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  异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate Dehydrogenase, IDH)是一类小分子蛋白, 是人体内具有重要脱羧作用的氧化还原酶, 它主要分布于肝脏、心肌、骨骼肌和肾脏等组织。异柠檬酸脱氢酶在能量代谢、氨基酸和维生素合成中扮演重要角色。研究发现异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)基因突变会引发神经胶质瘤(最常见的脑瘤)和白血病^[1]。发生突变的酶产生2-羟基戊二酸(2HG)，它是一种潜在的致癌代谢物, 这对胶质脑瘤诊断与治疗具有重大意义^[2]。近年来国内外对其开展了大量深入的研究，包括酶的结构、酶学性质、基因克隆、蛋白的组装与转运、功能等各个方面，对IDH有了更多了解。

  1    IDH结构

  IDH是一种催化异柠檬酸(即α-羟基-β-羧基戊二酸，见图 1)氧化脱羧产生成α-酮戊二酸的代谢酶。IDH有2种辅酶：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，见图 2。NAD是一种转递氢离子的辅酶，它出现在细胞的很多代谢反应中，NADH是NAD⁺的还原形式。NADP是一种极为重要的核苷酸类辅酶，NADPH是NADP⁺的还原形式。NADP是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的磷酸化衍生物，参与多种合成代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成。

  

  图1 异柠檬酸

  Figure 1. Isocitrate

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  图2 NAD和NADP的结构

  Figure 2. Structure of NAD and NADP

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  辅酶与IDH的活性密切相关。根据辅酶的特异性，IDH可以分为以NAD为电子受体的NAD-依赖型(NAD-IDH)，如IDH3；以NADP为电子受体的NADP-依赖型(NADP-IDH)，如IDH1和IDH2。真核生物中的NAD-IDH主要负责催化异柠檬酸氧化脱羧成α-酮戊二酸，并将氧化型NAD⁺还原成NADH。

  根据空间结构特点，NADP-依赖型IDH可分为同源二聚体IDH和单体IDH, 它们对生物体的能量代谢、生物合成以及抗氧化胁迫起重要作用。IDH1和IDH2是二聚体, IDH3是由2个α亚基、1个β亚基、1个γ亚基组成的四聚体构成。其中α亚基为催化亚基，并有一部分的异柠檬酸结合位点，而β、γ亚基可能与调节有关。

  1.1    单体IDH的空间结构特点

  以固氮细菌IDH为例，它包含2个结构域，分别为小结构域和大结构域^[3]。小结构域由5个β-股和14个α-螺旋组成，其中有8个α-螺旋位于C的末端，形成螺旋富集区；大结构域由16个β-股和13个α-螺旋组成，呈假二重轴对称。

  1.2    二聚体IDH的空间结构特点

  大多数NADP-IDH是二聚体IDH，每个亚基有1个活性中心、2个结合位点。以大肠杆菌IDH为例，二聚体IDH每个亚基由3个结构域组成：大结构域、小结构域和钩扣结构域^[3]，见图 3。大结构域包含NADP的结合位点和磷酸化调节位点。小结构域形成一个典型的α/β交错的“三明治”样式，是连接2个亚基的桥梁。钩扣结构域将2个亚基紧紧连在一起。大结构域和小结构域拥有各自的疏水核心，这使得它们被2个口袋所分开。其中较大的为“活性口袋”，它的底部和侧壁含有许多极性带电氨基酸，表现出很强的亲水性，并且向溶剂开放，是结合底物、金属离子以及催化反应发生的地方。较小的为“背面口袋”，它表现出很强的疏水性，具有某些生物功能。

  

  图3 二聚体IDH的空间结构

  Figure 3. Space structure of IDH dimer

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  2    生物学特性

  2.1    金属离子的影响

  IDH的活性需要二价金属离子的参与，如Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺等金属离子。离子半径的大小决定了反应效率，Mn²⁺和Mg²⁺是天然的配体，Ca²⁺是抑制剂。Mn²⁺与2个天冬氨酸，2个水分子以及底物异柠檬酸形成含6个配位键的八面体(见图 4)，这种结构有利于将底物的氢阴离子传递给NADP⁺。而Ca²⁺的结合形成7个配位键，虽然不引起构型的变化，但局部原子的位置发生了细微的变化，结果造成酶活性的丧失。

  

  图4 与Mn²⁺结合的NADP-IDH

  Figure 4. Structure of NADP-IDH combined with Mn²⁺

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  2.2    化学修饰剂

  许多化学物质可以修饰IDH，如NO可以与猪线粒体IDH的巯基形成络合物，阻止IDH从伸展的失活状态重新折叠成具有活性的α-螺旋结构。另外, 对氯汞苯甲酸可以修饰固氮细菌IDH阻止异柠檬酸与其结合而使酶失活。脂质过氧化物4-羟基-2-壬烯酸可以修饰老鼠线粒体IDH而使其失活，从而引发心血管疾病^[4]。

  

  图5 对氯汞苯甲酸与4-羟基-2-壬烯酸的结构

  Figure 5. Structure of p-(chloromercurio) benzoic acid and 4-hydroxy-2-azelaic acid

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  2.3    柠檬酸异构化成异柠檬酸

  柠檬酸是一个叔醇化合物，它的羟基所处的位置妨碍着柠檬酸进一步氧化。异柠檬酸是可以氧化的仲醇，柠檬酸通过失水形成顺乌头酸，然后再加水到顺乌头酸这一不饱和的中间物上，把羟基从原来的位置转移到相邻的碳原子上从而形成异柠檬酸。反应如图 6所示。

  

  图6 柠檬酸异构化成异柠檬酸

  Figure 6. Isoerization of citric acid into isocitric acid

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  柠檬酸有一个对称平面，没有旋光性，但具有前手性。乌头酸酶催化柠檬酸和异柠檬酸互变的反应，在催化过程中形成顺乌头酸中间产物。乌头酸酶能够识别柠檬酸的前-R和-S2种取向不同的羧甲基，即顺时针和逆时针取向不同的2个基团。乌头酸酶含有由共价键结合的4个铁原子。这4个铁原子和4个无机硫化物、4个半胱氨酸(Cys)的硫原子一起结合成团，称为Fe-S聚簇，如图 7。Fe-S聚簇与柠檬酸结合，并参与底物的脱水和再水和作用。蛋白质与Fe-S聚簇结合，当Fe-S聚簇中去除Fe²⁺后，乌头酸酶结构遭到破坏，从而失去活性。

  

  图7 Fe-S聚簇

  Figure 7. Cluster of Fe-S

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  3    测定方法

  目前, 测定IDH检测方法有手工比色法、固定时间比色法、连续监测比色法、分光比色法、终点法等。用比色法测得IDH活性的原理(见图 8)：以NADP为电子受体的NADP-IDH能催化异柠檬酸脱氢脱羧生成α-酮戊二酸, 此物质再与2, 4-二硝基苯肼作用产生α-酮戊二酸二硝基苯腙, 后者在碱性溶液中呈棕红色, 颜色深浅与酶活性成正比。异柠檬酸脱氢酶活性测定, 近年来已被广泛应用于临床对肝实质性损害疾病的诊断和传染病学的调查, 特别在急性肝炎的早期阶段。

  

  图8 比色法测得IDH活性的原理

  Figure 8. Principle of IDH activity by colorimetry

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  根据分光光度法, 在全自动生化分析仪上建立了测定IDH的连续监测法。检测原理为：在pH为7.5的Tris-HCl缓冲体系中, IDH催化异柠檬酸脱羧产生α-酮戊二酸, 将NADP⁺还原为NADPH, 通过监测NADPH产生速率, 可以计算出IDH的活力。

  异柠檬酸+NADP⁺$ \mathop \to \limits^{{\rm{IDH}}} $α-酮戊二酸+NADPH+CO₂

  终点测定方法为在缓冲体系中, 氧化型辅酶(NADP⁺)与异柠檬酸盐在IDH存在下, 由Mg²⁺离子作激活剂发生反应, 生成α-酮戊二酸和NADPH。该方法具有操作简单、快速、实用等特点, 采用一步反应, 准确性高。

  4    催化机制

  异柠檬酸脱氢酶催化的反应，在生物化学酶促反应中具有代表性。异柠檬酸脱氢酶的催化动力学机制为：异柠檬酸的α-羟基脱氢氧化，从羟基上夺取一个质子传递给酶分子中一个充当路易斯碱的氨基酸残基。H⁺以空间特异性方式从异柠檬酸的C₂转移到NADP⁺烟酰胺环的C₄，将其还原成NADPH，异柠檬酸由β-羟酸氧化产生β-酮酸即草酰琥珀酸。草酰琥珀酸脱羧，异柠檬酸的β-羧基被转移来的质子所取代，羧基以CO₂的形式被释放，生成α-酮戊二酸(见图 9)。在质子转移过程中，Mn²⁺与异柠檬酸α-羧基和C₂位羟基上的氧形成配位键，以稳定在脱氢反应过程中形成的羟基氧上的负电荷。Mn²⁺与羰基氧形成的静电作用力，使电子能够从β-羧基上转移，从而加速脱羧反应的进行^[3]。IDH与异柠檬酸、NADP⁺结合形成反应前体复合物，复合物的稳定性是决定反应速度快慢的一个重要的因素。

  

  图9 IDH的催化机制

  Figure 9. Catalytic mechanism of IDH

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  在异柠檬酸脱氢酶作用下，异柠檬酸的仲醇氧化成羰基，生成草酰琥珀酸的中间产物，后者在同一酶表面，快速脱羧生成α-酮戊二酸、NADH和CO₂，此反应为β-氧化脱羧，此酶需要锰离子作为激活剂。

  5    催化活性的调节

  异柠檬酸脱氢酶催化的反应，在生物化学酶促反应中具有代表性。异柠檬酸脱氢酶是一个变构调节酶。在能荷低的情况下，NAD⁺的含量升高，不仅有利于柠檬酸脱氢酶，对其他需要以NAD⁺为辅助因子的酶促反应也有推动作用。

  大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶(EcIDH)的催化活性是通过磷酸化与去磷酸化作用来调节的。三羧酸循环是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，是3大营养素的最终代谢通路，又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。EcIDH在三羧酸循环起作用，通过调节该酶的活性来调控不同生长条件下异柠檬酸的流向。在真核生物中，NAD-IDH是三羧酸循环的重要限速酶，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸和NADH。由于NAD-IDH在三羧酸循环中具有重要的地位，因此NAD-IDH的活性对于生物体的整个生命代谢都有很大影响。

  6    IDH1参与肿瘤发生的作用机制与展望

  IDH1突变与胶质瘤的发生、进展及预后密切相关，是当前研究的热点^[5]。我国学者近几年在IDH1突变导致胶质产生的分子机理研究中取得了重大进展^[6]。IDH1基因突变引起特定位点精氨酸转变为其他氨基酸，导致结合部位氢键消失，亲水基团性质改变，会破坏酶的亲和力, 导致酶与底物结合能力降低, 代谢途径改变，NADP⁺还原为NADPH水平减低，产物α-酮戊二酸含量下降，而可被α-酮戊二酸降解的缺氧诱导因子含量则升高，该因子在低氧条件下可促进肿瘤细胞生长。突变的IDH1还能与野生型IDH1竞争底物, 突变的IDH1与底物结合形成二聚体, 进一步阻断IDH1的活性^[7]。IDH1突变后, 出现一种新能力, 把α-酮戊二酸还原成2-羟基戊二酸。2-羟基戊二酸过多累积会直接抑制包括人体内组蛋白去甲基化酶与DNA去甲基化酶在内的多个重要双加氧酶的活力, 双加氧酶的活力降低, 改变细胞的增殖和生长方式, 进而诱发肿瘤^[8]。

  研究表明, IDH1在胶质瘤的形成和对胶质瘤的诊断发挥着重要作用^[9]。α-酮戊二酸的衍生物可以逆转已经发生了突变IDH1中缺氧诱导因子水平的升高。这为制药提供了新的依据，生产类似α-酮戊二酸的药物可能在某种程度上能够用于治疗由于IDH1突变而导致的肿瘤。IDH1突变患者与非突变患者的预后存在明显差别, 因此可进行肿瘤治疗的预期判断。在临床中, IDH1突变已经显示对胶质瘤患者有诊断和预后意义^[10]。随着IDH1基因突变在胶质瘤发病机制中的深入研究, 相关药物的开发和利用, 必将为胶质瘤患者带来新的希望。

  关于IDH1的许多问题尚待进一步研究, 如IDH突变与其他癌基因关系，是否影响放疗和化疗，如何将α-酮戊二酸类似物导入肿瘤细胞并发挥生物学治疗作用等需要进一步探讨。IDH1作为首先从人的肿瘤基因组测序中鉴定的肿瘤发生相关基因, 其应用潜力更大。这将进一步推进肿瘤基因组的深入研究以鉴定更多类似的基因突变, 将来肿瘤治疗会有一个本质性的飞跃。

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  图 1  异柠檬酸

  Figure 1  Isocitrate

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  图 2  NAD和NADP的结构

  Figure 2  Structure of NAD and NADP

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  图 3  二聚体IDH的空间结构

  Figure 3  Space structure of IDH dimer

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  图 4  与Mn²⁺结合的NADP-IDH

  Figure 4  Structure of NADP-IDH combined with Mn²⁺

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  图 5  对氯汞苯甲酸与4-羟基-2-壬烯酸的结构

  Figure 5  Structure of p-(chloromercurio) benzoic acid and 4-hydroxy-2-azelaic acid

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  图 6  柠檬酸异构化成异柠檬酸

  Figure 6  Isoerization of citric acid into isocitric acid

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  图 7  Fe-S聚簇

  Figure 7  Cluster of Fe-S

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  图 8  比色法测得IDH活性的原理

  Figure 8  Principle of IDH activity by colorimetry

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  图 9  IDH的催化机制

  Figure 9  Catalytic mechanism of IDH

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