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  1    引言

  分子印迹技术是指制备对某一目标分子具有特异选择性的聚合物,该聚合物能选择性地把目标分子及其结构类似物从复杂样品中分离和富集出来,具有特异的识别性和选择性^[1],合成的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers,MIPs)具有构效预定性、特异识别性、长期稳定性和实施简便性的特点,在生物传感器、分离提取、环境监测等领域有广阔的应用前景^[2～7]. 磁性分子印迹聚合物(MMIPs)是将分子印迹技术与磁性材料相结合制备的聚合物,其具有超顺磁性,能在外加磁场的作用下将其从溶液中快速分离,兼备了磁性材料和分子印迹聚合物的共同优点^[8]. 双功能单体在已有的研究中表现出了强于单功能单体的选择性吸附能力^{[9, 10]},而本文在分子印迹技术中采用双功能单体技术,创新性的将功能单体刀豆凝集素(ConA)(植物凝集素突出的特点是它的糖结合特异性)与氨基苯硼酸(M-APBA)(苯硼酸可以与多羟基化合物通过生成五元或六元 环酯发生反应形成配合物,而且该反应可以根据pH不同结合或解离)引入分子印迹的合成中来,利用植物凝集素的特异性识别和氨基苯硼酸对糖的结合作用,成功合成了葡萄糖磁性分子印迹聚合物,再次证明了双功能单体强于单功能单体的吸附能力,并对黄酮糖苷类化合物的类特异性吸附进行了探索.

  2    结果与讨论

  2.1    双功能单体磁性分子印迹聚合物的合成及表征

  2.2    双功能单体磁性分子印迹聚合物的吸附性能研究

  2.3    双功能单体MMIPs与单功能单体MMIPs的比较

  为了验证双功能单体表现出的强于单功能单体的选择性吸附能力. 我们又分别合成了单功能单体分子印迹物,ConA-MMIPs与APBA-MMIPs.

  图 14是双功能单体MMIPs(APBA-ConA-MMIPs)与单功能单体MMIPs的吸附量及印迹因子对比图,从图中得出合成的双功能单体MMIPs在吸附量以及印迹因子均高于单功能单体MMIPs,其中以凝集素作为功能单体的MMIPs的吸附量为3.509 mg/g,3-氨基苯硼酸为功能单体的MMIPs为4.995 mg/g,它们的印迹因子分别为α_ConA为1.46,α_APBA为2.54,均低于双功能单体MMIPs的吸附量9.112 mg/g和印迹因子2.93. 这也再次证明了将双功能单体引入分子印迹中能够有效的提高分子印迹物的吸附量以及选择性. 但是我们发现凝集素作为单功能单体合成的MMIPs其印迹因子却不是我们所设想的很高,其值只有1.46,出现这种情况的原因,我们考虑可能是当凝集素作为单功能单体出现时,其识别葡萄糖的能力是很强,但是因为不存在3-氨基苯硼酸帮助其固定葡萄糖,在形成MMIPs的时候,印迹孔穴变形或者葡萄糖“丢失”,从而导致了凝集素作为单功能单体时合成的MMIPs印迹因子不高的原因.

  

  图14 APBA-ConA-MMIPs,ConA-MMIPs与APBA-MMIPs的选择吸附量

  Figure 14. Selective adsorption of APBA-ConA-MMIPs,ConA-MMIPs and APBA-MMIPs

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  2.4    类特异性吸附探索

  如果没有这样固定的印迹孔穴呢,此时,我们设想如果直接使用未添加交联剂,引发剂的Fe₃O₄@SiO₂@ NH₂@APBA-ConA磁性纳米球来进行吸附性实验,那么是不是矢车菊素3-O-葡萄糖苷就不会受到MMIPs中葡萄糖结构印迹孔穴“小”的影响呢？是不是吸附性就会提高呢？因此,我们使用Fe₃O₄@SiO₂@NH₂@ APBA-ConA磁性纳米球再一次对葡萄糖、芦丁和矢车菊素3-O-葡萄糖苷进行了吸附性实验,实验结果见图 15,此时Fe₃O₄@SiO₂@NH₂@APBA-ConA磁性纳米球对葡萄糖、芦丁和矢车菊素3-O-葡萄糖苷的吸附量则有了显著的差异,分别为5.58 mg/g、1.38 mg/g和4.88 mg/g,实验结果与我们的设想一致,由于未使用交联剂,引发剂对Fe₃O₄@SiO₂@NH₂@APBA-ConA磁性纳米球进行聚合,也就不存在印迹孔穴,使得纳米球对葡萄糖的识别吸附不用受到聚合物在结构上的束缚,充分的发挥了功能单体刀豆凝集素识别葡萄糖及其苷,3-氨基苯硼酸吸附固定葡萄糖及其葡萄糖苷的作用,然而作为二糖苷的芦丁,凝集素无法对二糖进行识别,对其吸附自然就少,这就使得吸附量产生了显著的差别.

  如图S4所示,MMIPs对芦丁的吸附量为12.65 mg/g,MNIPs为12.49 mg/g,α_芦丁=1.01,MMIPs对二糖苷无特异性吸附; MMIPs对矢车菊素3-O-葡萄糖苷的吸附量为10.859 mg/g,MNIPs为9.655 mg/g,α_{矢车菊素3-O-葡萄糖苷}=1.13,MMIPs对单糖苷具有一定的特异性吸附,这是由于刀豆凝集素对矢车菊素3-O-葡萄糖苷中的葡萄糖在结构识别作用上要明显强于芦丁中的二糖结构,说明MMIPs是能够识别矢车菊素3-O-葡萄糖苷中的葡萄糖,但是MMIPs与MNIPs的吸附量却差别不大,这可能是由于MMIPs形成后,其印迹孔穴已经固定,无法容纳相对于葡萄糖结构大的矢车菊素3-O-葡萄糖苷所造成.

  双功能单体的磁性葡萄糖分子印迹聚合物是以葡萄糖为模板分子进行合成的,其结构中具有葡萄糖结构的印迹孔穴,而 h由于糖苷类化合物中包含苷元和糖类,因此我们考虑通过识别吸附糖苷类化合物中的糖类化合物对糖苷类物质进行类特异性吸附研究,分别选取黄酮苷类中的二糖苷(芦丁)和单糖苷(矢车菊素3-O-葡萄糖苷)(结构见图S3),进行了吸附性研究.

  

  图15 双功能磁性纳米球对葡萄糖、芦丁和矢车菊素3-O-葡萄糖苷的吸附

  Figure 15. Glucose,Rutin and Cyanidin 3-O-glucoside adsorption of bifunctional magnetic nanoparticles

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  2.1.1    双功能单体磁性分子印迹聚合物的合成

  图 1为双功能单体磁性分子印迹聚合物的合成路线图,本文采用水热合成法制备超顺磁性纳米球(Fe₃O₄),采用溶胶-凝胶法制备表面包覆二氧化硅层的Fe₃O₄@SiO₂磁性纳米球,通过APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)对硅烷化的Fe₃O₄磁性纳米球进行表面改性,引入NH₂功能基团(Fe₃O₄@SiO₂@NH₂),通过DSS(双琥珀酰胺辛二酸酯钠盐)对氨基化的Fe₃O₄磁性纳米球进行表面改性,引入刀豆凝集素(Fe₃O₄@SiO₂@NH₂@ ConA),紧接着继续使用DSS对其改性引入3-氨基苯硼酸(Fe₃O₄@SiO₂@NH₂@APBA-ConA),之后将改性后的磁性纳米球加入到含有葡萄糖的溶液中,加入交联剂,引发剂最终反应得到的产物经外加磁场进行分离,加入pH5.0的磷酸盐缓冲液洗脱去除模板分子,获得的双功能单体磁性分子印迹聚合物(MMIPs) 40 ℃真空干燥. 同法不加模板分子制得磁性非印迹聚合物(MNIPs).

  A1合成法即通过二次接枝合成分子印迹聚合物,其对葡萄糖吸附良好,MMIPs吸附量接近MNIPs的3倍,说明葡萄糖分子印迹的合成是成功的,双功能单体成功接枝并发挥作用,MMIPs的特异性吸附最强,印迹因子α_葡萄糖最大; A2合成法与二次接枝合成的葡萄糖分子印迹聚合物相比,得到的分子印迹聚合物的吸附量以及印迹因子均低于二次接枝法; A3合成法中吸附量略高于二次接枝法,但印迹因子却低于二次接枝法的近三分之一,说明二次接枝法合成的聚合物吸附特异性更强,造成这样的原因可能是A2,A3合成法中将两种功能单体同时加入到反应体系,在合成过程中,功能单体处于无序的反应状态,使得氨基苯硼酸与刀豆凝集素复合功能单体在合成时能够形成的特异性结合位点变少,合成的MMIPs的选择性下降,导致了它们的印迹因子均低于二次接枝法的印迹因子. 综合考虑,最终采用二次接枝法来合成分子印迹聚合物.

  

  图1 双功能单体磁性分子印迹聚合物的合成路线图

  Figure 1. Synthetic route of dual functional monomers magnetic molecularly imprinted polymers

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  α=Q_MMIPs/Q_MNIPs,式中: α为印迹因子; Q_MMIPs为分子印迹吸附量; Q_MNIPs为非分子印迹吸附量. 印迹因子α表示分子印迹聚合物的特异选择性,其值越大,特异性越强,印迹效果越好.

  双功能单体刀豆凝集素与氨基苯硼酸的协同作用见图S1,氨基苯硼酸与刀豆凝集素的复合功能单体(APBA-ConA),在与葡萄糖结合时,首先在凝集素作用下,特异地识别葡萄糖,之后由于葡萄糖含有邻位顺式二羟基,可以与苯硼酸结合成酯,使葡萄糖与复合功能单体结合的更牢固,并且该反应可在pH调节下发生结合或解离,当pH为5时解离,pH为9时结合.

  为了找出最优合成双功能单体的磁性葡萄糖分子印迹聚合物的方法,按照双功能单体不同的接枝方式,设计了三种分子印迹的合成方法A1,A2,A3,以MMIPs的吸附能力作为判断依据,结果见图 2,从中可以得出A1合成法MMIPs对应吸附量为9.112 mg/g,印迹因子 α_葡萄糖=2.93. A2合成法MMIPs对应吸附量为7.743 mg/g,印迹因子α_葡萄糖=1.67. A3合成法MMIPs对应吸附量为9.500 mg/g,α_葡萄糖=2.02.

  

  图2 不同合成方法MMIPs吸附量及印迹因子的比较. A1: 二次接枝法; A2: 常规法; A3: 同批接枝法

  Figure 2. Adsorption quantity and imprinting factor of MMIPs by different synthetic methods. A1: step by step method; A2: routine method; A3: synchronous method

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  2.1.2    双功能单体磁性分子印迹聚合物的表征

  磁纳米球的XRD分析: 从XRD图谱中可以看出,Fe₃O₄、Fe₃O₄@SiO₂、Fe₃O₄@SiO₂@NH₂和MMIPs磁性纳米球均出现了6个典型的2θ角,它们的吸收峰分别位于30.38°,35.58°,43.14°,53.48°,57.08°和62.66°,这些角分别对应于(220),(311),(400),(422),(511),(440),这些数据与JCPDS国际衍射中心数据库的文件19-692文件相符. 由此可见,不论是接枝成功的Fe₃O₄@SiO₂、Fe₃O₄@SiO₂@NH₂,还是合成的MMIPs,纳米球的晶相都没有发生变化,保持了Fe₃O₄的尖晶石结构.

  

  图6 Fe₃O₄ (a)、Fe₃O₄@SiO₂ (b)和MMIPs (c)的热重曲线

  Figure 6. TG curves of Fe₃O₄ (a),Fe₃O₄@SiO₂ (b) and MMIPs (c)

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  表1 Fe₃O₄、Fe₃O₄@SiO₂和MMIPs的磁性能 Table1. Magnetic parameters of Fe₃O₄,Fe₃O₄@SiO₂ and MMIPs

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  Parameters	Ms/(emu•g-1)	Hci/Oe	Mr/(emu•g-1)
  Fe3O4	96.661	24.218	5.1524
  Fe3O4@SiO2	56.028	51.801	4.8445
  MMIPs	45.064	73.187	4.2167

  表1 Fe₃O₄、Fe₃O₄@SiO₂和MMIPs的磁性能
  Table1. Magnetic parameters of Fe₃O₄,Fe₃O₄@SiO₂ and MMIPs

  磁纳米球的热重分析: 分别对Fe₃O₄、Fe₃O₄@SiO₂和MMIPs进行热重分析判断磁性纳米球分子印迹聚合物是否合成成功. 热重分析是从室温开始,以20 ℃/ min的速率,升温至 800 ℃,反应一直处于氮气保护状态,图 6a Fe₃O₄热重曲线可知,Fe₃O₄质量损失2%,在温度到达120 ℃时开始失重,质量降低0.9%主要是失水造成的,在温度达到360 ℃时,质量损失1.1%,Fe₃O₄纳米球的Fe—O键键能非常大,可以承受较高的温度,所以Fe₃O₄在整个加热过程中,质量的损失率很低. 图 6b Fe₃O₄@SiO₂热重曲线可知,Fe₃O₄@SiO₂质量损失9.88%,在温度达到160 ℃时,质量损失3.66%,主要是由Fe₃O₄@SiO₂失水造成的,在温度160～250 ℃区间,Fe₃O₄@SiO₂表面硅羟基Si(OH)₄失重1.67%,Si—O键键能非常大,所以可以承受很高的温度,所以160～250 ℃区间只有少量失重,在250～800 ℃温度区间质量损失4.55%,是包裹的硅羟基层渐渐失重所致. 图 6c MMIPs热重曲线可知,当温度达到800 ℃时MMIPs质量损失11.38%,且失重是一次完成的,这是由磁纳米分子表面包裹了一层交联剂失重所造成的. 以上表明,MMIPs的合成是成功的.

  

  图5 MMIPs制备过程中样品的红外图谱. (a) Fe₃O₄; (b) Fe₃O₄@SiO₂,(c) Fe₃O₄@SiO₂@NH₂; (d) MMIPs

  Figure 5. FT-IR spectra of experimental samples. (a) Fe₃O₄; (b) Fe₃O₄@SiO₂,(c) Fe₃O₄@SiO₂@NH₂; (d) MMIPs

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  图8 磁纳米球的饱和磁强度曲线. (a) Fe₃O₄; (b) Fe₃O₄@SiO₂; (c) MMIPs

  Figure 8. Saturation magnetic intensity curves of nanoparticles. (a) Fe₃O₄; (b) Fe₃O₄@SiO₂; (c) MMIPs

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  磁纳米球的SEM,TEM分析: 通过场发射扫描电子显微镜对Fe₃O₄磁性纳米球以及MMIPs和MNIPs进行了形貌分析,从图S2中可以看到,采用水热合成法制备出的超顺磁性Fe₃O₄纳米球粒径均一,分散均匀,而且呈球状,有利于磁分离和表面接枝改性. 图 3a,图 3b可以看出通过逐步实验合成的MMIPs形态特征均一,MMIP与MNIPs的形貌以及粒径基本一致,分散性良好. 从TEM图 3d中我们能够明显的看到Fe₃O₄外面包裹着印迹层,表明我们制备的分子印迹聚合物具有核-壳表面印迹层结构,且表面印迹层的厚度约为15 nm.

  磁纳米球的磁性能分析: 从图 8可知,Fe₃O₄,Fe₃O₄@SiO₂和MMIPs的饱和磁化强度分别为96.661 emu/g,56.028 emu/g,45.064 emu/g,合成的Fe₃O₄纳米球饱和磁化强度最高,Fe₃O₄@SiO₂和MMIPs的饱和磁化强度则有所下降,原因是其表面包覆有非磁性层,对其磁响应性有一定的影响; 表 1可知,Fe₃O₄,Fe₃O₄@SiO₂和MMIPs的剩余磁化强度都很小,这是由于合成的纳米球为超顺磁性,当外加磁场消失后,纳米球本身不显磁性,这也是MMIPs能在外加磁场的作用下将其从溶液中快速分离的原因; Fe₃O₄,Fe₃O₄@SiO₂和MMIPs的矫顽力分别为24.218 Oe,51.801 Oe,73.187 Oe,其中Fe₃O₄的矫顽力最小,Fe₃O₄@SiO₂和MMIPs的矫顽力则都大于Fe₃O₄,这是因为初步合成的纳米球稳定性较差,容易聚结,当Fe₃O₄纳米球经合成反应后稳定性显著增强,矫顽力也会相应的增大. 以上分析表明,合成的纳米球不仅稳定,而且具有良好的超顺磁性,在外加磁场作用下,能够快速与溶液分离.

  

  图3 纳米球SEM图(a) MMIPs; (b) MNIPs及TEM图(c) MMIPs; (d) MMIPs

  Figure 3. SEM of nanoparticles,(a) MMIPs; (b) MNIPs; TEM of nanoparticles,(c) MMIPs; (d) MMIPs

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  磁纳米球的EDS分析: 从图中可以看到,Fe₃O₄@SiO₂的EDS中只有Fe、O、Si三种元素,并无其他杂质,证明了磁纳米球硅烷基化改性成功. 图 4b与图 4a相比,除了有Fe、O和Si元素的谱线外,又增加了B、N和S元素的谱峰,其中,B元素是接枝3-氨基苯硼酸得到的,证明双功能单体成功接枝到了磁纳米球上.

  磁纳米球的红外分析: 图 5a该物质在577 cm^-1处有明显的红外吸收峰,该吸收峰为标准的Fe—O伸缩振动峰,属于Fe₃O₄的特征红外峰,磁纳米球的合成是成功的. 图 5b 577 cm^-1的Fe₃O₄的特征吸收峰明显削弱,增加了802 cm^-1、955 cm^-1、1100 cm^-1以及1642 cm^-1和3400 cm^-1几处红外峰,802 cm^-1是Si—O—Si的弯曲振动吸收峰,955 cm^-1属于Si—O的振动特征峰,1100 cm^-1是Si—O—Si的反对称伸缩振动吸收峰,1642 cm^-1和3400 cm^-1附近是-OH伸缩振动峰,以上都是SiO₂结构的主要特征吸收峰,证明Fe₃O₄表面成功合成SiO₂层. 图 5c在1424 cm^-1处为-NH₂基团的特征吸收峰,说明Fe₃O₄@SiO₂表面接枝了氨基基团. 从图 5d可知,在3305 cm^-1附近出现N—H伸缩峰,1568 cm^-1附近出现 N—H振动峰,1345 cm^-1附近出现C—N振动峰,1380 cm^-1处的B—O伸缩振动,这些峰都表明MMIPs的每一步合成反应都是成功的.

  

  图7 纳米球X射线衍射图. (a) Fe₃O₄; (b) Fe₃O₄@SiO₂; (c) Fe₃O₄@SiO₂@NH₂; (d) MMIPs

  Figure 7. X-ray diffraction patterns of nanoparticles. (a) Fe₃O₄; (b) Fe₃O₄@SiO₂; (c) Fe₃O₄@SiO₂@NH₂; (d) MMIPs

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  图4 纳米球EDS能谱. (a) Fe₃O₄@SiO₂; (b) MMIPs

  Figure 4. The EDS spectra of nanoparticles. (a) Fe₃O₄@SiO₂; (b) MMIPs

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  2.2.1    吸附动力学研究

  通过动力学模型对数据进行拟合,研究反应的吸附机理,图 10a是按照动力学一级反应模型建立的log(Q_eq-Q_t)随时间变量t的变化关系. 可以看出,log(Q_eq-Q_t)与t拟合的点几乎呈一条直线,经线性拟合得到直线的R²=0.9732,吸附速率常数(k₁)的值为-0.01923 min^-1. 图 10b是根据动力学二级反应模型,以时间变量t为横坐标,t/Q_t为纵坐标得到的模型. 从图中可以看出,t/Q_t与t之间线性相关,经线性拟合得到直线的R²=0.9971,吸附速率常数(k₂)的值为0.10421 min^-1. 动力学一级模型主要说明吸附过程是由扩散步骤控制,是物理吸附过程. 而二级模型则假定吸附过程是由化学吸附控制的,是通过吸附剂与吸附质之间的电子共用或电子转移来实现的,为化学吸附过程. 通过比较动力学一级模型和动力学二级模型的拟合曲线的相关系数,二级模型的R²=0.9971,明显高于一级模型的R²=0.9732,因此我们可以得出: 所合成的葡萄糖分子印迹聚合物的吸附过程中动力学二级模型占主导地位,并且是整个吸附过程的限速步骤,整个过程是通过吸附剂与吸附质之间的电子共用或电子转移来实现的,是化学吸附过程^{[11, 12]}.

  由图 9的吸附量-时间曲线可见,随着时间的增长,葡萄糖分子印迹聚合物的吸附量不断增大,40 min时,MIP吸附量达到7.144 mg/g,NIP吸附量达到2.378 mg/g,80 min后变化趋于稳定. MIP的饱和吸附量是9.111 mg/g,NIP饱和吸附量在3.112 mg/g,MMIPs与MNIPs的吸附趋势类似,但是吸附量却相差很大.

  

  图9 磁纳米球吸附量-时间曲线. (a) MMIPs; (b) MNIPs

  Figure 9. Adsorption-time curves of magnetic nanoparticles. (a) MMIPs; (b) MNIPs

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  图10 动力学模型. (a) 一级模型; (b) 二级模型

  Figure 10. Kinetic model curves of MMIPs. (a) first order reaction; (b) second order reaction

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  2.2.4    重复利用率

  5次重复吸附量分别为: 9.162 mg/g,8.959 mg/g,8.959 mg/g,8.824 mg/g,8.622 mg/g,经过五次的反复吸附MMIPs的吸附量降低了5.9%,结果证明MMIPs经过反复的使用对葡萄糖仍然具有很好的吸附能力. 而吸附能力的降低主要是因为分子印迹识别过程主要是通过三维空间空隙,而分子印迹经过反复的使用后,会使这些空隙阻塞,造成吸附能力的降低.

  2.2.3    选择吸附性

  选择与模板分子葡萄糖结构、分子量相似的麦芽糖和鼠李糖作为竞争性吸附物质与模板分子竞争性吸附,吸附结果如图 13所示,葡萄糖分子印迹聚合物对葡萄糖(Glucose,9.112 mg/g,α_葡萄糖为2.93)吸附量最大,对麦芽糖(Maltose,7.405 mg/g,α_麦芽糖为2.63)以及鼠李糖(Rhamnose,5.435 mg/g,α_鼠李糖为2.19)的吸附量均低于葡萄糖,这是因为合成的MMIPs中存在刀豆凝集素这种能特异识别葡萄糖的功能单体发挥的作用,ConA的存在使得葡萄糖分子在与MMIPs作用时,葡萄糖首先被ConA初步识别,紧接着3-氨基苯硼酸对其进一步吸附固定,从而增大了MMIPs对葡萄糖的特异识别作用和吸附量,而因为存在3-氨基苯硼酸这样能识别邻位二羟基的功能单体,使得MMIPs对单糖类多羟基化合物都能有一个相对高于MNIPs的吸附量. MNIPs对三种单糖的吸附量非常接近,这是因为在不添加模板分子合成的MNIPs中没有与它们结合的特异结构位点.

  

  图13 MMIPs和MNIPs的选择吸附量

  Figure 13. Selective adsorption of MMIPs and MNIPs

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  2.2.2    吸附热力学研究

  Langmuir模型代表吸附剂的表面被单分子覆盖,同时它还假定该吸附剂结构是均匀的,所有的吸附位点都是相同的并且能量守恒^[13]. 以1/C_eq为横坐标,1/Q_eq为纵坐标得到图 12a. 从图中可以看出随着1/C_eq值的增大,1/Q_eq的值也在逐渐升高,二者接近线性关系. 经过线性拟合,其线性回归方程为y=1.60574x+0.06701,R²为0.98174,其平衡解离常数b=4.173×10^-4 mol/L,最大吸附量Q_m=14.923 mg/g. Freundlich 模型建立在假设物质表面是不均匀的基础上^[14]. 以logC_e为横坐标,logQ_eq为纵坐标得到图 12b. 经线性拟合得到回归方程为y=0.53525x+0.10744,R²为0.92358. 通过比较两种模型可知Langmuir 模型对我们合成的葡萄糖分子印迹聚合物有更好的拟合,即双功能单体的磁性葡萄糖分子印迹聚合物的吸附过程是单分子层吸附,并且它的结构是均一的.

  由图 11吸附等温曲线中可以看出,在0～40 mg/L的葡萄糖浓度范围内,MMIPs的吸附量随葡萄糖浓度的升高而不断增加,当高于40 mg/L时吸附趋于平衡,吸附变缓,MNIPs的吸附趋势类似,但是在整个吸附过程中,MMIPs对葡萄糖的吸附能力明显高于MNIPs,这表明MMIPs对葡萄糖有非常强的吸附能力,双功能单体的磁性葡萄糖分子印迹聚合物的合成是成功的.

  

  图11 MMIPs和MNIPs对葡萄糖的吸附等温线. (a) MMIPs; (b) MNIPs

  Figure 11. Adsorption isotherms of MMIPs and MNIPs. (a) MMIPs; (b) MNIPs

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  图12 热力学模型. (a) Langmuir模型; (b) Freundlich模型

  Figure 12. Thermodynamic model curves of MMIPs. (a) Langmuir model; (b) Freundlich model

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  3    结论

  本文选择双功能单体刀豆凝集素和3-氨基苯硼酸,刀豆凝集素对葡萄糖具有良好的识别特异性,但较弱的结合力是限制点,3-氨基苯硼酸化合物能够和顺式二羟基发生成酯反应,二者结合起来共同作用,取长补短. 既有了吸附特异性,又能增大吸附量,同时能够在pH调节下控制反应,方便印迹分子的洗脱,因此设计合成了对葡萄糖有特异性吸附能力的双功能单体磁性分子印迹聚合物,该聚合物基于超顺磁性的纳米球作为载体,所以能够快速与溶液分离,操作简单方便,采用双功能单体进行修饰磁性纳米球得到的聚合物不仅特异识别强,而且吸附量高. 吸附动力学研究表明MMIPs吸附为化学吸附过程,热力学研究表明吸附过程是单分子层吸附,并且它的结构是均一的. 此外由于不同植物凝集素能与不同的单糖进行特异识别作用,可以改变双功能单体中植物凝集素的种类,合成一系列能够特异吸附不同种单糖的双功能单体磁性分子印迹聚合物,该聚合物不仅能用于单糖的检测与纯化,对其类特异性识别吸附的探索使得合成的磁性纳米球还可以应用于富含糖苷类化合物的提取与分离.

  4    实验部分

  4.1    双功能单体磁性分子印迹聚合物的合成

  常规方法葡萄糖分子印迹聚合物的合成实验A2: 氨基化纳米球15 mg DSS活化,功能单体ConA 10 mg与DSS 15 mg溶解于5 mL pH9.0的磷酸盐缓冲液中活化3 h,加入APBA 5 mg ,4 ℃混合震荡12 h,同5 mL葡萄糖溶液,40 ℃混合陈化1 h之后,加入40 mg Fe₃O₄@SiO₂@NH₂,5 mL MBA(40 mg/mL)震荡2 h,1 mL APS(22.82 mg/mL),4 mL缓冲溶液,60 ℃震荡12 h,得到产物经外加磁场进行分离,加入20 mL pH5.0的磷酸盐缓冲液洗脱去除模板分子,最后将获得的双功能单体磁性分子印迹聚合物40 ℃真空干燥24 h. 同法不加模板分子制得磁性非印迹聚合物MNIPs.

  二次接枝法葡萄糖分子印迹聚合物的合成实验A1: 称取13.5 g的FeCl₃•6H₂O,同500 mL乙二醇混合,超声溶解,加入36 g无水乙酸钠,在300 r/min下机械搅拌30 min,转入不锈钢反应釜中,100 r/min、200 ℃,反应12 h^[15]. 外加磁场作用下收集合成的Fe₃O₄,先后用95%乙醇和去离子水各洗涤三次,之后依次加入2 mol/L的盐酸,0.5 mol/L的柠檬酸三钠溶液,反应20 min,超声下混合改性,真空干燥得Fe₃O₄,取0.4 g Fe₃O₄,50 mL异丙醇和4 mL双蒸水,超声混匀,之后加入5 mL氨水和1 mL正硅酸乙酯(TEOS),300 r/min转速下搅拌反应12 h,洗涤,制得超顺磁性Fe₃O₄@SiO₂^[16],取0.5 g Fe₃O₄@SiO₂,240 mL无水甲苯,超声混匀,加入APTES 10 mL,氮气保护,于室温300 r/min,搅拌反应12 h,洗涤,制得氨基改性的磁纳米球Fe₃O₄@SiO₂@NH₂^[17],取40 mg Fe₃O₄@SiO₂@NH₂,5 mL的50 mmol/L Na₂HPO₃缓冲液,加入15 mg DSS于4 ℃微量震荡器混合震荡6 h,洗掉多余的DSS,加入10 mg的刀豆凝集素,4 ℃混合震荡12 h,洗掉多余凝集素,45 ℃真空干燥,得到Fe₃O₄@SiO₂@NH₂@ConA^[18]. 取40 mg Fe₃O₄@SiO₂@ NH₂@ConA,5 mL的Na₂HPO₃缓冲液,加入15 mg DSS于4 ℃微量震荡器混合震荡6 h,加入5 mg的APBA(3-氨基苯硼酸),4 ℃震荡反应1 h后,加入乙醇胺1 mL,4 ℃混合震荡12 h,洗脱目标产物,真空45 ℃干燥,得到Fe₃O₄@SiO₂@NH₂@APBA-ConA^[18]. 取40 mg Fe₃O₄@SiO₂@NH₂@APBA-ConA,5 mL的1 mg/mL葡萄糖溶液,于40 ℃震荡1 h,加入5 mL交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(40 mg/mL)室温震荡2 h,最后加入1 mL引发剂过硫酸铵(22.82 mg/mL),9 mL的pH9.0缓冲溶液,氮气保护,60 ℃震荡12 h^[19～21],得到产物经外加磁场进行分离,加入20 mL pH5.0的磷酸盐缓冲液洗脱去除模板分子,最后将获得的双功能单体磁性分子印迹聚合物40 ℃真空干燥24 h. 同法不加模板分子制得磁性非印迹聚合物MNIPs.

  同批接枝葡萄糖分子印迹聚合物的合成实验A3: 将二次接枝法中分次接枝的实验步骤改为同时加入凝集素与苯硼酸进行合成即可.

  4.2    双功能单体磁性分子印迹聚合物的吸附性能研究

  4.3    双功能单体MMIPs与单功能单体MMIPs的比较

  单功能单体分子印迹聚合物的合成方法同4.1节方法,在反应进行到接枝一个功能单体为止,此时对接枝了一种功能单体的磁纳米球进行聚合反应,即得到了凝集素-MMIPs和MNIPs与3-氨基苯硼酸-MMIPs和MNIPs(需要注意的是合成3-氨基苯硼酸-MMIPs时不需要加入交联剂).

  分别测定凝集素和3-氨基苯硼酸作为单功能单体分子印迹物的吸附量(测定方法与双功能单体测定一致),与双功能单体分子印迹物进行对比.

  4.4    葡萄糖双功能磁性单体分子印迹聚合物的类特异性吸附探索

  40 mg的MMIPs和MNIPs分别放入到浓度为40 mg/L的芦丁和矢车菊素3-O-葡萄糖苷溶液中,振荡12 h,分离样品,取上清液测芦丁和矢车菊素3-O-葡萄糖苷的含量.

  4.2.4    吸附热力学模型

  见支持信息吸附热力学模型分析.

  4.2.3    吸附等温线

  将40 mg的MMIPs与MNIPs分别加入到含有5、10、15、20、25、30、35、40、45和50 mg/L的葡萄糖磷酸盐缓冲溶液中(pH 9.0),混匀后静止12 h,在外加磁场作用下分离样品,取1 mL上清液用苯酚-硫酸法测定吸附后糖溶液的浓度. 根据公式(S4)计算出MMIPs和MNIPs在不同浓度葡萄糖溶液中的吸附量,做出对应的吸附等温曲线.

  4.2.5    吸附选择性

  将40 mg的MMIPs和MNIPs分别放入到浓度为40 mg/L的葡萄糖、鼠李糖和麦芽糖溶液中,在回旋式振荡器上振荡12 h,分离样品,用苯酚硫酸法测定溶液中葡萄糖、鼠李糖和麦芽糖的平衡浓度.

  4.2.1    吸附量-时间曲线

  分别将40 mg的MMIPs和MNIPs加入到20 mL浓度为40 mg/L的葡萄糖磷酸盐缓冲溶液中(pH 9.0),振荡混匀. 振荡过程中分别在5、10、15、20、30、40、60、80、120、150、180 min不同时间间隔内磁性分离沉降,取1 mL上清液,用苯酚-硫酸法测定不同吸附时间后上清液中葡萄糖溶液的浓度. 根据公式(S1)计算出MMIPs和MNIPs在不同时间内的葡萄糖吸附量.

  4.2.6    MMIPs的重复利用率

  对已制备的双功能单体磁性分子印迹聚合物反复进行吸附-洗脱,检测其对模板分子的吸附量变化情况,试验重复5次.

  4.2.2    吸附动力学模型分析

  见支持信息吸附动力学模型分析.

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  图 1  双功能单体磁性分子印迹聚合物的合成路线图

  Figure 1  Synthetic route of dual functional monomers magnetic molecularly imprinted polymers

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  图 2  不同合成方法MMIPs吸附量及印迹因子的比较. A1: 二次接枝法; A2: 常规法; A3: 同批接枝法

  Figure 2  Adsorption quantity and imprinting factor of MMIPs by different synthetic methods. A1: step by step method; A2: routine method; A3: synchronous method

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  图 3  纳米球SEM图(a) MMIPs; (b) MNIPs及TEM图(c) MMIPs; (d) MMIPs

  Figure 3  SEM of nanoparticles,(a) MMIPs; (b) MNIPs; TEM of nanoparticles,(c) MMIPs; (d) MMIPs

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  图 4  纳米球EDS能谱. (a) Fe₃O₄@SiO₂; (b) MMIPs

  Figure 4  The EDS spectra of nanoparticles. (a) Fe₃O₄@SiO₂; (b) MMIPs

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  图 5  MMIPs制备过程中样品的红外图谱. (a) Fe₃O₄; (b) Fe₃O₄@SiO₂,(c) Fe₃O₄@SiO₂@NH₂; (d) MMIPs

  Figure 5  FT-IR spectra of experimental samples. (a) Fe₃O₄; (b) Fe₃O₄@SiO₂,(c) Fe₃O₄@SiO₂@NH₂; (d) MMIPs

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  图 6  Fe₃O₄ (a)、Fe₃O₄@SiO₂ (b)和MMIPs (c)的热重曲线

  Figure 6  TG curves of Fe₃O₄ (a),Fe₃O₄@SiO₂ (b) and MMIPs (c)

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  图 7  纳米球X射线衍射图. (a) Fe₃O₄; (b) Fe₃O₄@SiO₂; (c) Fe₃O₄@SiO₂@NH₂; (d) MMIPs

  Figure 7  X-ray diffraction patterns of nanoparticles. (a) Fe₃O₄; (b) Fe₃O₄@SiO₂; (c) Fe₃O₄@SiO₂@NH₂; (d) MMIPs

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  图 8  磁纳米球的饱和磁强度曲线. (a) Fe₃O₄; (b) Fe₃O₄@SiO₂; (c) MMIPs

  Figure 8  Saturation magnetic intensity curves of nanoparticles. (a) Fe₃O₄; (b) Fe₃O₄@SiO₂; (c) MMIPs

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  图 9  磁纳米球吸附量-时间曲线. (a) MMIPs; (b) MNIPs

  Figure 9  Adsorption-time curves of magnetic nanoparticles. (a) MMIPs; (b) MNIPs

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  图 10  动力学模型. (a) 一级模型; (b) 二级模型

  Figure 10  Kinetic model curves of MMIPs. (a) first order reaction; (b) second order reaction

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  图 11  MMIPs和MNIPs对葡萄糖的吸附等温线. (a) MMIPs; (b) MNIPs

  Figure 11  Adsorption isotherms of MMIPs and MNIPs. (a) MMIPs; (b) MNIPs

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  图 12  热力学模型. (a) Langmuir模型; (b) Freundlich模型

  Figure 12  Thermodynamic model curves of MMIPs. (a) Langmuir model; (b) Freundlich model

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  图 13  MMIPs和MNIPs的选择吸附量

  Figure 13  Selective adsorption of MMIPs and MNIPs

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  图 14  APBA-ConA-MMIPs,ConA-MMIPs与APBA-MMIPs的选择吸附量

  Figure 14  Selective adsorption of APBA-ConA-MMIPs,ConA-MMIPs and APBA-MMIPs

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  图 15  双功能磁性纳米球对葡萄糖、芦丁和矢车菊素3-O-葡萄糖苷的吸附

  Figure 15  Glucose,Rutin and Cyanidin 3-O-glucoside adsorption of bifunctional magnetic nanoparticles

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  表 1  Fe₃O₄、Fe₃O₄@SiO₂和MMIPs的磁性能

  Table 1.  Magnetic parameters of Fe₃O₄,Fe₃O₄@SiO₂ and MMIPs

  Parameters	Ms/(emu•g-1)	Hci/Oe	Mr/(emu•g-1)
  Fe3O4	96.661	24.218	5.1524
  Fe3O4@SiO2	56.028	51.801	4.8445
  MMIPs	45.064	73.187	4.2167

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