利用交流阻抗传感技术实时监测纳米沟槽上皮肤细胞的定向行为

引用本文: 金桐宇, 安宇, 张帆, 何品刚. 利用交流阻抗传感技术实时监测纳米沟槽上皮肤细胞的定向行为[J]. 化学学报, 2017, 75(11): 1115-1120. doi: 10.6023/A17070337 shu

Citation: Jin Tongyu, An Yu, Zhang Fan, He Pingang. Real-time Monitoring Skin Cell Alignment on Nano-grooves Using Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS)[J]. Acta Chimica Sinica, 2017, 75(11): 1115-1120. doi: 10.6023/A17070337 shu

利用交流阻抗传感技术实时监测纳米沟槽上皮肤细胞的定向行为

华东师范大学化学与分子工程学院上海 200241

通讯作者: 张帆, E-mail: fzhang@chem.ecnu.edu.cn; 何品刚, E-mail: pghe@chem.ecnu.edu.cn

基金项目:

项目受国家自然科学基金（No.21405049）资助

摘要: 细胞定向行为在皮肤、骨骼等修复和再生中起着非常重要的作用.本文首次采用交流阻抗传感技术实时监测人真皮成纤维细胞（HFF）和人永生化表皮细胞（HaCaT）在纳米沟槽（宽度：200 nm，周期：400 nm，深度：70 nm）上的定向行为.结果表明，HFF细胞在纳米沟槽上先进行定向排列，再发生胞体的延长；HaCaT细胞无定向行为的产生，其粘附和铺展得到了延缓.与平面电极相比，HFF细胞在纳米沟槽上产生的交流阻抗信号（NI值）更大，前期定向排列比后期胞体延长引起的NI值变化更显著，且NI值与定向排列的细胞百分比之间存在着良好的线性关系；HaCaT细胞在纳米沟槽上的NI值更小，且粘附比铺展过程对NI值变化的影响更大.本文的研究将为复合型细胞传感器的发展提供思路和支持.

关键词:

English

Real-time Monitoring Skin Cell Alignment on Nano-grooves Using Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS)

College of Chemistry and Molecular Engineering, East China Normal University, Shanghai 200241

Corresponding author: Zhang Fan, fzhang@chem.ecnu.edu.cn; He Pingang, pghe@chem.ecnu.edu.cn

Received Date: 26 July 2017
Available Online: 15 November 2017
Fund Project:

Project supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 21405049)

Abstract: Cell alignment plays a crucial role in the repair and regeneration of tissues, which is caused by the "contact guidance" of micro/nano structures. In this paper, the nano-grooves with 200 nm in width, 400 nm in period and 75 nm in depth were fabricated on gold substrate with the technique of nanoimprint to simulate the extracellular matrix (ECM). Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) was employed firstly to real-time monitor cell alignment of human foreskin fibroblasts (HFF) and human immortal keratinocyte cells (HaCaT) on nano-grooves, which are two important functional cell types in skin wound-healing. The cell images displayed that the nano-grooves could induce the alignment of HFF cells, in which, the cell arrangement along the direction of nano-grooves occurred prior to the cell elongation. While the nano-grooves couldn't influence the morphology of HaCaT cells, and their adhesion and spread were delayed. In the ECIS monitoring, HFF and HaCaT cells both presented increased normalized impedance (NI) values at their respective characteristic frequencies of 977 and 1465 Hz on nano-grooves and flat electrodes with the prolongation of culture time during 24 h and the increasing trends of NI values were also similar:in the first 6 h, NI values increased faster, and then, the increasing rates declined obviously. HFF cells on nano-grooves generated more intense impedance signals with a larger distinction of increasing rate than those on flat electrodes, indicating that the nano-grooves could promote the adhesion and spread of HFF cells and the directional arrangement had a larger impact on the variation of NI values than cell elongation. While HFF cells adhered and spread in random directions, leading to the reduced difference in increasing rate of NI values. The NI values of HFF cells was further correlated with cell alignment, showing the enhanced impedance responses with the rising percentage of aligned cells. More importantly, there was a good linear correlation between NI values and the percentage of cells arranging along the direction of nano-grooves. In contrast, HaCaT cells had smaller NI values on the nano-grooves with the similar increasing rates, compared to the flat electrodes, revealing that the nano-grooves were less suitable for the adhesion and spread of HaCaT cells with almost no change of cell morphology, and the cell adhesion could cause more obvious variation of NI values than cell spread. Our research would provide a support for the development of complex cell sensors based on ECIS and its application in clinical research field.

Key words:

nano-grooves
/ cell alignment
/ electric cell-substrate impedance sensing (ECIS)
/ skin cells
/ complex cell sensor

1.   引言

人体内的细胞外基质(ECM)具有丰富的纳米尺度拓扑结构^[1], 这些结构对细胞的行为具有一定的生物调控作用.由于三维基底可以模拟细胞外基质, 更接近人体的真实环境, 所以细胞在微纳尺度三维基底上的行为研究引起了极大的关注^[2~4].其中, 纳米沟槽结构能够对细胞产生很强的“接触引导”作用, 可以引导细胞沿着纳米结构方向产生定向行为^[5~7].研究表明, 定向行为的产生能够对神经、肌腱修复和再生、伤口愈合以及骨骼的形成起到促进的作用^[8].纳米沟槽通过微纳加工技术研制, 与基于静电纺丝技术的纳米纤维基底相比, 具有高度有序性和优异的结构尺寸可控性, 以迎合不同细胞研究的需求^[9~11].

对纳米三维基底上细胞行为的监测与分析, 大多以各种光学方法为主^[12~16], 这些方法通常都需要复杂的实验步骤, 对细胞具有一定的破坏性, 且基于终点检测, 不能获得实时、原位、动态的信息.细胞交流阻抗技术在对细胞行为进行非侵入、实时、动态监测和分析方面显示出了巨大潜力.细胞膜具有低电导和高电容的性质, 所以当贴壁型细胞培养在电极表面时, 它们会阻碍电流的流动, 增加整个体系的阻抗.这个方法最早由Giaever和Keese在1984年提出^[17], 他们将两块金电极固定在细胞培养皿底部, 其中, 面积较小的金电极作为工作电极, 面积较大的金电极作为对电极, 细胞接种之后, 对工作电极施加微小的扰动信号, 再用锁相放大器收集并反馈信号.随着细胞在电极上粘附、铺展、生长, 体系的阻抗表现出持续增加.目前, 细胞交流阻抗法已用于研究细胞迁移、繁殖等细胞行为^{[18, 19]}、细胞毒性和药物筛选^[20~23]、区分癌细胞和正常细胞^[24~27]等.

本文通过纳米压印技术制备了纳米沟槽基底以模拟细胞外基质, 对人真皮成纤维细胞(HFF)和人永生化表皮细胞(HaCaT)在纳米沟槽上的定向行为进行了分析, 并首次采用细胞交流阻抗技术实时监测了两种细胞在纳米沟槽上的定向行为, 为生物仿生材料的开发和应用以及复合型细胞传感器的发展提供思路和方法.

2.   结果与讨论

2.1   纳米沟槽的表征

纳米沟槽由相互交错的沟和脊构成, 从AFM表征图(图 1)中可以看出纳米沟槽的结构规则, 沟和脊的宽度都约为200 nm, 与纳米压印模板尺寸相一致. AFM高度测量图显示, 纳米沟槽的深度约为70 nm.

图 1

图 1. (A) 纳米沟槽的AFM表征图和(B) AFM测量高度图

Figure 1. (A) AFM image of nano-groove and (B) height profiles of the cross-section analysis

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2.2   皮肤细胞在纳米沟槽上的定向行为分析

本文利用纳米沟槽模拟细胞外基质, 对纳米沟槽诱导皮肤创伤修复过程中的两种主要功能细胞——人真皮成纤维细胞(HFF)和人永生化表皮细胞(HaCaT)的定向行为进行分析研究.将这两种皮肤细胞分别种植在纳米沟槽和平面金电极上, 从图 2中可以看出, 对于HFF细胞而言, 相较于平面电极上细胞任意方向上的排列和铺展, 在纳米沟槽上培养2 h时, 已有少许细胞开始沿着纳米沟槽方向进行排列和铺展, 4 h时定向排列和铺展的细胞数目有所增加, 6 h时绝大多数细胞都表现出了定向行为, 沿着纳米沟槽的方向延长.随着培养时间的增加, 细胞在纳米沟槽方向上的延长和排列越来越明显, 说明该纳米沟槽对HFF细胞有“接触引导”作用, 能够诱导HFF细胞产生定向行为.相比之下, 纳米沟槽上的HaCaT细胞不仅没有出现定向排列和铺展的现象, 而且与平面金电极上的细胞相比, 形貌并未发生较大变化; 另一方面, HaCaT细胞在纳米沟槽上培养6 h才有部分细胞在电极表面铺展, 而平面金电极上的细胞在培养4 h时就已经开始铺展, 而且在相同的培养时间内, 平面金电极上铺展的细胞不论从数量上还是程度上都优于纳米沟槽上的细胞, 说明该纳米沟槽无法诱导HaCaT细胞进行定向排列和铺展, 且不利于HaCaT细胞的粘附和铺展.本文同时对HFF细胞和HaCaT细胞在纳米沟槽和平面金电极上的细胞数目进行了统计.如图 2(E)和2(F)所示, 两种细胞在24 h的培养过程中, 数目没有发生明显变化, 说明细胞尚未进入繁殖阶段.

图 2

图 2. HFF细胞在纳米沟槽(A)和平面电极(B)上以及HaCaT细胞在纳米沟槽(C)和平面电极(D)培养2、4、6、12和24 h时的图片(箭头表示纳米沟槽的方向), 以及HFF细胞(E)和HaCaT细胞(F)在两种电极上的数目统计

Figure 2. Images of HFF cells on nano-grooves (A) and flat electrode (B), HaCaT cells on nano-grooves (C) and flat electrode (D) with the indication of nano-grooves direction by arrows, and the numbers of HFF cells (E) and HaCaT cells (F)

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为了进一步研究纳米沟槽对HFF细胞定向行为的影响, 本文对HFF细胞延长度和铺展方向进行了统计和分析.首先通过Photoshop软件提取出细胞轮廓, 然后由Image J软件拟合成椭圆(图 3), 分别定义椭圆的长轴和短轴为细胞的长和宽, 并将其比值定义为细胞延长度(E)^[28], 同时, 将细胞长轴方向与纳米沟槽方向之间的夹角定义为θ.如果E＞4, 则认为细胞是延长的; 如果θ＜10°, 则认为细胞能够沿着纳米沟槽的方向铺展.

图 3

图 3. 细胞拟合参数示意图

Figure 3. Schematic representation of cell fitting and parameters

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选取不同批次不同部位的HFF细胞照片进行统计分析, 结果如图 4所示.随着培养时间的延长, E＞4和θ＜10°的细胞比例都在升高. E＞4的细胞比例在前12 h内增加较快, 后12 h内增加平缓; θ＜10°的细胞比例在前6 h内的增加速率大于后18 h内的增加速率, 说明HFF细胞在纳米沟槽上先进行定向排列, 再发生胞体的延长, 最终表现出良好的定向行为.

图 4

图 4. 定向排列(θ＜10°)和定向延长(E＞4)的HFF细胞百分比随时间变化曲线

Figure 4. Ratio of aligned cells (θ < 10°) and elongated cells (E > 4) over culture time for HFF cells

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2.3   交流阻抗实时监测皮肤细胞在纳米沟槽上的定向行为

本文利用交流阻抗技术进一步实时监测了纳米沟槽上HFF细胞的定向行为和HaCaT细胞的粘附及铺展. 图 5为两种细胞在纳米沟槽上2至24 h的阻抗Bode图, 即交流阻抗值(Z)随频率(f)的变化曲线.可以看到, 两种细胞的交流阻抗响应都随着培养时间的增加呈现出了持续增长的趋势.为了消除电极、培养液等导电性能对交流阻抗值的影响, 本文将不同时间采集到的交流阻抗值对无细胞时系统的交流阻抗值进行了归一化处理, 得到了归一化阻抗值(NI)^[21]:

图 5

图 5. 24 h内HFF细胞(A)和HaCaT细胞(B)在纳米沟槽上的Bode图

Figure 5. Bode plots for HFF cells (A) and HaCaT cells (B) on nano-grooves within 24 h

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${\bf{NI = }}\frac{{{Z_{{\rm{cell}}}} - {Z_{{\rm{cell - free}}}}}}{{{Z_{{\rm{cell - free}}}}}}$

其中, Z_cell和Z_cell-free分别代表有细胞时和无细胞时系统的交流阻抗值.根据我们课题组之前对两种细胞迁移与繁殖行为的研究工作^[29], HFF细胞和HaCaT细胞的特征频率分别为977和1465 Hz, 因此本文分别对应选取两种细胞特征频率下的NI值作进一步的分析研究.

图 6为HFF细胞和HaCaT细胞在纳米沟槽和平面金电极上1至24 h的NI值变化曲线.可以看出, HFF细胞和HaCaT细胞的NI值在两种基底上都随着培养时间的延长而增长, 且前6 h内NI值增长较快, 6至24 h内NI值增长较为平缓.根据ECIS的原理, 细胞覆盖工作电极的面积越大, 所引起的阻抗值也就越大.对于HFF细胞而言, 纳米沟槽上的NI值要大于平面金电极上的NI值, 说明纳米沟槽能够促进HFF细胞的粘附和铺展. 同时, 相比于平面金电极, 纳米沟槽上NI值的增长速率差异更加明显.从细胞定向行为统计结果来看, 细胞在前6 h内以发生定向排列行为为主, 6至24 h内细胞逐渐沿着纳米沟槽方向延长, 说明定向排列比细胞延长引起的交流阻抗响应变化更大.平面金电极上的HFF细胞没有定向行为的发生, 所以NI值增长速率变化较小.相比之下, HaCaT细胞在纳米沟槽上的NI值则低于平面金电极上的NI值, 说明HaCaT在平面金电极上更容易粘附和铺展.同时, NI值在这两种基底上具有相似的增长趋势, 可能是由于纳米沟槽没有引起HaCaT细胞形貌的变化.从细胞图像中可以看出, 前6 h内细胞粘附行为占主导, 之后, 细胞逐渐铺展, 说明粘附过程相比于铺展过程对电流产生的扰动更大, 因此NI值在前6 h内的变化更为明显.

图 6

图 6. 24 h内, HFF细胞(A)在977 Hz下, HaCaT细胞(B)在1465 Hz下的NI值随时间的变化曲线

Figure 6. NI curves within 24 h for HFF cells at 977 Hz (A) and HaCaT cells at 1465 Hz (B)

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为了进一步分析HFF细胞定向行为对交流阻抗响应的影响, 本文将NI值分别与定向延长(E＞4)和定向排列(θ＜10°)的细胞百分比(R%)进行了关联(图 7), 发现NI值与定向细胞百分比呈正相关, 并且NI值与θ＜10°的细胞百分比之间存在明显的线性关系: NI=0.037×R%+0.040, 相关系数为R=0.990, 说明通过交流阻抗响应可以反映出细胞的定向排列行为, 为细胞交流阻抗技术在临床研究领域的应用提供一定的支持.

图 7

图 7. HFF细胞NI值与定向延长(E＞4)的细胞百分比(A)以及定向排列(θ＜10°)的细胞百分比(B)之间的关联图

Figure 7. Correlation between NI value and ratio of elongated cells (E > 4, A) and aligned cells (θ < 10°, B) for HFF cells on nano-grooves

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3.   结论

本文利用纳米压印技术在金基底上制备了沟和脊宽度为200 nm、深度为70 nm的纳米沟槽用于模拟体内的细胞外基质, 并首次对皮肤创伤修复过程中的两种主要功能细胞——人真皮成纤维细胞(HFF)和人永生化表皮细胞(HaCaT)在纳米沟槽上的定向行为进行了实时监测和分析.研究发现, 该纳米沟槽对HFF细胞有“接触引导”作用, 能够诱导HFF细胞产生定向行为, 且HFF细胞先沿着纳米沟槽的方向进行定向排列, 再实现胞体的延长; 相比之下, 纳米沟槽对HaCaT细胞的形貌几乎没有影响, 而且还延缓了细胞的粘附和铺展进程.从两种细胞在纳米沟槽和平面金电极上的归一化阻抗值(NI)来看, 随着培养时间的延长, HFF细胞和HaCaT细胞的NI值在两种基底上都呈现出了增长的趋势, 且前6 h内的增长速率都大于后18 h内的增长速率.与平面金电极相比, HFF细胞在纳米沟槽上的NI值更大, 说明纳米沟槽对HFF细胞的粘附和铺展起到了促进作用.结合细胞的定向行为, 表明细胞定向排列引起的NI值变化要大于细胞延长引起的NI值变化.对于HaCaT细胞而言, 其在纳米沟槽上的NI值反而减小了, 说明纳米沟槽不利于HaCaT细胞的粘附和铺展.本文进一步将HFF细胞在纳米沟槽上的NI值与发生定向行为的细胞比例相关联, 发现定向细胞百分比的增加会使得NI值随之增加, 且NI值与定向排列的细胞百分比之间存在着良好的线性关系, 为基于细胞交流阻抗技术的复合型细胞传感器的发展及其在临床研究领域中的应用提供一定的支持.

4.   实验部分

4.1   方法

4.1.1   纳米沟槽的制备

本文采用纳米压印技术制备纳米沟槽.首先, 在干净、干燥的石英基底上沉积10 nm钛层, 之后通过电子束蒸镀技术涂覆厚度为90 nm的金层, 其中, 钛层作为石英和金层之间的粘附层, 避免金层脱落.接着, 将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)旋涂在金层上, 150 ℃加热3 min, 然后利用高精度纳米压印机将纳米压印模板(尺寸为12.5 mm×12.5 mm, 线宽为200 nm, 周期为400 nm, 高度为110 nm, 购自于北京德信有限公司)印在PMMA层上, 冷却20 min之后将模板与基底分离, 纳米沟槽的图案转移至PMMA层.然后通过反应离子蚀刻技术(RIE)和电感耦合等离子体蚀刻技术对图案下的PMMA层和金层进行蚀刻, 最后通过RIE去除残余的PMMA, 从而在金基底上获得纳米沟槽结构(图 8).

图 8

图 8. 纳米沟槽示意图

Figure 8. Schematic diagram of nano-grooves

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4.1.2   交流阻抗监测器件的构建

为了同时实现细胞交流阻抗信号的采集和细胞形貌的观察, 本文设计并构建了细胞交流阻抗监测器件以发展复合型细胞传感器. 图 9A是监测器件的结构组成示意图, 聚四氟乙烯培养池、聚二甲基硅氧烷(PDMS)密封层、纳米沟槽工作电极(WE, 以平面金电极作为对照)以及聚四氟乙烯底板通过螺丝进行组装固定, 环状铂网作为对电极/参比电极(CE/RE)放置在培养池内, 与工作电极呈相对位置.工作电极有效面积为0.28 cm², 细胞培养池的倒圆台设计使得对电极/参比电极的面积远远大于工作电极, 两者比值为25:1, 从而提高监测的灵敏度^[30]. 图 9B是监测器件的实物图.

图 9

图 9. (A) 交流阻抗器件构成示意图和(B)交流阻抗器件实物图

Figure 9. (A) Schematic presentation of the impedance device composition and (B) photograph of the device

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4.1.3   细胞培养与种植

本文以人真皮成纤维细胞HFF和人永生化表皮细胞HaCaT作为研究对象. HFF细胞在添加了10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1%谷氨酸钠、1%非必需氨基酸和1%丙酮酸钠溶液的DMEM培养基中进行培养. HaCaT细胞在添加了10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素的MEM培养基中进行培养.在37 ℃, 5% CO₂的培养环境中, 待细胞汇合度达到80%时, 用0.25%(含EDTA)胰蛋白酶消化, 离心、台盼蓝染色计数后, 以8000细胞/cm²种植于纳米沟槽上.

4.2   皮肤细胞在纳米沟槽上的定向行为分析

两种皮肤细胞在纳米沟槽上分别培养2、4、6、12和24 h后, 通过显微镜采集纳米沟槽上多处不同部位上的细胞图像, 观察细胞的粘附及铺展过程, 并选取至少10张照片进行定向行为的定量分析和细胞计数.

4.3   交流阻抗实时监测皮肤细胞在纳米沟槽上的粘附与铺展

在纳米沟槽上种植细胞之前, 在交流阻抗监测器件中加入4 mL新鲜培养液, 放置10 min后, 采集无细胞时的交流阻抗信号作为空白值.之后, 将两种皮肤细胞分别接种于纳米沟槽上, 前6 h内, 每1 h采集一次交流阻抗信号, 6~24 h内, 每2 h采集一次信号, 扫描频率范围为1 Hz~100 kHz, 电压振幅为10 mV, 根据我们课题组之前的研究结果, 该电压振幅不会影响细胞的正常生长^[31].为了消除细胞培养液对交流阻抗响应的影响, 每次采集交流阻抗信号之前需更换新鲜培养液.
Supporting information for this article is available free of charge via the Internet at http://sioc-journal.cn.
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图 1 (A) 纳米沟槽的AFM表征图和(B) AFM测量高度图

Figure 1 (A) AFM image of nano-groove and (B) height profiles of the cross-section analysis

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图 2 HFF细胞在纳米沟槽(A)和平面电极(B)上以及HaCaT细胞在纳米沟槽(C)和平面电极(D)培养2、4、6、12和24 h时的图片(箭头表示纳米沟槽的方向), 以及HFF细胞(E)和HaCaT细胞(F)在两种电极上的数目统计

Figure 2 Images of HFF cells on nano-grooves (A) and flat electrode (B), HaCaT cells on nano-grooves (C) and flat electrode (D) with the indication of nano-grooves direction by arrows, and the numbers of HFF cells (E) and HaCaT cells (F)

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图 3 细胞拟合参数示意图

Figure 3 Schematic representation of cell fitting and parameters

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图 4 定向排列(θ＜10°)和定向延长(E＞4)的HFF细胞百分比随时间变化曲线

Figure 4 Ratio of aligned cells (θ < 10°) and elongated cells (E > 4) over culture time for HFF cells

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图 5 24 h内HFF细胞(A)和HaCaT细胞(B)在纳米沟槽上的Bode图

Figure 5 Bode plots for HFF cells (A) and HaCaT cells (B) on nano-grooves within 24 h

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图 6 24 h内, HFF细胞(A)在977 Hz下, HaCaT细胞(B)在1465 Hz下的NI值随时间的变化曲线

Figure 6 NI curves within 24 h for HFF cells at 977 Hz (A) and HaCaT cells at 1465 Hz (B)

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图 7 HFF细胞NI值与定向延长(E＞4)的细胞百分比(A)以及定向排列(θ＜10°)的细胞百分比(B)之间的关联图

Figure 7 Correlation between NI value and ratio of elongated cells (E > 4, A) and aligned cells (θ < 10°, B) for HFF cells on nano-grooves

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图 8 纳米沟槽示意图

Figure 8 Schematic diagram of nano-grooves

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图 9 (A) 交流阻抗器件构成示意图和(B)交流阻抗器件实物图

Figure 9 (A) Schematic presentation of the impedance device composition and (B) photograph of the device

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