二肽类膦酸酯衍生物的合成与抗肿瘤活性

吴学姣 苟光淋 杨小兰 杨家强

引用本文: 吴学姣, 苟光淋, 杨小兰, 杨家强. 二肽类膦酸酯衍生物的合成与抗肿瘤活性[J]. 应用化学, 2021, 38(1): 36-43. doi: 10.19894/j.issn.1000-0518.200183 shu
Citation:  Xue-Jiao WU, Guang-Lin GOU, Xiao-Lan YANG, Jia-Qiang YANG. Synthesis and Antitumor Activity of Phosphonate Derivatives Containing Dipeptide[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2021, 38(1): 36-43. doi: 10.19894/j.issn.1000-0518.200183 shu

二肽类膦酸酯衍生物的合成与抗肿瘤活性

    通讯作者: 杨家强, E-mail: yjqcn@126.com
  • 基金项目:

    贵州省科技厅国际合作项目 No.G[2014]7013

摘要: 为了寻找抗肿瘤活性化合物,以前期研究的含一个氨基酸结构单元的膦酸酯衍生物为基础,设计合成了15个二肽类膦酸酯衍生物(Ⅲa-Ⅲo)。采用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)法进行体外抗肿瘤活性测试。结果表明:该类化合物对人肺癌细胞(A-549)、人胃癌细胞(SGC-7901))和人食管癌细胞(EC-109)有潜在增殖抑制作用。其中,化合物Ⅲf对A-549和EC-109的半数抑制浓度(IC50)分别为(6.9±1.2)和(6.3±1.0)μmol/L,化合物Ⅲn对SGC-7901和EC-109的IC50分别为(6.7±1.0)和(6.1±1.0)μmol/L,与对照药顺铂接近。

English

  • 肽作为生物体内重要的生理活性物质,是构成蛋白质、激素、酶及抗体等内源性物质的片段,参与多种生物化学过程[1-2]。其中,短肽类衍生物因相对分子质量小、合成工艺成熟、生物兼容性好,能特异性结合肿瘤组织,干扰肿瘤细胞信号转导,不易在体内诱发免疫应答等优点,一直是抗肿瘤药物研究的热点。自1987年二肽类氨肽酶N抑制剂乌苯美司(Ubenimex)用于临床以来[4],二肽类衍生物逐渐成为靶向抗肿瘤药物研究的热点。2003年,上市的蛋白酶体抑制剂二肽衍生物硼替佐米(Bortezomib)[5],已进入临床III期试验的血管生成抑制剂西仑吉肽(Cilengitide)[6],以及处于临床前期研究的酪丝亮肽(YSL)、酪丝缬肽(YSV),均能选择性地直接抑制肿瘤细胞,而不会杀伤正常细胞[7]。这些研究充分证实了二肽衍生物在抗肿瘤药物中发挥着重要作用[8]

    有机磷化合物由于结构多变性及生物活性的多样性(抗肿瘤[9]、抗病毒[10]、抗菌[11]和抗骨质疏松[12]等),广泛应用于药物设计及结构改造中。其中,在抗肿瘤药物方面的应用一直是研究的热点,如,早期的抗肿瘤药物环磷酰胺,以及近年新上市的唑来膦酸与阿仑膦酸。2019年,Poola等[13]运用分子对接技术,设计合成的膦酸酯衍生物对人宫颈癌(HeLa)细胞和人肝细胞癌(HepG2)等癌细胞的活性优于对照药阿霉素;2020年,Huang等[14-15]基于膦酸酯结构单元,设计合成了两类衍生物,结果显示:部分化合物对多种肿瘤细胞有明显的生长抑制作用,且无明显毒性,优于阳性药物伊立替康及阿霉素,有望成为治疗人类卵巢癌细胞的候选药物。

    前期,本课题组也设计合成了系列含一个氨基酸结构单元[16-17]及含苯丙氨酸二肽结构[18]的膦酸酯衍生物进行抗肿瘤活性研究,结果表明:1)部分化合物具有较好的活性,L-构型氨基酸衍生物较D-构型的氨基酸衍生物对所测肿瘤细胞有更好的增值抑制作用;2)大多含有氟衍生物有更优的抗肿瘤活性;3)二肽氨基酸的种类对抗肿瘤活性有较大影响,值得扩大和丰富氨基酸的种类及改变氨基酸的连接顺序,进一步结构优化。

    为了寻找抗肿瘤活性化合物,本文在前期的研究结果上,保留了该系列抗肿瘤活性化合物的结构特征,再引入不同氨基酸结构单元及活性片段,同时改变氨基酸的排列顺序,设计合成系列二肽类膦酸酯衍生物,进一步研究其抗肿瘤活性。

    图式 1

    图式 1.  目标化合物的合成路线
    Scheme 1.  Synthetic route of target compounds

    Reagents and conditions: a.Et3N; b.EDCI/HOBt; c.NaOH; d.EDCI/DMAP; e.CH3OH, CH3COCl
    Ⅲa: R=H, R1=H, R2=CH3; Ⅲb: R=2-F, R1=H, R2=CH3; Ⅲc: R=4-F, R1=H, R2=CH3; Ⅲd: R=H, R1=H, R2=2-pyrrolidinyl; Ⅲe: R=2-F, R1=H, R2=2-pyrrolidinyl; Ⅲf: R=4-F, R1=H, R2=2-pyrrolidinyl; Ⅲg: R=H, R1=H, R2=CH2Ph; Ⅲh: R=2-F, R1=H, R2=CH2Ph; Ⅲi: R=4-F, R1=H, R2=CH2Ph; Ⅲj: R=2-F, R1=CH3, R2=CH3; Ⅲk: R=4-F, R1=CH3, R2=CH3; Ⅲl: R=2-F, R1=CH3, R2=2-pyrrolidinyl; Ⅲm: R=4-F, R1=CH3, R2=2-pyrrolidinyl; Ⅲn: R=2-F, R1=CH3, R2= CH2Ph; Ⅲo: R=4-F, R1=CH3, R2= CH2Ph

    SGW X-4型显微熔点仪(上海精密科学仪器有限公司);Varian400型核磁共振仪(NMR,美国瓦里安技术公司);HP 1100型质谱仪(MS, 美国安捷伦公司);Vavio-Ⅲ型元素分析仪(德国Elementar公司);Autopol VI型旋光仪(美国鲁道夫公司);ELX800型通用酶标仪(美国BioTek公司)。

    苯甲醛、邻氟苯甲醛、对氟苯甲醛、亚磷酸二乙酯、甘氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸,L-脯氨酸、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBT)和N-甲基吗啡啉(NMM)购自百灵威化学试剂公司,均为分析纯试剂。反应溶剂需经无水处理。实验所用人肺癌细胞(A-549)、人胃癌细胞(SGC-7901))和人食管癌细胞(EC-109)购于中国科学院上海细胞库。

    中间体Ⅰ   参照文献[19]的方法合成。

    中间体Ⅱ   参照文献[20]的类似方法合成。

    化合物Ⅲa   取50 mL反应瓶,加入0.101 g(0.05 mmol)Boc-L-丙氨酰甘氨酸(Ⅱa)、0.062 g(0.05 mmol)DMAP和10 mL无水二氯甲烷,于-5~0 ℃下搅拌反应,再缓缓加入0.086 g(0.05 mmol)EDCI,反应15 min,再加入0.145 g(0.05 mmol)中间体Ⅰa,室温下反应,TLC跟踪,完毕,浓缩溶剂,柱层析分离纯化(V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶2),备用。另取一反应瓶,加入5 mL乙酸乙酯,再依次加入0.002 g(0.05 mmol)甲醇和0.004 g(0.05 mmol)乙酰氯,-5~0 ℃搅拌反应2.5 h;再取0.111 g(0.03 mmol)上述纯化物(用3 mL乙酸乙酯溶解)缓慢加入反应瓶,TLC跟踪,完毕,减压浓缩,柱层析分离纯化(V(氯仿)∶V(甲醇)=8∶1),真空干燥,得化合物Ⅲa。化合物Ⅲb-Ⅲo的合成,按照Ⅲa相同的方法制备。

    O, O′-二乙基[α-苯基-α-(L-丙氨酰-甘氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲa) 白色固体, 产率49%;mp 55~57 ℃; [α]D20+40.4(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.17(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.26(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.33(d, 3H, J=4.0 Hz, CH3), 2.13~2.19(m, 2H, NH2), 3.95~4.12(m, 4H, 2OCH2), 4.41(t, 1H, J=8.0 Hz, NCH), 5.08(t, 2H, J=8.0 Hz, NCH2), 6.41(q, 1H, J=24.0 Hz, PCH), 7.02~7.54(m, 5H, Ar—H), 8.13(s, 1H, NH); 13C NMR(CDCl3, 100 MHz), δ: 16.1, 16.2, 18.2, 42.2, 49.0, 63.3, 63.4, 73.1, 124.3, 124.5, 127.8, 127.9, 131.0, 134.5, 169.8, 171.2;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 18.8;ESI MS(m/z): 373.0[M+H]+; 元素分析理论值C16H25N2O6P: C 51.61, H 6.77, N 7.52;实际值: C 51.52, H 6.68, N 7.55。

    O, O′-二乙基[α-(2-氟苯基)-α-(L-丙氨酰-甘氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲb) 白色固体, 产率53%;mp 60~61 ℃; [α]D20+36.5(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.14(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.21(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.32(d, 3H, J=4.0 Hz, CH3), 2.08~2.15(m, 2H, NH2), 3.88~4.13(m, 4H, 2OCH2), 4.35(t, 1H, J=12.0 Hz, NCH), 5.06(t, 2H, J=8.0 Hz, NCH2), 6.48(q, 1H, J=20.0 Hz, PCH), 6.85~7.31(m, 4H, Ar—H), 8.16(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.2, 16.3, 18.3, 42.0, 49.5, 63.4, 63.5, 73.2, 115.3, 124.4, 129.1, 129.3, 130.6, 158.6, 169.6, 171.7;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 20.6;ESI MS(m/z): 391.0[M+H]+; 元素分析理论值C16H24FN2O6P: C 49.23, H 6.20, N 7.18;实际值: C 49.11, H 6.18, N 7.20。

    O, O′-二乙基[α-(4-氟苯基)-α-(L-丙氨酰-甘氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲc) 白色固体, 产率50%;mp 48~50 ℃; [α]D20+32.9(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.15(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.20(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.35(d, 3H, J=4.0 Hz, CH3), 2.15~2.23(m, 2H, NH2), 3.90~4.09(m, 4H, 2OCH2), 4.38(t, 1H, J=12.0 Hz, NCH), 5.10(t, 2H, J=12.0 Hz, NCH2), 6.45(q, 1H, J=20.0 Hz, PCH), 6.87~7.24(m, 4H, Ar—H), 8.15(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.2, 16.3, 18.3, 42.1, 49.6, 63.2, 63.3, 73.2, 115.2, 115.4, 127.3, 127.5 131.5, 160.1, 169.3, 171.1;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 18.9;ESI MS(m/z): 391.0[M+H]+; 元素分析理论值C16H24FN2O6P: C 49.23, H 6.20, N 7.18;实际值: C 49.16, H 6.13, N 7.10。

    O, O′-二乙基[α-苯基-α-(L-脯氨酰-甘氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲd) 白色固体, 产率46%;mp 69~70 ℃; [α]D20+50.3(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.13(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.18(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.62~1.66(m, 1H, NH), 1.73~1.98(m, 2H, CH2), 2.16~2.44(m, 2H, CH2), 3.06~3.17(m, 2H, CH2), 3.81~4.00(m, 4H, 2OCH2), 4.28~4.31(m, 1H, NCH), 5.27~5.29(m, 2H, NCH2), 6.05(q, 1H, J=16.0 Hz, PCH), 7.10~7.34(m, 5H, Ar—H), 8.22(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.2, 16.3, 23.8, 32.6, 37.5, 46.2, 58.7, 63.3, 63.4, 74.2, 127.0, 127.5, 128.0, 128.5, 128.7, 135.5, 169.8, 172.5;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 19.6;ESI MS(m/z): 399.0[M+H]+; 元素分析理论值C18H27N2O6P: C 54.27, H 6.83, N 7.03;实际值: C 54.30, H 6.79, N 7.08。

    O, O′-二乙基[α-(2-氟苯基)-α-(L-脯氨酰-甘氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲe) 白色固体, 产率53%;mp 82~84 ℃; [α]D20+55.5(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.16(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.22(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.66~1.70(m, 1H, NH), 1.83~1.99(m, 2H, CH2), 2.17~2.43(m, 2H, CH2), 3.08~3.18(m, 2H, CH2), 3.80~4.12(m, 4H, 2OCH2), 4.30~4.32(m, 1H, NCH), 5.25~5.28(m, 2H, NCH2), 6.16(q, 1H, J=16.0 Hz, PCH), 6.88~7.21(m, 4H, Ar—H), 8.28(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.3, 16.4, 24.2, 32.8, 38.1, 46.3, 58.8, 63.4, 63.5, 73.8, 114.7, 123.2, 127.5, 128.2, 129.1, 158.4, 169.2, 171.9;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 18.8;ESI MS(m/z): 417.0[M+H]+; 元素分析理论值C18H26FN2O6P: C 51.92, H 6.29, N 6.73;实际值: C 51.76, H 6.16, N 6.77。

    O, O′-二乙基[α-(4-氟苯基)-α-(L-脯氨酰-甘氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲf) 白色固体, 产率47%;mp 47~49 ℃; [α]D20+47.7(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.10(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.17(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.53~1.60(m, 1H, NH), 1.80~1.95(m, 2H, CH2), 2.13~2.30(m, 2H, CH2), 3.10~3.18(m, 2H, CH2), 3.79~4.06(m, 4H, 2OCH2), 4.26~4.28(m, 1H, NCH), 5.27~5.30(m, 2H, NCH2), 6.10(q, 1H, J=16.0 Hz, PCH), 6.92~7.30(m, 4H, Ar—H), 8.31(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.2, 16.3, 24.0, 32.2, 37.8, 46.5, 58.4, 63.3, 63.4, 73.6, 115.2, 115.4, 128.6, 128.8, 132.3, 159.9, 169.2, 172.2;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 17.5;ESI MS(m/z): 417.0[M+H]+; 元素分析理论值C18H26FN2O6P: C 51.92, H 6.29, N 6.73;实际值: C 51.80, H 6.22, N 6.68。

    O, O′-二乙基[α-苯基-α-(L-苯丙氨酰-甘氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲg) 无色液体, 产率39%;[α]D20+66.2(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.05(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.13(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 2.22~2.29(m, 2H, NH2), 2.96~3.06(m, 2H, PhCH2), 3.91~4.04(m, 4H, 2OCH2), 4.55~4.73(m, 1H, NCH), 4.98~5.11(m, 2H, NCH2), 6.38(q, 1H, J=16.0 Hz, PCH), 7.06~7.34(m, 10H, Ar—H), 8.20(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.2, 16.3, 39.5, 41.4, 54.0, 63.4, 63.5, 73.0, 125.8, 127.1, 127.2, 127.4, 127.5, 127.7, 128.6, 128.7, 129.5, 129.6, 134.1, 140.2, 169.8, 171.9;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 19.8;ESI MS(m/z): 449.0[M+H]+; 元素分析理论值C22H29N2O6P: C 58.92, H 6.52, N 6.25;实际值: C 58.72, H 6.60, N 6.14。

    O, O′-二乙基[α-(2-氟苯基)-α-(L-苯丙氨酰-甘氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲh) 白色固体, 产率32%;mp 82~83 ℃; [α]D20+75.3(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.07(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.14(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 2.01~2.05(m, 2H, NH2), 2.92~3.07(m, 2H, PhCH2), 3.95~4.12(m, 4H, 2OCH2), 4.41(t, 1H, J=8.0 Hz, NCH), 5.08(t, 2H, J=8.0 Hz, NCH2), 6.41(q, 1H, J=28.0 Hz, PCH), 6.88~7.54(m, 9H, Ar—H), 8.28(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.1, 16.2, 41.0, 42.2, 54.6, 63.3, 63.4, 72.2, 115.3, 124.4, 125.9, 127.5, 127.7, 127.8, 128.1, 128.2, 128.4, 129.1, 139.6, 158.6, 170.6, 171.7;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 21.2;ESI MS(m/z): 467.0[M+H]+; 元素分析理论值C22H28FN2O6P: C 56.65, H 6.05, N 6.01;实际值: C 56.83, H 6.12, N 5.92。

    O, O′-二乙基[α-(4-氟苯基)-α-(L-苯丙氨酰-甘氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲi) 无色液体, 产率31%;[α]D20+84.0(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.11(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.17(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.98~2.05(m, 2H, NH2), 2.94~3.05(m, 2H, PhCH2), 3.88~4.05(m, 4H, 2OCH2), 4.58~4.72(m, 1H, NCH), 5.06~5.10(m, 2H, NCH2), 6.42(q, 1H, J=20.0 Hz, PCH), 6.90~7.69(m, 9H, Ar—H), 8.24(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.1, 16.2, 40.6, 42.0, 54.4, 63.3, 63.4, 72.8, 115.2, 115.3, 124.5, 124.6, 127.4, 127.5, 128.7, 128.8, 129.1, 129.2, 132.6, 161.6, 170.5, 171.9;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 18.9;ESI MS(m/z): 467.0[M+H]+; 元素分析理论值C22H28FN2O6P: C 56.65, H 6.05, N 6.01;实际值: C 56.51, H 6.10, N 6.06。

    O, O′-二乙基[α-(2-氟苯基)-α-(L-丙氨酰-L-丙氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲj) 白色固体, 产率29%;mp 91~92 ℃; [α]D20+43.6(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.17(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.21(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.33(d, 3H, J=4.0 Hz, CH3), 1.40(d, 3H, J=4.0 Hz, CH3), 2.12~2.16(m, 2H, NH2), 3.92~4.10(m, 4H, 2OCH2), 4.45~4.51(m, 1H, NCH), 5.10~5.18(m, 1H, NCH), 6.44(q, 1H, J=24.0 Hz, PCH), 6.86~7.42(m, 4H, Ar—H), 8.19(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.1, 16.2, 18.2, 18.7, 49.0, 63.3, 63.4, 65.2, 115.5, 124.8, 127.3, 128.5, 129.1, 160.0, 171.0, 172.3;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 20.6;ESI MS(m/z): 405.0[M+H]+; 元素分析理论值C17H26FN2O6P: C 50.49, H 6.48, N 6.93;实际值: C 50.62, H 6.47, N 6.87。

    O, O′-二乙基[α-(4-氟苯基)-α-(L-丙氨酰-L-丙氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲk) 白色固体, 产率31%;mp 66~67 ℃; [α]D20+39.0(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.10(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.15(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.31(d, 3H, J=4.0 Hz, CH3), 1.42(d, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 2.00~2.05(m, 2H, NH2), 3.91~4.12(m, 4H, 2OCH2), 4.28~4.35(m, 1H, J=8.0 Hz, NCH), 5.01~5.09(m, 1H, J=12.0 Hz, NCH), 6.40(q, 1H, J=20.0 Hz, PCH), 6.90~7.48(m, 4H, Ar—H), 8.22(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.2, 16.3, 18.5, 19.0, 48.6, 63.2, 63.3, 65.6, 115.2, 115.3, 128.6, 128.8, 130.0, 162.3, 171.1, 171.8;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 21.1;ESI MS(m/z): 405.0[M+H]+; Anal. calcd for C17H26FN2O6P: C 50.49, H 6.48, N 6.93;实际值: C 50.40, H 6.57, N 6.90。

    O, O′-二乙基[α-(2-氟苯基)-α-(L-脯氨酰-L-丙氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲl) 白色固体, 产率57%;mp 70~71 ℃; [α]D20+76.6(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.08(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.13(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.38(d, 3H, J=4.0 Hz, CH3), 2.15~2.20(m, 1H, NH), 1.86~1.94(m, 2H, CH2), 2.20~2.39(m, 2H, CH2), 3.06~3.13(m, 2H, CH2), 3.87~4.10(m, 4H, 2OCH2), 4.28~4.31(m, 1H, NCH), 5.07~5.11(m, 2H, NCH), 6.34(q, 1H, J=16.0 Hz, PCH), 6.82~7.49(m, 4H, Ar—H), 8.41(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.3, 16.4, 18.7, 24.4, 32.6, 38.1, 46.3, 58.5, 63.4, 63.5, 67.2, 114.4, 123.5, 127.7, 128.8, 129.5, 159.5, 170.1, 172.0;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 19.1;ESI MS(m/z): 431.0[M+H]+; 元素分析理论值C19H28FN2O6P: C 53.02, H 6.56, N 6.51;实际值: C 53.23, H 6.58, N 6.62。

    O, O′-二乙基[α-(4-氟苯基)-α-(L-脯氨酰-L-丙氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲm) 无色液体, 产率31%;[α]D20+82.1(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.13(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.18(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.35(d, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 2.18~2.25(m, 1H, NH), 1.81~1.97(m, 2H, CH2), 2.15~2.30(m, 2H, CH2), 3.02~3.10(m, 2H, CH2), 3.85~4.08(m, 4H, 2OCH2), 4.26~4.29(m, 1H, NCH), 5.15~5.20(m, 2H, NCH), 6.28(q, 1H, J=20.0 Hz, PCH), 6.58~7.51(m, 4H, Ar—H), 8.36(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.2, 16.3, 18.8, 24.4, 32.5, 38.2, 46.2, 58.6, 63.2, 63.3, 67.3, 115.5, 115.6, 128.2, 128.3, 131.9, 160.3, 170.7, 172.5;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 19.8;ESI MS(m/z): 431.0[M+H]+; 元素分析理论值C19H28FN2O6P: C 53.02, H 6.56, N 6.51;实际值: C 53.06, H 6.45, N 6.55。

    O, O′-二乙基[α-(2-氟苯基)-α-(L-苯丙氨酰-L-丙氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲn) 无色液体, 产率44%;[α]D20+73.4(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.08(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.14(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.36(d, 3H, J=4.0 Hz, CH3), 2.13~2.19(m, 2H, NH2), 3.02~3.15(m, 2H, CH2Ph), 3.95~4.10(m, 4H, 2OCH2), 4.46~4.61(m, H, NCH), 5.01~5.03(m, 1H, NCH), 6.15(q, 1H, J=16.0 Hz, PCH), 6.93~7.44(m, 9H, Ar—H), 8.32(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.2, 16.3, 18.2, 45.6, 54.7, 56.9, 63.2, 63.3, 71.2, 115.8, 124.7, 126.1, 127.6, 127.8, 128.4, 128.6, 128.7, 129.3, 139.4, 160.5, 169.8, 172.0;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 18.6;ESI MS(m/z): 481.0[M+H]+; 元素分析理论值C23H30FN2O6P: C 57.50, H 6.29, N 5.83;实际值: C 57.74, H 6.17, N 6.00。

    O, O′-二乙基[α-(4-氟苯基)-α-(L-苯丙氨酰-L-丙氨酰氧基)]甲基膦酸酯(Ⅲo) 无色液体, 产率29%;[α]D20+63.7(c 0.05, CHCl3); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz), δ: 1.10(t, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.16(m, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 1.31(d, 3H, J=8.0 Hz, CH3), 2.19~2.26(m, 2H, NH2), 2.99~3.17(m, 2H, CH2Ph), 3.92~4.05(m, 4H, 2OCH2), 4.51~4.68(m, H, NCH), 4.97~5.00(m, 1H, NCH), 6.06(q, 1H, J=12.0 Hz, PCH), 6.95~7.46(m, 9H, Ar—H), 8.27(s, 1H, NH); 13C NMR(100 MHz, CDCl3), δ: 16.3, 16.4, 18.2, 45.5, 54.4, 56.3, 63.0, 63.1, 70.8, 115.0, 115.2, 125.3, 127.0, 127.1, 128.5, 128.7, 128.8, 128.9, 132.4, 140.3, 161.2, 170.1, 171.7;31P NMR(CDCl3, 121 MHz), δ: 20.6;ESI MS(m/z): 481.0[M+H]+; 元素分析理论值C23H30FN2O6P: C 57.50, H 6.29, N 5.83;实际值: C 57.49, H 6.30, N 5.89。

    采用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)法[21],以顺铂为对照,测定目标化合物对肿瘤细胞A-549、SGC-7901和EC-109的增殖抑制作用,两点法(Reed and Muench法)计算其IC50 值,抗肿瘤活性测试在相同条件下重复3次,以mean±SD表示其结果。

    在合成中间体Ⅱ时,对参考文献[19]方法的合成进行优化和改进,实验表明:1)适度增加NMM的量(n(NMM)∶n(氨基酸甲酯盐酸盐)=2∶3),更有利于氨基酸甲酯盐酸盐完全中和及后续反应的发生;2)在碱性条件下进行甲酯的水解,相比于文献的室温条件下反应,控制反应温度在-5~0 ℃更有利于甲酯的脱甲基,副产物也更少。

    在制备目标物的脱Boc保护实验中,发现反应温度和时间对产率有较大影响,以化合物Ⅲa的合成进行研究,结果表明:1)在-5~0 ℃时,产率最高,可达49%,随着反应温度的升高,TLC跟踪显示,杂质增加,收率降低,若在-10~-6 ℃条件下脱保护,收率仅19%,说明太低的反应温度也不利于反应的发生;2)脱Boc保护也受反应时间的影响,维持反应在11~12 h,有更好的收率,TLC跟踪反应,发现反应时间低于10 h,反应不彻底,而反应时间多余13 h,有更多的杂质生成。

    体外抗肿瘤活性测试结果表明:该类化合物对所测肿瘤细胞有不同程度的增殖抑制作用。如表 1所示,化合物Ⅲc、Ⅲl对SGC-7901和EC-109的活性较好,其中,化合物Ⅲc对两种肿瘤细胞的IC50分别为(9.3±0.6)和(13.7±0.6) μmol/L,化合物Ⅲl对两种肿瘤细胞的IC50分别为(6.5±1.2)和(10.7±0.7) μmol/L。抗肿瘤活性最为突出的化合物是Ⅲf和Ⅲn,前者对A-549、SGC-7901和EC-109的IC50分别为(6.9±1.2)、(12.9±0.6)和(6.3±1.0) μmol/L,其中对A-549和EC-109的增殖抑制作用与对照药顺铂接近;后者对A-549、SGC-7901和EC-109的IC50分别为(10.2±1.3)、(6.7±1.0)和(6.1±1.0) μmol/L,其中对SGC-7901和EC-109的增殖抑制作用与对照药顺铂接近。

    表 1

    表 1  目标化合物的IC50
    Table 1.  IC50 values of target compounds for different tumor cells
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    化合物
    Compound
    半抑制浓度IC50 /(μmol·L-1)
    A-549 SGC-7901 EC-109
    Ⅲa 52.3±1.8 21.2±1.4 18.8±1.0
    Ⅲb 28.3±1.6 20.0±1.4
    Ⅲc 21.6±1.3 9.3±0.6 13.7±0.6
    Ⅲd 18.0±1.1 32.5±1.7 25.1±0.6
    Ⅲe 10.6±1.5 22.8±1.3 14.1±0.8
    Ⅲf 6.9±1.2 12.9±0.6 6.3±1.0
    Ⅲg 50.1±2.8 28.9±2.2 55.2±0.6
    Ⅲh 37.3±1.4 42.0±2.3 28.7±1.0
    Ⅲi 12.7±1.5 15.5±1.2
    Ⅲj 52.2±3.1 38.9±2.3
    Ⅲk 32.8±1.9 46.1±1.0
    Ⅲl 16.8±1.8 6.5±1.2 10.7±0.7
    Ⅲm 24.5±2.0 34.3±2.2 11.5±0.8
    Ⅲn 10.2±1.3 6.7±1.0 6.1±1.0
    Ⅲo 34.7±2.0 24.4±1.8 18.5.±1.3
    顺铂Cisplatin 6.0±0.5 5.8±0.8 5.9±0.7

    目标化合物的构效关系分析:1)进一步证实含氟原子的化合物大多有更好的抗肿瘤活性;2)与前期设计合成的含一个氨基酸结构单元的膦酸酯衍生物比较,部分含两个氨基酸结构单元的二肽类膦酸酯化合物的抗肿瘤活性有较大提高,如化合物Ⅲf、Ⅲn对EC-109和Ⅲl、Ⅲn对SGC-7901的增殖抑制活性均优于前期化合物[16-17];3)部分含脯氨酸结构单元和苯丙氨酸结构单元的目标物呈现更优的抗肿瘤活性,如化合物Ⅲe、Ⅲf、Ⅲl和Ⅲn;4)不同氨基酸片段的衍生物对所测肿瘤细胞的增殖抑制活性存在较大的差异化,如含甘氨酸和L-脯氨酸片段的目标物Ⅲd、Ⅲe和Ⅲf对肿瘤细胞A-549和EC-109的活性优于SGC-7091,含丙氨酸和脯氨酸片段的目标物Ⅲl和Ⅲm对EC-109的活性更好。

    在前期研究基础上,对含一个氨基酸结构单元的膦酸酯衍生物进行结构优化,设计合成了15个二肽类膦酸酯衍生物(Ⅲa-Ⅲo)。含两个氨基酸结构单元的二肽类膦酸酯衍生物抗肿瘤活性有较大提高,含不同氨基酸片段的目标物对肿瘤细胞的增殖抑制作用差异化较大,目标物中的氨基酸连接顺序对抗肿瘤活性的影响需进一步考察。该研究结果为抗肿瘤药物的研究提供了必要基础实验数据,对基于片段的药物发现(FBDD)方法具有指导意义。


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  • 图式 1  目标化合物的合成路线

    Scheme 1  Synthetic route of target compounds

    Reagents and conditions: a.Et3N; b.EDCI/HOBt; c.NaOH; d.EDCI/DMAP; e.CH3OH, CH3COCl
    Ⅲa: R=H, R1=H, R2=CH3; Ⅲb: R=2-F, R1=H, R2=CH3; Ⅲc: R=4-F, R1=H, R2=CH3; Ⅲd: R=H, R1=H, R2=2-pyrrolidinyl; Ⅲe: R=2-F, R1=H, R2=2-pyrrolidinyl; Ⅲf: R=4-F, R1=H, R2=2-pyrrolidinyl; Ⅲg: R=H, R1=H, R2=CH2Ph; Ⅲh: R=2-F, R1=H, R2=CH2Ph; Ⅲi: R=4-F, R1=H, R2=CH2Ph; Ⅲj: R=2-F, R1=CH3, R2=CH3; Ⅲk: R=4-F, R1=CH3, R2=CH3; Ⅲl: R=2-F, R1=CH3, R2=2-pyrrolidinyl; Ⅲm: R=4-F, R1=CH3, R2=2-pyrrolidinyl; Ⅲn: R=2-F, R1=CH3, R2= CH2Ph; Ⅲo: R=4-F, R1=CH3, R2= CH2Ph

    表 1  目标化合物的IC50

    Table 1.  IC50 values of target compounds for different tumor cells

    化合物
    Compound
    半抑制浓度IC50 /(μmol·L-1)
    A-549 SGC-7901 EC-109
    Ⅲa 52.3±1.8 21.2±1.4 18.8±1.0
    Ⅲb 28.3±1.6 20.0±1.4
    Ⅲc 21.6±1.3 9.3±0.6 13.7±0.6
    Ⅲd 18.0±1.1 32.5±1.7 25.1±0.6
    Ⅲe 10.6±1.5 22.8±1.3 14.1±0.8
    Ⅲf 6.9±1.2 12.9±0.6 6.3±1.0
    Ⅲg 50.1±2.8 28.9±2.2 55.2±0.6
    Ⅲh 37.3±1.4 42.0±2.3 28.7±1.0
    Ⅲi 12.7±1.5 15.5±1.2
    Ⅲj 52.2±3.1 38.9±2.3
    Ⅲk 32.8±1.9 46.1±1.0
    Ⅲl 16.8±1.8 6.5±1.2 10.7±0.7
    Ⅲm 24.5±2.0 34.3±2.2 11.5±0.8
    Ⅲn 10.2±1.3 6.7±1.0 6.1±1.0
    Ⅲo 34.7±2.0 24.4±1.8 18.5.±1.3
    顺铂Cisplatin 6.0±0.5 5.8±0.8 5.9±0.7
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  • 发布日期:  2021-01-10
  • 收稿日期:  2020-06-14
  • 接受日期:  2020-09-18
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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