基于杂交链式反应信号放大和磁分离技术荧光检测端粒酶活性

引用本文: 张佳玉, 周晓毓, 周曼, 贾红霞. 基于杂交链式反应信号放大和磁分离技术荧光检测端粒酶活性[J]. 化学学报, 2016, 74(6): 513-517. doi: 10.6023/A16030136 shu

Citation: Zhang Jiayu, Zhou Xiaoyu, Zhou Man, Jia Hongxia. Detection of Telomerase Activity Based on Signal Amplification of Hybridization Chain Reaction Combining with Magnetic Separation[J]. Acta Chimica Sinica, 2016, 74(6): 513-517. doi: 10.6023/A16030136 shu

基于杂交链式反应信号放大和磁分离技术荧光检测端粒酶活性

1.
河北大学化学与环境科学学院保定 071002

通讯作者: 贾红霞, E-mail: jia123renren@126.com

基金项目:
教育部博士点基金 20121301120006

国家自然科学基金青年基金 21405032

摘要: 端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶, 它一般在癌细胞中被激活.它与端粒DNA的不断复制以及癌细胞的不断增殖密切相关.所以检测端粒酶的活性对癌症的早期诊断以及以端粒酶为靶标分子的抗癌药物的开发具有重要意义.利用杂交链式反应(HCR)无酶放大检测信号, 建立了一种简单、快速的端粒酶活性检测方法.端粒酶延伸产物是一条末端具有(ggttag)_n重复序列的DNA.在实验过程中, 通过链霉亲合素与生物素的特异性作用将端粒酶延伸产物连接在磁性微球上.设计一条端粒酶延伸产物特异性的DNA探针I作为杂交链式反应的引发探针. DNA探针I的3'-端与端粒酶延伸产物的重复序列匹配, 通过杂交, DNA探针I被固定在磁球上; DNA探针I的5'-端引发DNA探针II和探针III发生杂交链式反应. DNA探针II和探针III上都标记有荧光基团, 可以利用荧光直接进行信号检测.在反应过程中, 通过磁分离去除多余未反应的三种DNA探针.在优化条件下, 可以检测到1.0×10⁵个Hela细胞中的端粒酶活性.该方法简单、快速、检测成本低, 分析全程无酶参与, 在肿瘤或癌症的临床诊断以及以端粒酶为靶标分子的抗癌药物的筛选上具有广阔的应用前景.

关键词:

English

Detection of Telomerase Activity Based on Signal Amplification of Hybridization Chain Reaction Combining with Magnetic Separation

1.
College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Baoding 071002, China

Corresponding author: Jia Hongxia, jia123renren@126.com

Received Date: 18 March 2016
Fund Project:
the Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China

the National Natural Science Foundation of China

Abstract: Telomerase is a ribonucleoprotein complex that is usually activated in the cancer cells and is closely related to telomere maintenance and immortalization of cancer cells. Telomerase activity detection is important for early diagnosis of human cancers as well as the screening of telomerase-target anti-cancer drugs. A new simple and fast method to detect the telomerase activity has been developed based on hybridization chain reaction (HCR) and magnetic separation. In the assay of experiment, the biotin-labeled telomerase substrate is elongated by telomerase generating a special DNA with repeated sequences-(ggttag)_n at their terminals. These telomerase elongated products are fixedly connected with streptavidin-coated magnetic beads through the specific combination of streptavidin with biotin. At the same time, other cell extracts are removed by magnetic separation. A specific DNA probe I is designed as the initiator of HCR. 3'-Terminus of DNA probe I is complementary with three repeated sequences of telomerase elongated product. So, DNA probe I could be fixed on magnetic bead through hybridization. 5'-Terminus of DNA probe I is in charge of triggering HCR with DNA probe II and probe III. DNA probe II and probe III are modified with fluorophores. So, the HCR amplification results can be easily detected by fluorescence. All of excessive DNA probes can be removed by magnetic separation. Under the optimal conditions, telomerase activity in 1.0×10⁵ Hela cells has been obviously detected. Because no enzyme involves in the signal amplification process of HCR, our proposed method can effectively avoid the interference of nonspecific amplification which usually exists in the polymerase amplification processes and increase the accuracy of the test results. Furthermore, enzyme-free signal amplification can effectively avoid the potential interference of telomerase inhibitor to the enzyme activity and improve the reliability of screening of telomerase inhibitors.

Key words:

1    引言

2004年, Pierce等^[16]首次报道了杂交链式反应(hybridization chain reaction, HCR). HCR是一种恒温无酶信号放大技术. HCR包括一个引发DNA探针和两个交错互补的发夹型DNA探针(H1和H2).引发探针触发HCR反应开始, 探针H1和H2的发夹结构相继打开, 形成长的H1和H2交替杂交的共聚物, 直至H1和H2消耗完为止, 实现信号放大的目的. HCR受到了研究人员的广泛关注, 并被用于各种生物分子的检测, 如DNA^[17~19]、miRNA^[20]、蛋白质等^[21]. HCR最大的优势就是整个反应过程无酶参与, 避免了非特异性扩增对分析结果的影响, 且反应条件温和, 易控制. 2015年, Wang等^[22]报道了基于HCR反应电化学检测端粒酶活性的方法.该方法可以检测到2个Hela细胞中的端粒酶活性.但该方法过程比较复杂, 需要对金纳米粒子进行标记, 耗时长.

端粒DNA是位于染色体末端特殊的具有重复序列的DNA, 对染色体起到保护作用.在细胞分裂、染色体复制过程中, 染色体DNA每被复制一轮, 端粒DNA的末端就会缩短一个RNA的长度, 当端粒DNA缩短到一定程度, 细胞就会凋亡, 人或动物就会出现衰老, 甚至死亡^[1].端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的反转录酶, 它能够与端粒DNA结合, 以自身的RNA为模板使端粒DNA不断复制, 从而使端粒DNA不再缩短, 细胞不再凋亡^[2].但是, 端粒酶活性在正常细胞中(永生细胞除外, 如造血细胞, 生殖细胞等)很难被检测到, 它一般在肿瘤或癌细胞中被激活.所以, 检测端粒酶活性对于研究端粒酶的生理功能, 肿瘤或癌症的早期诊断, 以及开发以端粒酶为靶标分子的抗癌药物都具有重要意义^[3].

本文建立了一种非常简单的, 基于HCR放大作用和磁分离技术荧光检测端粒酶活性的新方法.将端粒酶延伸产物特异性的DNA探针作为HCR引发探针, 利用荧光直接检测信号放大结果. HCR是一种不需要酶参与的信号放大技术.无酶参与可以有效避免非特异性扩增的干扰, 增加检测结果的准确性, 提高端粒酶抑制剂筛选的可靠性.同时利用磁分离技术, 将端粒酶延伸反应与后续信号放大及结果检测过程分开进行, 有效避免了其它细胞提取物对检测结果的影响.

即使在肿瘤或癌细胞中端粒酶的活性也很低, 所以目前的端粒酶活性检测方法大都利用扩增手段来提高检测灵敏度. Kim等^{[4, 5]}首先建立了基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增技术的端粒重复放大的方法(telomeric repeat amplification protocol, TRAP), 即先用端粒酶底物(telomerase substrate, TS)的DNA序列与端粒酶和dNTPs反应, 生成长链端粒重复序列的DNA, 该DNA经PCR扩增后进行电泳分离和检测.该方法可以检测到几个癌细胞中端粒酶的活性.由于检测灵敏度高, 基于TRAP的端粒酶活性检测方法受到广泛应用^[6~10].但是此类方法的缺点是: PCR扩增过程比较复杂, 需要准确的控温, 且反应时间较长.近年来, 基于恒温扩增检测端粒酶活性的方法受到人们的广泛关注.恒温指数扩增反应(isothermal exponential amplification reaction, IEXPAR)是利用DNA聚合酶和切口酶的共同作用, 在恒温条件下对短链DNA进行高效、快速的扩增^[11].其扩增效率可以与PCR技术相媲美.与PCR扩增相比, 所需时间短, 不需要精确的热循环.基于IEXPAR的端粒酶活性检测方法可以检测到单细胞中的端粒酶活性^{[12, 13]}.但IEXPAR反应需要两种酶共同作用, 增加了检测成本. 2010年, Ding等^[14]报道的基于恒温循环链顶替扩增反应检测端粒酶活性的方法可以检测到40个Hela细胞中的端粒酶活性. 2013年Zhao等^[15]报道的基于三维连接和碱基堆积杂交的端粒酶活性检测方法可以检测3个癌细胞中的端粒酶活性.这些基于恒温扩增检测端粒酶活性的方法的灵敏度已经可以与TRAP法相媲美.但是这些方法和TRAP一样存在非特异性扩增问题.非特异性扩增普遍存在于有聚合酶参与的变温或恒温扩增过程中.非特异性扩增是影响扩增结果准确性的重要因素.而且, 在端粒酶抑制剂的筛选上, 端粒酶抑制剂会影响聚合酶的活性, 从而影响端粒酶抑制剂筛选的可靠性.所以, 开发无酶扩增技术用于端粒酶活性检测对端粒酶活性研究以及开发以端粒酶为靶标分子的抗癌药物具有重要意义.

2    结果与讨论

2.1    端粒酶活性检测原理

基于杂交链式反应(HCR)的放大作用检测端粒酶活性的原理如图 1所示.将生物素修饰的端粒酶延伸反应引物(biotin-TS primer)与从Hela细胞提取的人端粒酶(human telomerase)在dNTPs存在条件下进行端粒酶延伸反应.端粒酶延伸产物中含有大量的端粒重复序列——(ggttag)_n.在延伸后的反应溶液中加入链霉亲和素(streptavidin, STV)表面功能化的磁性微球(magnetic bead, MB).通过STV-biotin强烈的相互作用, 磁球将端粒酶延伸产物捕捉并与其它细胞提取物分离.加入3′-端与端粒酶重复序列匹配的DNA探针I (DNA probe Ⅰ)与磁球上的端粒酶延伸产物进行杂交结合. DNA probe Ⅰ通过3′-端(黑色部分)与端粒酶延伸产物重复序列杂交匹配, 固定在磁球上. DNA probe Ⅰ暴露的5′-端序列(红色部分)与DNA探针Ⅱ (DNA probe Ⅱ)的5′-端序列(黄色部分)杂交匹配; DNA probe II的3′-端序列(深蓝色部分)又与DNA探针Ⅲ (DNA probe Ⅲ)的3′-端序列(浅蓝色部分)是匹配的. DNA probe Ⅲ暴露的5′-端序列(红色部分)与DNA probe Ⅱ的5′-端序列是匹配的, 又可以引发新一轮的杂交反应.如此反复交替杂交, 形成杂交链式反应.每一步反应之后都会通过磁分离去除多余的DNA探针.每条端粒酶延伸产物可以结合多个DNA probe Ⅰ, 每一个DNA probe Ⅰ可以引发一个杂交链式反应.这样每条端粒酶延伸产物上就可以发生多个HCR反应.起到信号富集放大的作用.由于DNA probe Ⅱ和DNA probe Ⅲ上标记有荧光基团, 我们可以通过荧光对信号放大结果进行直接检测.

图1 基于HCR的端粒酶活性检测原理

Figure 1. Schematic representation of telomerase activity assay based on HCR

图选项

下载全尺寸图像

下载幻灯片

2.2    实验条件优化

端粒酶延伸产物中重复序列的数量通常为3~14个^[23], 所以本文中选择利用生物素修饰的含有10个端粒重复序列的合成端粒酶延伸产物(biotin-synthetic te-lomerase elongated product, biotin-STEP)作为检测样品, 进行实验条件的优化.

2.3    线性范围与检出限

根据以上确立的最佳实验条件, 研究了不同浓度的合成的端粒酶延伸产物——biotin-STEP的荧光光谱(图 4A).结果表明, 在0.25~5.0 nmol/L范围内, 样品荧光强度扣除空白荧光强度(I―I₀)与样品浓度之间具有良好的线性关系(如图 4B所示), 其线性回归方程为I-I₀＝92543.04+94069.67C_biotin-STEP (nmol/L), 线性相关系数R为0.9947.

图4 (A)不同浓度的biotin-STEP产生的荧光光谱; (B)荧光强度(I-I₀)与biotin-STEP浓度之间的线性关系

Figure 4. (A) Fluorescence spectra produced by biotin-STEP with different concentrations; (B) Relationship between the fluorescence intensity (I-I₀) of the fluorescence spectra at 523 nm and the concentration of biotin-STEP

图选项

下载全尺寸图像

下载幻灯片

2.4    实际样品检测

图5 从不同数量Hela细胞中提取的端粒酶产生的荧光光谱

Figure 5. Fluorescence spectra produced by telomerase extracted from different amount of Hela cells

图选项

下载全尺寸图像

下载幻灯片

按实验过程所述, 从Hela细胞中提取端粒酶.使用不同数量的端粒酶(以细胞个数计数)进行端粒酶延伸反应, 得到实际样品的端粒酶延伸产物, 按照建立的方法进行荧光光谱测量.如图 5所示, 该方法可以检测到1.0×10⁵个Hela细胞中提取的端粒酶的活性.对照实验是将从3.0×10⁵个Hela细胞中提取的端粒酶加热到90 ℃失活后按照测定端粒酶活性的相同步骤进行实验.对照实验与空白实验产生的荧光曲线非常相近, 与样品(3.0×10⁵个Hela细胞提取的端粒酶)产生的荧光曲线具有显著差别, 证明该端粒酶活性检测方法的可靠性.

2.2.2    优化DNA probe Ⅱ和DNA probe Ⅲ的浓度

样品荧光信号是由参与HCR反应的DNA probe Ⅱ和DNA probe Ⅲ产生的, 所以DNA probe Ⅱ和DNA probe Ⅲ浓度是影响检测结果的重要因素.本文选择DNA probe Ⅱ和DNA probe III的浓度相同, 并对其进行优化.优化结果如图 3所示, 随着DNA probe Ⅱ/Ⅲ浓度的增加, 样品荧光信号强度显著增加, 1.25 μmol/L之后趋于稳定, 空白荧光信号强度在我们研究的范围内变化不大.所以, 选择1.25 μmol/L DNA probe Ⅱ/Ⅲ作为实验浓度.

图3 DNA probe II/III的浓度对荧光强度的影响. DNA probe I的浓度为0.5 μmol/L, 其它实验条件如实验部分所述

Figure 3. Inﬂuence of concentration of probe II/III on the fluorescence intensity. The concentration of DNA probe I is 0.5 μmol/L. Other conditions are performed according to the experimental procedure described in Experimental Section

图选项

下载全尺寸图像

下载幻灯片

2.2.1    优化DNA probe Ⅰ的浓度

DNA probe I是HCR的启动引物, 其浓度对方法的灵敏度和检测动态范围具有很大的影响.如图 2所示, 在0.005~1.0 μmol/L范围内, 随着DNA probe I浓度的增加, 样品产生的荧光信号强度显著增加, 0.5 μmol/L之后趋于稳定, 而空白的荧光信号强度在此范围内变化不大, 所以选择DNA probe I的浓度为0.5 μmol/L.

图2 DNA probe I的浓度对荧光强度的影响. DNA probe II/III的浓度为1.25 μmol/L, 其它实验条件如实验部分所述

Figure 2. Inﬂuence of concentration of DNA probe I on the fluorescence intensity. The concentration of DNA probe II/III is 1.25 μmol/L. Other conditions are performed according to the experimental procedure described in Experimental Section

图选项

下载全尺寸图像

下载幻灯片

3    结论

本文利用杂交链式反应(HCR)对端粒酶延伸产物进行恒温信号放大, 研究建立了无酶参与信号放大, 荧光检测端粒酶活性的新方法.该方法可检测到1.0×10⁵个Hela细胞中提取的端粒酶的活性, 且通过对照实验证明了该端粒酶活性检测方法的可靠性.该方法不需要热循环, 信号放大过程中无酶参与, 避免了非特异性扩增的干扰, 有利于端粒酶抑制剂的筛选.同时利用磁分离有效避免了其它的细胞提取物对检测结果的影响, 提高了检测结果的准确性.

4    实验部分

4.1    实验仪器与试剂

1×Tris-HCl缓冲溶液组成: 10 mmol/L Tris-HCl, 1.0 mmol/L EDTA, 2.0 mol/L NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.3.

实验所用DNA序列如下:

5′-FAM-agtctaggattcggttgagactagtaggctgcttcg-P-3′ DNA探针Ⅲ:

5′-tcaaccgaatcctagactcgaagcagcctactagtc-FAM-3′

3-[(3-胆胺丙基)-二甲基胺]丙烷磺酸(CHAPS)细胞裂解液购于Millipore Co. Ltd.(美国).链霉亲和素(streptavidin)表面功能化的磁性微球(直径2.8 μm)购于Dynal Biotech(美国).所用的DNA(聚丙烯酰胺电泳纯化)购于上海生物工程公司.实验中所用的水均为二次去离子水.

biotin-STEP: 5′-biotin-aatccgtcgagcagagtt-ag(ggttag)₁₀-3′ DNA探针Ⅰ:

5′-tcaaccgaatcctagacttaaccctaaccctaaccc-P-3′ DNA探针Ⅱ:

1×PBS缓冲溶液组成: 137 mmol/L NaCl, 10 mmol/L磷酸盐缓冲, 2.7 mmol/L KCl, pH 7.4.

biotin-TS: biotin-5′-aatccgtcgagcagagtt-3′

Fluorolog 3-211荧光光谱仪(Horiba Jobin-Yivon, 法国)用于实验荧光光谱和荧光强度的测量. 2720热循环仪(Applied Biosystems, 美国)用于控制端粒酶延伸反应温度.摇床(KYC 100C rocking incubator, 上海福玛实验设备有限公司).

端粒酶延伸反应缓冲溶液: 20 mmol/L Tris-HCl, 1.5 mmol/L MgCl₂, 70 mmol/L KCl, 1.0 mmol/L EGTA[乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸], 0.05% Tween-20, pH 8.3.

4.2    端粒酶提取过程

Hela细胞从培养基中分离, 以冷的1×PBS缓冲溶液洗涤3次, 然后以2000 r/min在4 ℃离心10 min.分离出的细胞加入冷的CHAPS细胞裂解液, 在冰上放置30 min, 然后于4 ℃, 12000 r/min离心30 min.含有端粒酶的上层溶液放置在－80 ℃的超低温冰箱中保存备用.

4.3    端粒酶延伸过程

一定量的端粒酶提取液, 1.0 pmol端粒酶延伸反应引物(Biotin-TS primer), 200 μmol/L的dNTPs在端粒酶延伸反应缓冲溶液中混合均匀, 反应体积为40 μL.将此混合液置于2720热循环仪中, 37 ℃孵育1 h进行端粒酶延伸反应, 然后90 ℃ 10 min使端粒酶变性失活, 终止延伸.

4.4    HCR反应及荧光检测

磁分离上述杂交溶液, 用1×PBS缓冲溶液洗涤磁球3次, 分别加入1.25 μmol/L DNA probe II和DNA probe III, 重新悬浮在200 μL 1×PBS缓冲溶液中.在200 r/min, 30 ℃条件下孵育2 h, 然后用1×PBS缓冲洗涤3次, 除去多余的荧光探针, 最后悬浮在200 μL 1×PBS缓冲溶液中, 用荧光仪检测荧光信号.激发波长为480 nm, 发射波长为523 nm.

取5 μL磁性微球, 用1×Tris-HCl缓冲溶液洗涤3次, 加入60 μL该缓冲溶液使磁性微球重新悬浮并加入端粒酶延伸反应产物40 μL, 室温下孵育30 min, 并不断振荡.

将磁性微球与溶液磁分离, 用1×Tris-HCl缓冲溶液洗涤3次, 加入0.5 μmol/L DNA probe I, 悬浮于200 μL 1×PBS缓冲溶液.该溶液先水浴加热至70 ℃ 10 min, 然后在200 r/min, 30 ℃条件下孵育30 min, 以利于DNA probeＩ与端粒酶延伸产物充分杂交.
1. [1]
  Cohen, S. B.; Graham, M. E.; Lovrecz, G. O.; Bache, N.; Robinson, P. J.; Reddel, R. R. Science 2007, 315, 1850. doi: 10.1126/science.1138596
2. [2]
  Feng, J. L.; Funk, W. D.; Wang, S. S.; Weinrich, S. L.; Avilion, A. A.; Chiu, C. P.; Adams, R. R.; Chang, E.; Allsopp, R. C.; Yu, J. H.; Le, S. Y.; West, M. D.; Harley, C. B.; Andrews, W. H.; Greider, C. W.; Villeponteau, B. Science 1995, 269, 1236. doi: 10.1126/science.7544491
3. [3]
  (刘莹, 陈小曼, 张郎棋, 孙冬冬, 周艳晖, 陈兰美, 刘杰, 化学学报, 2014, 72, 473.) doi: 10.6023/A13101092Liu, Y.; Chen, X. M.; Zhang, L. Q.; Sun, D. D.; Zhou, Y. H.; Chen, L. M.; Liu, J. Acta Chim. Sinica 2014, 72, 473. doi: 10.6023/A13101092
4. [4]
  Kim, N. W.; Piatyszek, M. A.; Prowse, K. R.; Harley, C. B.; West, M. D.; Ho, W. P. L. C.; Coviello, G. M.; Wright, W. E.; Weinrich, S. L.; Shay, J. W. Science 1994, 266, 2011. doi: 10.1126/science.7605428
5. [5]
  Kim, N. W.; Wu, F. Nucleic Acids Res. 1997, 25, 2595. doi: 10.1093/nar/25.13.2595
6. [6]
  Szatmari, I.; Tőkés, S.; Dunn, C. B.; Bardos, T. J.; Aradi, J. Anal. Biochem. 2000, 282, 80. doi: 10.1006/abio.2000.4589
7. [7]
  Szatmari, I.; Aradi, J. Nucleic Acids Res. 2001, 29, e3. doi: 10.1093/nar/29.2.e3
8. [8]
  Wege, H.; Chui, M. S.; Le, H. T.; Tran, J. M.; Zern, M. A. Nucleic Acids Res. 2003, 31, e3.
9. [9]
  Xiao, Y.; Dane, K. Y.; Uzawa, T.; Csordas, A.; Qian, J. R.; Soh, H. T.; Daugherty, P. S.; Lagally, E. T.; Heeger, A. J.; Plaxco, K. W. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 15399. doi: 10.1021/ja107085n
10. [10]
  (黄艳萍, 孔德明, 张晓斌, 沈含熙, 宓怀风, 化学学报, 2004, 62, 274.) http://sioc-journal.cn/Jwk_hxxb/CN/abstract/abstract343867.shtmlHuang, Y. P.; Kong, D. M.; Zhang, X. B.; Shen, H. X.; Mi, H. F. Acta Chim. Sinica 2004, 62, 274. http://sioc-journal.cn/Jwk_hxxb/CN/abstract/abstract343867.shtml
11. [11]
  Van Ness, J.; Van Ness, L. K.; Galas, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003, 100, 4504. doi: 10.1073/pnas.0730811100
12. [12]
  Zhang, Y.; Wang, L. J.; Zhang, C. Y. Chem. Commun. 2014, 50, 1909. doi: 10.1039/c3cc48518h
13. [13]
  Tian, L. L.; Weizmann, Y. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 1661. doi: 10.1021/ja309198j
14. [14]
  Ding, C. F.; Li, X. L.; Ge, Y.; Zhang, S. S. Anal. Chem. 2010, 82, 2850. doi: 10.1021/ac902818w
15. [15]
  Zhao, Y. X.; Qi, L.; Chen, F.; Zhao, Y.; Fan, C. H. Biosens. Bioelectron. 2013, 41, 764. doi: 10.1016/j.bios.2012.10.009
16. [16]
  Dirks, R. M.; Pierce, N. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004, 101, 15275. doi: 10.1073/pnas.0407024101
17. [17]
  Niu, S. Y.; Jiang, Y.; Zhang, S. S. Chem. Commun. 2010, 46, 3089. doi: 10.1039/c000166j
18. [18]
  Chen, Y.; Xu, J.; Su, J.; Xiang, Y.; Yuan, R.; Chai, Y. Q. Anal. Chem. 2012, 84, 7750. doi: 10.1021/ac3012285
19. [19]
  Ge, Z. L.; Lin, M. H.; Wang, P.; Pei, H.; Yan, J.; Shi, J. Y.; Huang, Q.; He, D. N.; Fan, C. H.; Zuo, X. L. Anal. Chem. 2014, 86, 2124. doi: 10.1021/ac4037262
20. [20]
  Yang, L.; Liu, C. H.; Ren, W.; Li, Z. P. ACS Appl. Mater. Interfaces 2012, 4, 6450. doi: 10.1021/am302268t
21. [21]
  Zhang, B.; Liu, B. Q.; Tang, D. P.; Niessner, R.; Chen, G. N.; Knopp, D. Anal. Chem. 2012, 84, 5392. doi: 10.1021/ac3009065
22. [22]
  Wang, W. J.; Li, J. J.; Rui, K.; Gai, P. P.; Zhang, J. R.; Zhu, J. J. Anal. Chem. 2015, 87, 3019. doi: 10.1021/ac504652e
23. [23]
  Eskiocak, U.; Ozkan-Ariksoysal, D.; Ozsoz, M.; Öktem, H. A. Anal. Chem. 2007, 79, 8807. doi: 10.1021/ac071014r
图 1 基于HCR的端粒酶活性检测原理

Figure 1 Schematic representation of telomerase activity assay based on HCR

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 2 DNA probe I的浓度对荧光强度的影响. DNA probe II/III的浓度为1.25 μmol/L, 其它实验条件如实验部分所述

Figure 2 Inﬂuence of concentration of DNA probe I on the fluorescence intensity. The concentration of DNA probe II/III is 1.25 μmol/L. Other conditions are performed according to the experimental procedure described in Experimental Section

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 3 DNA probe II/III的浓度对荧光强度的影响. DNA probe I的浓度为0.5 μmol/L, 其它实验条件如实验部分所述

Figure 3 Inﬂuence of concentration of probe II/III on the fluorescence intensity. The concentration of DNA probe I is 0.5 μmol/L. Other conditions are performed according to the experimental procedure described in Experimental Section

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 4 (A)不同浓度的biotin-STEP产生的荧光光谱; (B)荧光强度(I-I₀)与biotin-STEP浓度之间的线性关系

Figure 4 (A) Fluorescence spectra produced by biotin-STEP with different concentrations; (B) Relationship between the fluorescence intensity (I-I₀) of the fluorescence spectra at 523 nm and the concentration of biotin-STEP

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 5 从不同数量Hela细胞中提取的端粒酶产生的荧光光谱

Figure 5 Fluorescence spectra produced by telomerase extracted from different amount of Hela cells

下载: 全尺寸图片幻灯片