基于适配体的羧酸酯酶2A生化传感器的设计及应用研究

陈悦 关晓青 王亦男 何青青 王丹丹 邹立伟 汤庆丰 葛广波

引用本文: 陈悦, 关晓青, 王亦男, 何青青, 王丹丹, 邹立伟, 汤庆丰, 葛广波. 基于适配体的羧酸酯酶2A生化传感器的设计及应用研究[J]. 分析化学, 2020, 48(11): 1467-1476. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.201283 shu
Citation:  CHEN Yue,  GUAN Xiao-Qing,  WANG Yi-Nan,  HE Qing-Qing,  WANG Dan-Dan,  ZOU Li-Wei,  TANG Qing-Feng,  GE Guang-Bo. Development and Application of RNA Aptamer-based Biochemical Sensor for Carboxylesterase 2A[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2020, 48(11): 1467-1476. doi: 10.19756/j.issn.0253-3820.201283 shu

基于适配体的羧酸酯酶2A生化传感器的设计及应用研究

    通讯作者: 葛广波,geguangbo@dicp.ac.cn
  • 基金项目:

    本文系国家重点研发计划项目(No.2017YFC1700202)、国家自然科学基金项目(Nos.81773687,81922070,81903576)和上海市普陀区卫生系统自主创新科研项目(No.ptkwws201802)资助

摘要: 基于RNA适配体与3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮(DFHBI)复合物的荧光特性,结合羧酸酯酶2A(CES2A)的底物偏好性,采用计算机虚拟筛选和实验相结合的策略设计,研发了一种CES2A新型生化传感器。首先,以DFHBI为母核,借助计算机虚拟筛选技术预测了系列DFHBI羧酸酯类衍生物作为CES2A候选底物的潜力。其次,对排名前三位的潜在底物进行合成,并对其化学稳定性和特异性进行了评价,发现3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮苯甲酸酯(Ph-DFHBI)对目标酶CES2A显示出极高的特异性和灵敏度。进一步借助同工酶水解实验发现,Ph-DFHBI仅可被CES2A特异性水解,并释放出DFHBI,而人体分布的其它高丰度水解酶(羧酸酯酶1A(CES1A)、乙酰胆碱酯酶(BchE)、丁酰胆碱酯酶(AchE)等)难以水解Ph-DFHBI。进一步在重组单酶和肝组织制备物中考察了CES2A-水解Ph-DFHBI的酶促反应动力学。在生理条件(pH 7.4,37℃)下,CES2A介导的Ph-DFHBI水解反应显示出极高的亲和力和较快的反应速率,Km=0.66 μmol/L,Vmax=18.92 nmol/(min·mg)。在最佳反应条件下,基于Ph-DFHBI的传感器检测CES2A的检出限为14.5 ng/mL。将此生化传感器应用于组织微粒体等复杂生物体系中CES2A活性的快速检测,以及CES2A抑制剂的高通量筛选与评价,均显示出良好的实用性。本研究设计了一种CES2A新型生化传感器,为探究复杂生物体系中CES2A的生物学功能及CES2A调控剂的高效发现提供了有力工具。

English


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  • 收稿日期:  2020-05-18
  • 修回日期:  2020-08-19
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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