铁掺杂的聚2-硝基-1, 4-苯二胺纳米球的制备及在光热/光动力/化学动力学肿瘤治疗中的应用

周莹 刘赛男 蔡砺寒 张健夫 逄茂林

引用本文: 周莹, 刘赛男, 蔡砺寒, 张健夫, 逄茂林. 铁掺杂的聚2-硝基-1, 4-苯二胺纳米球的制备及在光热/光动力/化学动力学肿瘤治疗中的应用[J]. 应用化学, 2021, 38(2): 181-187. doi: 10.19894/j.issn.1000-0518.200266 shu
Citation:  Ying ZHOU, Sai-Nan LIU, Li-Han CAI, Jian-Fu ZHANG, Mao-Lin PANG. Ion-doped Poly(2-nitro-1, 4-phenylenediamine) Nanospheres for Synergistic Photo- and Chemo-Dynamic Therapy[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2021, 38(2): 181-187. doi: 10.19894/j.issn.1000-0518.200266 shu

铁掺杂的聚2-硝基-1, 4-苯二胺纳米球的制备及在光热/光动力/化学动力学肿瘤治疗中的应用

    通讯作者: 张健夫, E-mail: zhangjianfu@cust.edu.cn; 逄茂林, E-mail: mlpang@ciac.ac.cn
  • 基金项目:

    国家自然科学基金 21471145

    吉林省科技发展规划项目 20170101179JC

    中科院“百人计划” 

摘要: 肿瘤微环境(TME)的复杂性,使得单一治疗方式很难实现完全治愈。为此,构建了一种负载吲哚菁绿(ICG)的铁掺杂的聚2-硝基-1,4-苯二胺多功能纳米球Fe-PNPD-ICG(FPIs),用于光热(PTT)/光动力(PDT)/化学动力学(CDT)的联合治疗。在808 nm激光器照射下,ICG作为光敏剂可以产生单线态氧,铁掺杂的聚2-硝基-1,4-苯二胺纳米球作为光热剂具有36.65%的光热转换效率。FPIs一旦内化到肿瘤内,由Fe3+/Fe2+转化引发Fenton反应产生[DK1]·OH实现化学动力学治疗,反应过程中可以清除TME中过表达的谷胱甘肽(GSH),从而降低肿瘤中的抗氧化能力。同时,产生的氧气可以改善TME中乏氧情况,增强PDT的治疗效果。因此,FPIs是PTT/PDT/CDT联合治疗的一种理想材料,在肿瘤治疗中具有潜在的应用前景。

English

  • 目前,癌症是对人类健康危害最大的疾病之一[1]。常见的治疗方法如手术、化疗和放疗等因具有副作用或全身毒性而受到限制[2]。光热疗法(PTT)、光动力疗法(PDT)和化学动力学疗法(CDT)作为新兴的治疗方法,因其侵袭性小、毒性低和选择性高等优点引起了人们广泛的重视[3]。PTT是由近红外光触发的一种治疗方法,可以诱导光热转换剂将光能转化为热能,从而用于肿瘤消融[4]。PDT通过光激发激活光敏剂产生活性氧(ROS)[5],而CDT则通过TME中的内源性化学能诱导ROS的产生来抑制肿瘤生长[6]。由于每种治疗方法固有的缺陷,从而导致单一的治疗方法很难完全抑制肿瘤的生长[7]。因此,通过联合治疗的方法可以克服单一治疗手段的不足,从而大大增强肿瘤治疗效果。

    吲哚菁绿(ICG)是美国食品和药物管理局(FDA)批准可以用于临床的有机小分子,也是一种理想的光敏剂[8],然而ICG分子易团聚且在体内的滞留时间较短。为了克服这些缺点,人们通常将ICG分子负载到纳米材料中以提高治疗效果。本研究中,在室温条件下制备了铁掺杂的聚2-硝基-1, 4-苯二胺纳米球(Fe-PNPD),然后通过静电相互作用,将ICG与Fe-PNPD复合,制备了FPIs纳米球。FPIs被肿瘤细胞摄取后,在808 nm激光器的照射下,Fe-PNPD和ICG分别实现了PTT和PDT治疗,随后Fe3+的释放进一步诱导Fenton反应的发生,从而产生·OH。此外,这一过程中产生的O2还可以改善乏氧情况,增强PDT治疗效果。最终细胞和动物实验表明FPIs可以有效地杀死癌细胞和抑制肿瘤生长(图 1A)。

    图 1

    图 1.  FPIs的(A) FPIs的合成以及应用示意图; (B) 扫描电子显微镜照片; (C) 透射电子显微镜照片; (D) 元素分布图; (E) Fe-PNPD、ICG和FPIs的UV-Vis谱图; (F) Fe-PNPD和FPIs的红外光谱图
    Figure 1.  (A) Illustration of the synthesis and application of FPIs. (B) SEM, (C) TEM images, and (D) the elemental mapping results of FPIs. (E) UV-Vis spectra of Fe-PNPD, IGG and FPIs. (F) FT-IR spectra of Fe-PNPD and FPIs

    FEI Tecnai G2 F20型透射电子显微镜(TEM,荷兰FEI公司); U-3100型紫外可见光光谱仪(UV-Vis,日本Hitachi公司); F-7000型荧光光谱仪(日本Hitachi公司); Nikon Ti-S型倒置荧光显微镜(日本Nikon公司);M630型多功能酶标仪(美Hercules公司);MCO-20AIC型CO2培养箱(中国Sanyo公司);Bruker D8型X射线粉末衍射仪(德国Bruker AXS公司);S-4800型场发射扫描电子显微镜(FE-SEM,日本Hitachi公司);Vertex 70型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR, 美国赛默飞公司);FLIR-T62101型红外热像仪(日本Hitachi公司);K98D08-30W型808 nm激光器(日本Hitachi公司);EMXnano型电子自旋共振(EPR, 德国Bruker公司)。

    氯化铁(FeCl3)购自阿拉丁试剂有限公司,分析纯;2-硝基-1,4-苯二胺(NPD,C6H7N3O2)购自阿拉丁试剂有限公司,分析纯;甲醇(Methanol)和二甲基亚砜(DMSO)购自北京化工厂有限公司,分析纯;吲哚菁绿(ICG)购于阿拉丁有限公司;1, 3-二苯基异苯并呋喃(DPBF, 97%)购于Aldrich公司;3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT, >97.0%)、4, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI, >98.0%)和2′, 7′-二氯二氢荧光素二乙酯(DCFH-DA, >97.0%)购于自阿拉丁试剂有限公司;海拉细胞(HeLa)和小鼠成纤维细胞(L929)购于中国科学院生物化学和细胞生物学研究所;雌性Balb/c小鼠(19~22 g)购于吉林大学实验动物中心。

    1.2.1   Fe-PNPD的合成

    将3 mg(0.02 mmol)2-硝基-1, 4-苯二胺(NPD)和0.03 mL(9.248 mmol)FeCl3溶解在1 mL甲醇和1 mL去离子水的混合溶液中,室温搅拌8 h后,离心收集产物(8000 r/min,2 min),随后用乙醇洗涤3次。

    1.2.2   吲哚菁绿的负载

    2 mL Fe-PNPD(1 mg/mL)和10 mL ICG水溶液(1 mg/mL)混合后室温搅拌24 h。离心收集产物(9000 r/min,3 min),用蒸馏水洗涤至上清液澄清,产物记为FPIs。

    1.2.3   Fe-PNPD的光热转化效率

    用808 nm激光器(1.56 W/cm2)照射Fe-PNPD水溶液10 min,自然冷却至室温。在整个过程中,每隔15 s用带热电偶探头的温度计监测温度,通过式(1)计算光热转化效率:

    $ \eta = \frac{{hs\left( {{T_{\max }} - {T_{{\rm{sur}}}}} \right) - {Q_{{\rm{Dis}}}}}}{{I\left( {1 - {{10}^{ - {A_{808}}}}} \right)}} $

    (1)

    式中,h是热转换系数(W/(cm2·K)),S是容器的表面积(cm2),Tmax是激光照射出现最高的温度(K),Tsur是室温(K),QDis是散热的热量(W),I是808 nm激发功率(1.56 W/cm2),A808是Fe-PNPD溶液在808 nm处的吸收强度。hS的值可以通过式(2)计算:

    $ hS = \frac{{{m_{\rm{d}}}{C_{\rm{d}}}}}{{{\tau _{\rm{s}}}}} $

    (2)

    式中,mdCd分别是Fe-PNPD水溶液的质量(1 g)和热容(4.2 J/g)。τs是样品的时间常数。

    1.2.4   细胞内吞

    将HeLa细胞以每孔0.8×105的细胞密度接种于6孔板中,培养24 h后加入FPIs纳米粒子(100 μg/mL)分别共孵育1、3和6 h后,用DAPI染细胞核,在荧光显微镜下成像。

    1.2.5   活性氧的测定

    用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)探针测定细胞外ROS的产生。在2 mL FPIs水溶液中加入DPBF的DMSO溶液(10 μL, 10 mg/mL),然后用808 nm的近红外激光器照射不同的时间(0、3、6、9和12 min)。用UV-Vis光谱检测了DPBF特征吸收峰。

    在检测细胞内ROS的生成中,以2′,7′-二氯二乙酸酯(DCFH-DA)为ROS探针。将Hela细胞以每孔0.8×105细胞密度接种于6孔培养板中,分为3组:(A)808 nm、(B)FPIs、(C)FPIs+808 nm。在黑暗中培养6 h后,更换新鲜培养液,用808 nm激光器(1.56 W/cm2)照射5 min。然后,在每个孔中加入ROS探针,混合物在37 ℃下孵育20 min后,用PBS洗涤3次。用倒置荧光显微镜系统(Nikon Ti-S)常规检测485 nm激发和545 nm发射。

    1.2.6   细胞毒性试验

    利用典型的MTT实验进行细胞毒性的研究。将HeLa细胞(6000~7000/孔)接种在96孔板中,培养过夜后,吸除原培养液,将含有不同浓度的FPIs溶解在培养液中,再加到96孔板中。4 h后用不同的治疗方法进行处理,再继续培养24 h。培养结束后,向96孔板中加入MTT溶液(20 μL,5 mg/mL),继续培养4 h后,将原培养液移除,每孔加150 μL的DMSO,避光轻微震荡,其细胞存活率可以通过在490 nm处的吸光度确定。

    1.2.7   动物实验

    选取48只健康的雌性BALB/c(每只约20 g),购自吉林大学实验动物中心(长春),所有小鼠均采用吉林大学动物保护与利用机构委员会批准的规程进行处理。荷瘤后,当小鼠肿瘤体积达到100 mm3时,将小鼠随机分成5组(n=6): 1)生理盐水(0.1 mL);2)生理盐水(0.1 mL)+808 nm;3)FPIs纳米颗粒;4)Fe-PNPD+808 nm;5)FPIs+808 nm。每两天测量一次肿瘤的大小,同时记录体重。肿瘤体积用L×W2/2估计,LW分别表示肿瘤的长度和宽度。在第一次接种治疗前,通过除以初始肿瘤大小来计算相对肿瘤体积。

    1.2.8   组织学分析

    苏木精伊红(H & E)染色,取小鼠心、肝、脾、肺、肾和瘤用福尔马林进行固定,常规石蜡切片,H & E染色进行组织学分析,在荧光显微镜下观察。

    Fe-PNPD纳米球尺寸约为150 nm(图 1B-1C和辅助材料图S1)。元素分布图(HAADF-STEM-EDS)中C、N、O、Fe和Cl元素的均匀分布(图 1D)以及XPS都证明了Fe-PNPD中有Fe3+的存在(见辅助材料图S2)。XRD结果证明Fe-PNPD是无定型的非晶纳米球(见辅助材料图S3)。

    图 1E1F所示,FPIs纳米复合材料的UV-Vis和FT-IR谱图中均包含ICG的特征峰。此外,Zeta电势也从-14.61 mV降低到-27.32 mV(见辅助材料图S4),以上结果均证明了ICG负载成功。FPIs复合材料分散到DMEM、DMEM+FBS、PBS、FBS、50%FBS和水中,静置24 h后,仍然可以很好地保持分散性和稳定性(见辅助材料图S5)。

    EPR显示FPIs与H2O2混合后的产物呈现出典型的·OH四线特征光谱(1∶2∶2∶1),证明FPIs可以有效地催化H2O2产生·OH(见辅助材料图S6)。利用亚甲基蓝分光光度法也进一步验证了FPIs能够产生·OH(图 2A2B)。UV-Vis表明随着FPIs浓度的增加,GSH在412 nm处吸收强度逐渐降低(图 2C),表明GSH被迅速降解为氧化性谷胱甘肽(GSSG),减轻了细胞抗氧化剂的功能,从而增强了PDT和CDT的治疗效果。溶解氧(DO)含量的测定证明FPIs可以催化H2O2产生O2(图 2D)。

    图 2

    图 2.  (A) 固定FPIs的浓度(100 μg/mL)在不同时间(10、20、30、40 min)对MB的降解;(B)固定反应时间(20 min)在不同浓度(12.5、25、50、100 μg/mL)下FPIs对MB的降解;(C)不同FPIs浓度下对谷胱甘肽的消耗;(D)FPIs在加入H2O2后产生的氧气;(E)FPIs水溶液的DPBF随时间降解曲线;(F)不同浓度的Fe-PNPD溶液的温度变化曲线
    Figure 2.  (A)MB degradation by the same concentration of FPIs at different time. (B)MB degradation by the different concentration of FPIs under same time. (C)GSH (100 μmol/L) consumption change by the oxidation of different concentrations of FPIs. (D)O2 generation curves for FPIs aqueous solution with or without H2O2 addition. (E)Time dependent DPBF degradation curves for FPIs aqueous solution under the 650 nm. (F)Temperature variation curves of Fe-PNPD under laser irradiation (1.56 W/cm2)

    紧接着以DPBF为指示剂来检测FPIs产生1O2的情况(见图 2E和辅助材料图S7),向FPIs水溶液中加入DPBF并用808 nm激光照射(1.56 W/cm2),随着时间的延长,DPBF在417 nm处的吸收峰逐渐下降,说明FPIs能够有效地产生1O2。随后,用DCFH-DA为探针来进一步检测FPIs在HeLa细胞中产生ROS的情况。与其它两个组相比,FPIs+808 nm组表现出了明显的绿色荧光信号(见辅助材料图S8),从而表明FPIs纳米粒子在细胞内也可以有效地产生ROS。

    图 2F所示,在808 nm激光照射下,随着Fe-PNPD浓度的增加温度逐渐增加。当浓度达到62.5 μg/mL时,温度可以升高到46 ℃,证明Fe-PNPD具有良好的光热效果。经过5次循环照射后,Fe-PNPD(100 μg/mL)光热效果几乎没有变化表明了其较好的光稳定性(图S9)。计算表明Fe-PNPD的光热转换效率为36.65%(见辅助材料图S10、S11和表S1)。

    2.3.1   FPIs纳米粒子的摄取

    为观察HeLa细胞对FPIs的摄取情况,将FPIs与HeLa细胞分别共孵育1、3和6 h。如图 3A所示,随着时间的延长,红色荧光强度增强并在细胞核周围逐渐聚集,说明FPIs可通过内吞作用进入细胞。

    图 3

    图 3.  (A) FPIs的内吞实验。(B)FPIs对L929细胞的生物相容性实验。(C)HeLa细胞的体外毒性实验
    Figure 3.  (A)Fluorescence images of the endocytosis process for FPIs NPs. (B)Biocompatibility test of FPIs NPs against L929 cells. (C)In vitro cytotoxicity test for FPIs NPs against HeLa cells with different treatments
    2.3.2   FPIs的体外细胞毒性实验

    MTT实验结果显示将不同浓度的FPIs与L929细胞共同孵育24 h后,细胞存活率均可达80%以上,表明FPIs具有良好的生物相容性(图 3B3C)。细胞毒性测试显示FPIs通过CDT作用也可以引起细胞凋亡。在PDT和PTT的共同作用下,当用808 nm激光照射FPIs时(1.56 W/cm2,5 min),HeLa细胞存活率呈现更明显的下降趋势。当质量浓度达到60 μg/mL时,细胞存活率仅为20%左右。以上实验表明FPIs对肿瘤细胞具有良好的杀伤效果。

    2.3.3   细胞内GSH的消耗

    将HeLa细胞和FPIs纳米粒子共培养24 h后,检测到细胞内的GSH急剧降低(见辅助材料图S12),说明FPIs可以通过破坏细胞抗氧化剂防御系统(ADS)来改善CDT的治疗效果。

    首先,在BALB/c小鼠左侧腋窝下建立肿瘤模型,当肿瘤体积达到100 cm3后随机分组治疗(n=6):PBS、PBS+808 nm、FPIs、Fe-PNPD+808 nm、FPIs+808 nm。如图 4A所示,治疗过程中小鼠的体重几乎不变,说明材料具有较好的生物相容性。如图 4B4C所示,PBS组、PBS+808 nm组和FPIs组的肿瘤体积逐渐增大,而Fe-PNPD+808 nm组、FPIs+808 nm组均有抑制肿瘤增长的效果,其中FPIs+808 nm达到了最好的治疗效果。从H&E切片照片(图 4D)可以看出,在FPIs+808 nm组的肿瘤里大部分癌细胞已经发生凋亡或坏死。同时,未治疗和治疗组中小鼠的心、肝、脾、肺、肾均没有受到任何损伤(如图S13),进一步表明FPIs具有较好的生物相容性和抑制肿瘤生长的能力。

    图 4

    图 4.  不同处理条件下的(A)小鼠体重变化情况,(B)小鼠肿瘤体积变化情况。(C)小鼠治疗14天的肿瘤照片及(D)切片
    Figure 4.  (A) Body weight and (B) tumor volume change curves of mice with different treatments over 14 days. (C) Representative photographs and (D) H & E staining images of tumors for all the groups at the last day of treatment

    以铁掺杂的聚2-硝基-1, 4-苯二胺纳米球作为光热剂和载体,负载了光敏剂ICG,成功制备了具有PTT/PDT/CDT联合治疗效果的纳米体系。结果表明,FPIs纳米球可有效地引发Fenton反应,进而诱导·OH的产生。更重要的是,Fe3+/Fe2+转化的副产物O2有效地调节了肿瘤组织的缺氧状态,促进了ICG诱导的1O2的产生。共同产生的·OH和1O2放大了细胞的氧化应激效应。同时Fe-PNPD纳米球在808 nm近红外光照射下具有较强的光热效果,进一步增强了肿瘤抑制效果。

    辅助材料(Supporting Information)[其它扫描电子显微镜图像、UV-Vis图谱、X射线光电子能谱图、电子自旋共振光谱图、Zeta-电势图、活性氧检测试验、切片和细胞图像等]可以免费从本刊网站(http://yyhx.ciac.jl.cn/)下载。


    1. [1]

      CHEN G Y, ROY I, YANG C H. Nanochemistry and nanomedicine for nanoparticle-based diagnostics and therapy[J]. Chem Rev, 2016, 116:  2826-2885. doi: 10.1021/acs.chemrev.5b00148

    2. [2]

      SINGHAL S, NIE S M, WANG M. Nanotechnology applications in surgical oncology[J]. Annu Rev Med, 2010, 61:  359-373. doi: 10.1146/annurev.med.60.052907.094936

    3. [3]

      HU C L, CAI L H, LIU S N. Copper-doped nanoscale covalent organic polymer for augmented photo/chemodynamic synergistic therapy and immunotherapy[J]. Bioconjugate Chem, 2020, 31:  1661-1670. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.0c00209

    4. [4]

      YANG K, ZHANG S A, ZHANG G X. Graphene in mice: ultrahigh in vivo tumor uptake and efficient photothermal therapy[J]. Nano Lett, 2010, 10:  3318-3323. doi: 10.1021/nl100996u

    5. [5]

      BERLANDA J, KIESSLICH T, ENGELHARDT V. Comparative in vitro study on the characteristics of different photosensitizers employed in PDT[J]. J Photochem Photobiol B, 2010, 100:  173-180. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2010.06.004

    6. [6]

      BOKARE A, CHOI W. Review of iron-free fenton-like systems for activating H2O2 in advanced oxidation processes[J]. J Hazard Mater, 2014, 275:  121-135. doi: 10.1016/j.jhazmat.2014.04.054

    7. [7]

      YU J, ZHAO F, GAO W. Magnetic reactive oxygen species nanoreactor for switchable magnetic resonance imaging guided cancer therapy based on pH-sensitive Fe5C2@Fe3O4 nanoparticles[J]. ACS Nano, 2019, 13:  10002-10014. doi: 10.1021/acsnano.9b01740

    8. [8]

      ZHU H M, CAO G D, QIANG C. Hollow ferric-tannic acid nanocapsules with sustained O2 and ROS induction for synergistic tumor therapy[J]. Biomater Sci, 2020, 8:  3844-3855. doi: 10.1039/D0BM00533A

  • 图 1  FPIs的(A) FPIs的合成以及应用示意图; (B) 扫描电子显微镜照片; (C) 透射电子显微镜照片; (D) 元素分布图; (E) Fe-PNPD、ICG和FPIs的UV-Vis谱图; (F) Fe-PNPD和FPIs的红外光谱图

    Figure 1  (A) Illustration of the synthesis and application of FPIs. (B) SEM, (C) TEM images, and (D) the elemental mapping results of FPIs. (E) UV-Vis spectra of Fe-PNPD, IGG and FPIs. (F) FT-IR spectra of Fe-PNPD and FPIs

    图 2  (A) 固定FPIs的浓度(100 μg/mL)在不同时间(10、20、30、40 min)对MB的降解;(B)固定反应时间(20 min)在不同浓度(12.5、25、50、100 μg/mL)下FPIs对MB的降解;(C)不同FPIs浓度下对谷胱甘肽的消耗;(D)FPIs在加入H2O2后产生的氧气;(E)FPIs水溶液的DPBF随时间降解曲线;(F)不同浓度的Fe-PNPD溶液的温度变化曲线

    Figure 2  (A)MB degradation by the same concentration of FPIs at different time. (B)MB degradation by the different concentration of FPIs under same time. (C)GSH (100 μmol/L) consumption change by the oxidation of different concentrations of FPIs. (D)O2 generation curves for FPIs aqueous solution with or without H2O2 addition. (E)Time dependent DPBF degradation curves for FPIs aqueous solution under the 650 nm. (F)Temperature variation curves of Fe-PNPD under laser irradiation (1.56 W/cm2)

    图 3  (A) FPIs的内吞实验。(B)FPIs对L929细胞的生物相容性实验。(C)HeLa细胞的体外毒性实验

    Figure 3  (A)Fluorescence images of the endocytosis process for FPIs NPs. (B)Biocompatibility test of FPIs NPs against L929 cells. (C)In vitro cytotoxicity test for FPIs NPs against HeLa cells with different treatments

    图 4  不同处理条件下的(A)小鼠体重变化情况,(B)小鼠肿瘤体积变化情况。(C)小鼠治疗14天的肿瘤照片及(D)切片

    Figure 4  (A) Body weight and (B) tumor volume change curves of mice with different treatments over 14 days. (C) Representative photographs and (D) H & E staining images of tumors for all the groups at the last day of treatment

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  • 发布日期:  2021-02-10
  • 收稿日期:  2020-08-31
  • 接受日期:  2020-11-04
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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