 21•probe 21. (b) Typical current blockage and t_D histogram of S1 for miRNA 16•probe 16. (c) Duration comparison of L1 and S1 for miRNA 92•probe 92, miRNA 21•probe 21 and miRNA 16•probe 16, respectively. Error bars represent the standard errors of fitting in duration histograms

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3.   结论

综上所述, 本研究设计了特殊序列的probe来识别目标miRNA, 并借由α-HL纳米孔道单分子分析技术对miRNA•probe复合物的高灵敏分析, 实现了结直肠癌miRNAs的特异性检测. miRNA 92•probe 92、miRNA 21•probe 21、miRNA 16•probe 16三种复合物分子在穿过α-HL纳米孔道限域空间时, 由于引导链poly(dT)₄₀、poly(T)₂₀、poly(dC)₄₀长度或序列不同, 产生了t_D-L1(信号形态)、t_D-S1(阻断时间)不同的特征阻断信号, 基于此, 实现了三种miRNAs的有效区分.由于probe引导链长度和序列的改变均会造成miRNA•probe特征信号的差异, 通过精确控制probe的序列, 有望实现多种miRNAs的同时检测.纳米孔道单分子分析技术为miRNA的检测提供了无需标记、扩增的高分辨高灵敏的检测平台, 也为癌症早期诊断、治疗方面的研究提供了一种新思路.

4.   实验部分

α-HL、EDTA和正癸烷均购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 1, 2-二植烷酰基磷脂购自Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, USA).所有miRNAs均由宝生物工程有限公司(大连)合成并进行HPLC纯化.所有probes均由生工生物工程有限公司(上海)合成并经HPLC纯化.本研究将miRNA和probe混合液, 在95 ℃条件下孵育3 min, 然后在55 ℃冷却3 min, 高低温反复2~3次, 以制得miRNA•probe复合物.除特别提到外本实验所用试剂均为分析纯, 实验用水为超纯水(18.2 MΩ•cm, 25 ℃), 所有涉及到miRNA的实验用水均经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理.

纳米孔道单分子检测方法参照我们已报道的文章^{[13, 21]}.检测池的两个腔室cis和trans中分别加入1 mL, 1.0 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris, 1.0 mmol/L EDTA, pH 8.0的缓冲液.将磷脂正癸烷溶液涂在缩醛树脂检测池(Warner Instruments, Hamden, CT, USA)的微孔处, 构造磷脂双分子层.在cis端检测池中加入α-HL, 自组装成稳定的单个纳米孔道.随后, 将待测物加入检测池cis端.电流信号经过3 kHz低通滤波在100 kHz采样频率下使用ChemClamp电流放大器(Dagan Co., Minneapolis, MN, USA), DigiData 1440A数模转换器(Axon Instruments, Forest City, CA, USA)以及PClamp 10.2数据记录软件(Axon Instruments, Forest City, CA, USA)进行放大和采集.所得数据使用实验室自编的软件Nanopore Analysis^[24], ClampFit 10.2 (Molecular Devices, Forest City, CA, USA)和OriginLab 8.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)进行分析.
Supporting information for this article is available free of charge via the Internet at http://sioc-journal.cn.
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图 1 (a) miRNA 92•probe 92复合物分子结构示意图. Probe 92由两端的poly(dT)₄₀引导链和中间的识别区组成. (b)左:α-溶血素纳米孔道测定单个miRNA原理图; 右: miRNA 92•probe 92特征阻断信号. (c) miRNA 92•probe 92通过生物纳米孔道过程的示意图.特征信号由三部分组成:阶段1 (S1)代表从miRNA•probe分子被α-HL纳米孔道捕获、双链解链到probe 92穿孔的过程, 阶段2 (S2)是由miRNA 92在α-HL纳米孔道内短暂停留造成的, 阶段3 (S3)表示miRNA 92穿孔过程.其中S1表现为双台阶阻断, 定义第一个电流台阶为Level 1 (L1), L1是poly(dT)₄₀穿过α-HL纳米孔道的行为标志

Figure 1 (a) The structural model of miRNA 92•probe 92 complex. The probe 92 was composed of a poly(dT)₄₀ signal tag (blue box) at each end and a response element in the center (red box). (b) Left: schematic of miRNA detection by an α-HL nanopore. Right: typical blocked event for miRNA 92•probe 92. (c) Illustration of a miRNA 92•probe 92 complex molecule translocating through an α-HL nanopore. The typical three-stage blockade reflects the translocation process of miRNA 92•probe 92: stage 1 (S1) represents the process from capture of miRNA 92•probe 92 complex to translocation of the entire probe 92, stage 2 (S2) is induced by the temporarily residence of miRNA 92 in the vestibule of an α-HL nanopore and stage 3 (S3) indicates the translocation of miRNA 92. The typical blocked events of miRNA 92•probe 92 show a two-level S1, where Level 1 (L1) with a current blockage of 0.57±0.01 is generated mainly by translocation of the poly(dT)₄₀ signal tag

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图 2 (a) miRNA 92•probe 92过孔的特征阻断电流信号L1以及S1的阻断时间的柱状统计图. (b)血清样品中miRNA 92的检测

Figure 2 (a) Duration histograms of L1 and S1 for miRNA 92•probe 92. (b) Analysis of miRNA 92 in the serum sample

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图 3 (a) miRNA 21•probe 21过孔的特征阻断电流信号以及S1的阻断时间的柱状统计图. (b) miRNA 16•probe 16过孔的特征阻断电流信号以及S1的阻断时间的柱状统计图. (c) miRNA 92•probe 92、miRNA 21•probe 21以及miRNA 16•probe 16特征阻断信号的L1和S1阻断时间的比较, 误差棒来源于各柱状图拟合值的标准误差

Figure 3 (a) Typical current blockage and t_D histogram of S1 for miRNA 21•probe 21. (b) Typical current blockage and t_D histogram of S1 for miRNA 16•probe 16. (c) Duration comparison of L1 and S1 for miRNA 92•probe 92, miRNA 21•probe 21 and miRNA 16•probe 16, respectively. Error bars represent the standard errors of fitting in duration histograms

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142

纳米孔道单分子检测结直肠癌MicroRNAs

通讯作者: 龙亿涛, E-mail: ytlong@ecust.edu.cn

English

Single-Molecule Analysis of Colorectal Cancer-associated MicroRNAs via a Biological Nanopore

Corresponding author: Long Yi-Tao, ytlong@ecust.edu.cn

1. 引言

2. 结果与讨论

2.1 单个miRNA分子检测

图 1

2.2 单个miRNA•probe特征信号分析

图 2

2.3 三种miRNAs的有效区分

图 3

3. 结论

4. 实验部分

CCS Chemistry：嵌段共聚物自组装成 “三明治”二维有机材料，实现纳米级压力传感功能

CCS Chemistry：颜徐州、鲍哲南：你的皮肤可能是一片SPMs

CCS Chemistry：工作高效不疲劳，只须让催化剂动起来

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CCS Chemistry：金黄色葡萄球菌醛基脱氢酶是如何识别特异性底物的？

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中国化学会秘书处

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Corresponding author: Long Yi-Tao, ytlong@ecust.edu.cn

1. 引言

2. 结果与讨论

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