English

• 1.   引言

  以氨基酸为基本单位的蛋白质是人类生命的物质基础^[1].蛋白质种类繁多、分布广泛、功能各异, 因而是生物体内一类非常重要的分子.生物界蛋白质的种类预计在10¹⁰~10¹²数量级, 主要是肽链上参与蛋白质组成的20种氨基酸在排列顺序上的不同而导致的.这种序列异构现象正是蛋白质功能多样性的基础, 它使得生物体内每种细胞具有特定的活性、从而维系整个生物体的良性循环^{[1, 2]}.蛋白质的检测方法有:荧光共振转移(FRET), 原子力显微镜(AFM)等^{[3, 4]}.这些方法都要求提前对待检样品进行化学修饰, 不仅过程繁琐而且检测成本高.不同于之前几种检测方法, 纳米孔技术^{[5, 6]}有如下优势: (1)待测物不需要额外的修饰和标记; (2)实验平台简单, 纳米孔技术结合膜片钳放大器即可完成检测.

  纳米孔技术起源于库仑计数器, 最早应用于DNA测序^[7~11], 近年来逐步涉及蛋白质检测.与DNA测序相比, 用纳米孔来检测蛋白质具有一定的难度, 首先蛋白质的结构不稳定, 容易受到电场、温度场等外界作用影响, 其次, 蛋白质是两性分子, 它在电解质溶液中的带电性受到溶液酸碱度的影响^[12].纳米孔主要分为两大类, 一类是以α-溶血素^[13]、噬菌体phi29连接器^[14]、气单胞菌溶素^[15]为代表的生物孔, 另一类是以Si₃N₄^[16]、石墨烯^[17]为材料的固态孔.生物孔虽然最先被研究和应用, 但会受到脂质双分子层稳定性差、使用寿命短, 环境耐受性差、易受外界温度等因素的影响.固态纳米孔是随着微纳加工技术发展而来的, 具有稳定性好、孔径可控、可批量制造等优势, 但是由于工艺的局限性, 小孔的制备仍旧存在一定难度, 这使得固态孔在信噪比、分辨率等方面存在着提升的空间.未来, 固态纳米孔可以结合二维材料、表面化学修饰等技术, 实现更高精度的测量^[18~20].

  过去的十几年里, 国内外的科学家们致力于利用纳米孔实现单个蛋白质到多个蛋白质结合物的检测^[21].单个蛋白质分子的研究主要包含蛋白质结构的预测^[22], 蛋白质折叠状态的表征^[23], 蛋白质与纳米孔壁相互作用机制^[24]等方面.其中, 龙亿涛课题组率先利用单个纳米孔道的空间限域效研究了P53蛋白与DNA间的弱相互作用, 该工作通过电化学空间限域的方式放大了生物分子间的弱相互作用, 实现了生物分子微小构型变化的超灵敏检测^{[25, 26]}.多个蛋白的研究主要涉及疾病检测领域^[27~31], Wang小组^[32]用内壁修饰了抗原的生物孔噬菌体phi29连接器检测了结肠癌的特异性抗体. Han小组^[33]检测了人体绒毛膜促性腺激素并实时观测了加入抗体后溶液中结合物的变化. Freeman小组^[34]检测了人体免疫缺陷病毒包膜表面的糖蛋白gp120及其与抗体的结合物并模拟了多组分环境.

  本文基于固态纳米孔技术, 完成了单个蛋白质分子及蛋白质分子-蛋白质分子结合物的检测.首先讨论了电压及电解质溶液的酸碱度对牛血清蛋白分子(BSA)易位的影响, 通过分析比对不同情况下分子过孔时间分布, 总结出BSA分子受到外部施加电压及溶液酸碱度影响的一般规律.另外, 以抗原抗体之间高度特异性为理论基础, 用纳米孔进行了BSA抗原-抗体结合物的检测, 实现了抗体分子及抗原-抗体结合物的区分.

  2.   结果与讨论

  2.1   固态纳米孔的制备及表征

  实验中使用的Si₃N₄固态纳米孔制备^[16]过程如下: (1)在硅基底的两侧通过低压化学气相沉积(LPCVD)技术分别沉积上一层100 nm厚的Si₃N₄薄膜; (2)在下层薄膜上通过光刻技术(Photolithography)和反应离子刻蚀技术(Reactive ion etching)加工出一个正方形的小窗口; (3)透过小窗口继续在硅基底上通过湿法刻蚀技术(Wet etching)刻蚀出一个深槽, 当刻蚀到上层薄膜时停止, 此时上层薄膜处于悬空状态搭接在硅基底上; (4)在上层薄膜上通过离子束刻蚀技术(FIB)将薄膜减薄至10 nm; (5)继续在上层薄膜减薄区用FIB技术加工出一个35 nm左右的纳米孔. 图 1(a)展示了制备完成的氮化硅纳米孔的结构, 图 1(b)是制备完成的氮化硅纳米孔(直径约为35 nm)的扫描电镜图(SEM).

  图 1

  

  图 1.  固态纳米孔的表征. (a)纳米孔的结构图. (b)纳米孔的SEM图

  Figure 1.  Characterization of solid-state nanopore. (a) The structure of solid-state nanopore. (b) The SEM image of solid-state nanopore fabricated by FIB.

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  2.2   电压对BSA分子的易位影响

  首先讨论了低电压对天然态BSA分子过孔的影响.常温下BSA分子在水溶液中的等电位是4.7^[35], 因而在实验环境浓度为0.5 mol/L、酸碱度为8的氯化钾(KCl)溶液中, BSA分子带负电.膜片钳放大器给一对电极施加电压以形成电流通路.在电解质溶液中未添加蛋白质分子样品的情况下, 采集到的电流信号为一条稳定的直线(如图 2a).当在液池cis端添加了样品后, 带负电的蛋白质分子在电场驱动下会通过纳米孔到达trans端(如图 2b).当一个蛋白质分子在纳米孔内时, 电流信号就会产生一个下降峰, 当溶液中一系列的蛋白质分子通过纳米孔时, 电流信号就会产生一系列的下降峰, 每一个下降峰代表着一次蛋白质过孔事件, 通过分析电流信号, 统计得到分子过孔事件的平均幅值及过孔时间分布, 间接得到蛋白质的结构、大小等信息.

  图 2

  

  图 2.  外部电压对蛋白质易位时间的影响. (a)不加蛋白质样品时的电流轨迹图. (b)添加蛋白质样品后的电流轨迹图. (c)~(e)+200 mV, +250 mV, +300 mV三种情况下的易位时间分布曲线. (d)三种电压下的蛋白质过孔速度趋势图

  Figure 2.  The effects of applied voltage on protein translocation time. (a) The current trace without protein samples. (b) The current trace with protein samples. (c)~(e): The dwell time distribution of protein under +200 mV, +250 mV and +300 mV. (f) Trend of protein translocation velocity under increasing voltage

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  实验中使用的纳米孔直径为35 nm、长度10 nm.外部施加电压为+200 mV、+250 mV、+300 mV. BSA分子在三种电压下的过孔时间分布曲线图如图 2(c)~(e)所示, 图中使用分子过孔时间分布函数^{[24, 25]}对实验曲线进行拟合以突显数据的集中程度.不同电压下分子过孔速度的点线图如图 2(f)所示, 可以看出, 随着电压从+200 mV升高到+300 mV, BSA分子的过孔速度从0.14927 nm/ms提高到0.2002 nm/ms, 即BSA分子的过孔时间随着电压的升高而缩短.

  低电压下, BSA分子保持天然态椭球状.其以天然完全折叠状通过纳米孔时, 易位时间^[36~38]可由1-D Langevin方程推导为:

  ${t_{\rm{d}}} = {C_{\rm{f}}} \cdot \eta {H_{{\rm{eff}}}}^2/(Q\psi )$

  (1)

  式中, α=ηC_f摩擦系数^[36], η溶液粘性, C_f与蛋白质特定形状有关的常数, Q蛋白质总的静电荷数, ψ偏置电压.从公式中, 可以看出过孔时间与偏置电压呈倒数关系.即当加在纳米孔两端的偏压增大时, 易位时间将减小, 这就是低电压+200 mV~+300 mV区间内蛋白质分子过孔时间缩短的原因.

  2.3   溶液酸碱度对BSA分子的易位影响

  实验环境为浓度为0.5 mol/L的氯化钾溶液, 外部电压为+400 mV, 纳米孔直径约为35 nm、孔长约为10 nm, 溶液的pH分别设置为6、8、10, 由于BSA分子在室温下的等电位是4.7, 所以在实验环境中的蛋白质分子都是带负电荷的.

  BSA分子在相同的外部电压、同种浓度不同酸碱度的电解质溶液中的过孔时间分布图如图 3(a)所示.蛋白质的过孔时间随着溶液酸碱度的升高而减小, BSA分子在pH等于6和8的溶液中的过孔时间近似, 后者比前者过孔时间略短, BSA分子在pH等于10的溶液中过孔时间比在前两种溶液中有了明显的缩短.通过分子过孔时间分布的函数对曲线进行拟合, 可以看到随着溶液酸碱度的提高分子的过孔速度相应的提高, 且溶液pH值越大分子过孔速度上升得越明显, 如图 3(b).

  图 3

  

  图 3.  电解质溶液的酸碱度对蛋白质易位时间的影响. (a)~(c): pH=6, pH=8, pH=10三种情况下的易位时间分布曲线. (d)三种酸碱度下的蛋白质过孔速度柱状图

  Figure 3.  The effects of the buffer pH on protein translocation time. (a)~(c): The dwell time distribution of protein under pH=6, pH=8 and pH=10. (d) Trend of protein translocation velocity under different pH of buffer solution.

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  由于蛋白质是两性分子, 也就是, 蛋白质分子的带电属性及带电量直接受到溶液环境的影响, 当我们调控了电解质溶液的酸碱度时, 同时改变了蛋白质的带电量.实验中溶液酸碱度设置为6、8、10, 使得蛋白质在这三种情况下都是带负电荷的, 且溶液pH越高蛋白质所带的负电荷越多, 因而在电场作用下, 带电荷越多的蛋白质受到的场强越大, 从而使得蛋白质易位事件更活跃, 蛋白质易位速度提高, 蛋白质的过孔时间明显缩短.

  2.4   蛋白质-蛋白质结合物的易位实验研究

  抗原、抗体本质上都是蛋白质, 基于免疫学抗原抗体特异性结合的理论, 当抗原遇到具有特异性的抗体时, 两者就会通过多种共价作用在化学结构及空间构型上互补, 与抗体结合后的抗原相当于被抗体标记, 从而使得抗原被机体免疫系统识别并清除^[2].这里我们借助纳米孔技术免标记以及单分子检测的优势, 对抗原-抗体结合物(即蛋白质-蛋白质结合物)进行了实验研究.

  实验以BSA分子的抗原及抗体作为样品, 首先在液池cis端添加BSA抗体, 检测到BSA抗体的过孔信号, 紧接着在cis端添加BSA抗原, 待BSA抗原、抗体混合2 h后, 继续检测混合物的信号.对比添加BSA抗原前后两次的电流信号, 统计并分析其幅值, 预测如果抗原、抗体未发生结合, 则混合后的电流信号应出现两种易位事件且分别为抗原及抗体的易位事件, 而如果两者发生了特异性结合, 混合后检测到的电流信号应为两者结合物的信号, 即一种分子的易位事件.

  为了使得添加BSA抗原前后的两组实验数据对比更明显, 图 4将BSA抗体及BSA抗原、抗体混合物两组实验结果合并在一张图上.左侧图 4(a)为散点图, 用以显示数据点的集中程度, 右侧图 4(b)为相对电流幅值分布柱状图, 用以观察溶液中分子的大小.两组实验通过颜色标记加以区分, 红色为BSA抗体的实验数据, 蓝色为BSA抗原抗体混合物的实验数据.散点图中, 横坐标代表过孔时间, 纵坐标代表相对电流幅值比(ΔI_b/I₀).从纵坐标方向来看, BSA抗原抗体混合物比纯BSA抗体的相对幅值比大一些.在相对电流幅值比分布柱状图中, 用高斯分布对图形进行了拟合, 拟合数据显示BSA抗体过孔事件高斯峰所对应的ΔI_b/I₀为0.0101, 而BSA抗原抗体混合物为0.02377, 后者在数值上近似为前者的两倍.

  图 4

  

  图 4.  抗体及抗原抗体混合物的易位事件统计. (a)散点图. (b)相对电流幅值柱状图.红色代表抗体, 蓝色代表抗原抗体混合物

  Figure 4.  Translocation events of antibody and mixture of antibody and antigen. (a) Scatter plot; (b) Relative current drop histogram. Pink block represents antibody, blue block represents mixture of antibody and antigen

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  借助于纳米孔内分子有效直径^[39~41]的计算公式:

  ${d_{\rm{m}}} \cong {[(\Delta {I_{\rm{b}}}/{I_0})(l + 0.8{d_{\rm{p}}})d_{\rm{p}}^2]^{1/3}}$

  (2)

  式中, d_m是需要计算的蛋白质在孔内的有效直径, ΔI_b是电流幅值, I₀是基线电流, l是孔长, d_p是孔的直径. l+0.8d_p是修正系数, 可以估算出添加BSA特异性抗原前后, 溶液中分子的平均分子直径分别为: 7.776 nm, 10.343 nm, 即BSA抗原与抗体发生了特异性结合, 混合后检测到的电流信号为两者结合物的信号, 且结合后的ΔI_b/I₀较纯抗体溶液的更大.

  3.   结论

  基于纳米孔技术, 先后开展了单个蛋白质分子及抗原-抗体结合物的检测.分别讨论了外部电压和电解质溶液酸碱度这两种因素对BSA分子易位事件的影响.在低电压下, BSA分子过孔速度随着电压的升高而加快.当溶液高于蛋白质等电位且逐渐升高时, BSA分子的过孔时间逐渐缩短.可以看到, 电压和溶液酸碱度直接影响蛋白质带电量进而延长或缩短蛋白质的易位时间.

  另外, 基于抗原抗体两者间的高度特异性, 实验对比了BSA抗体溶液在添加了特异性BSA抗原前后分子的易位事件.添加特异性抗原之前, 溶液中仅有纯抗体分子, 在添加了特异性抗原之后, 抗原抗体分子结合, 溶液中存在大量抗原-抗体结合物及少量游离分子, 因而结合后的ΔI_b/I₀较之前的有所提高.

  未来, 因其免标记、单分子检测等优势, 纳米孔技术有望应用于多蛋白质的辨识、蛋白质相互作用机制等方面的研究.

  4.   实验部分

  蛋白质样品牛血清蛋白BSA、BSA抗原、BSA抗体、PBS缓冲液均购自于上海生工生物工程有限公司.氯化钾、氢氧化钾、盐酸购自美国Sigma-Aldrich有限公司, 电解质溶液的pH值使用瑞士Mettler Toledo国际有限公司的台式pH计进行调定.实验溶液制备过程中的超纯水均由美国Millipore公司的Milli-Q超纯水系统提供.

  纳米孔技术的单分子检测原理如图 5所示, 含有纳米孔的芯片夹持在一对盛有电解质溶液的液池之间, 两侧液池分别被定义为cis端和trans端, cis端一般接地并添加待检样品, trans端通常连接电源的正极或负极.一对Ag/AgCl电极分别插入两侧液池中, 并连接膜片钳放大器(Axon 700B).膜片钳放大器用以施加电压并采集实验电流信号, 采样频率为250 kHz, 低通滤波为10 kHz.为了减小外界噪音对实验的影响, 整个实验装置设置在黑色的法拉第笼中, 且整个实验室的内部墙壁使用铜网进行噪音屏蔽.

  图 5

  

  图 5.  实验装置图.液池包含cis和trans两端, cis端接地并添加待检样品, trans端连接电源的正极或负极

  Figure 5.  Experimental device. The chamber includes two sides: cis and trans. The cis side is grounded and added with samples, while the trans side is connected with positive or negative terminal of the power supply

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      Han, A. P.; Schurmann, G.; Mondin, G.; Bitterli, R. A.; Hegelbach, N. G.; de Rooij, N. F.; Staufer, U. Appl. Phys. Lett. 2006, 88, 093901. doi: 10.1063/1.2180868

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      Larkin, J.; Henley, R. Y.; Muthukumar, M.; Rosenstein, J. K.; Wanunu, M. Biophys. J. 2014, 106, 696. doi: 10.1016/j.bpj.2013.12.025

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  图 1  固态纳米孔的表征. (a)纳米孔的结构图. (b)纳米孔的SEM图

  Figure 1  Characterization of solid-state nanopore. (a) The structure of solid-state nanopore. (b) The SEM image of solid-state nanopore fabricated by FIB.

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  图 2  外部电压对蛋白质易位时间的影响. (a)不加蛋白质样品时的电流轨迹图. (b)添加蛋白质样品后的电流轨迹图. (c)~(e)+200 mV, +250 mV, +300 mV三种情况下的易位时间分布曲线. (d)三种电压下的蛋白质过孔速度趋势图

  Figure 2  The effects of applied voltage on protein translocation time. (a) The current trace without protein samples. (b) The current trace with protein samples. (c)~(e): The dwell time distribution of protein under +200 mV, +250 mV and +300 mV. (f) Trend of protein translocation velocity under increasing voltage

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  图 3  电解质溶液的酸碱度对蛋白质易位时间的影响. (a)~(c): pH=6, pH=8, pH=10三种情况下的易位时间分布曲线. (d)三种酸碱度下的蛋白质过孔速度柱状图

  Figure 3  The effects of the buffer pH on protein translocation time. (a)~(c): The dwell time distribution of protein under pH=6, pH=8 and pH=10. (d) Trend of protein translocation velocity under different pH of buffer solution.

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  图 4  抗体及抗原抗体混合物的易位事件统计. (a)散点图. (b)相对电流幅值柱状图.红色代表抗体, 蓝色代表抗原抗体混合物

  Figure 4  Translocation events of antibody and mixture of antibody and antigen. (a) Scatter plot; (b) Relative current drop histogram. Pink block represents antibody, blue block represents mixture of antibody and antigen

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  图 5  实验装置图.液池包含cis和trans两端, cis端接地并添加待检样品, trans端连接电源的正极或负极

  Figure 5  Experimental device. The chamber includes two sides: cis and trans. The cis side is grounded and added with samples, while the trans side is connected with positive or negative terminal of the power supply

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