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• 香豆素是天然产物中的重要化合物，具有多方面特性，在生物医药^[1-4]、分析、染料^[5]及光学^[6]等众多领域中应用广泛。因此，人们对天然香豆素类的全合成及衍生物修饰合成的研究一直处于活跃状态，其中无论天然还是合成香豆素类化合物的抗氧化研究已成为医药、食品和保健领域的研究热点。目前香豆素类抗氧化研究主要集中在含4-甲基、羟基、氨基等基团的简单香豆素、呋喃香豆素以及香豆素基查尔酮、香豆素基二氢吡唑^[7]等香豆素衍生物上，对香豆素芳酰胺类化合物的抗氧化研究则鲜有报道。本文在前期合成研究3-氨基-7, 8-二甲氧基香豆素的基础上^[8]，以其为基本母核，进行衍生合成，经与芳香酸缩合，设计合成了10个香豆素芳酰胺类化合物，并通过体外实验体系对其抗氧化性能进行测试，进而评价3-氨基-7, 8-二甲氧基香豆素及其酰胺衍生物的抗氧化能力，探究其抗氧化构效关系，为该类化合物的应用研究提供基础信息，为香豆素类化合物的合成生产提供参考。

  1.   实验部分

  1.1   试剂和仪器

  3-氨基-7, 8-二甲氧基香豆素(≥95%)实验室自制；对甲氧基苯甲酸(≥97%)购自上海涧捷化学试剂有限公司；异烟酸(≥98%)和苯乙酸(≥98%)购自国药集团化学试剂有限公司；1-萘乙酸(≥98%)购自中国曹杨第二中学化工厂；烟酸(≥98%)和1-萘甲酸(≥98%)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；桂皮酸(≥99.5%)和二环己基碳酰亚胺(DCC，≥95%)购自上海涧捷化学试剂有限公司，其余试剂均为市售分析纯，直接使用。

  BRUKER AV400型核磁共振仪(NMR，德国Bruker公司)；Acquity UPLC-Q-Tof Micro型液相色谱质谱联用仪(LC-MS, 美国Waters公司)；UV-2550型紫外可见分光光度计(UV-Vis, 日本岛津公司)；X-4型数字显示显微熔点仪(巩义市予华仪器有限责任公司)。

  1.2   合成路线

  合成路线见Scheme 1。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Stynthesis of coumarin compounds with aromatic amide skeleton

  (I) RCOOH, SOCl₂; CH₂Cl₂, Triethylamine; (II) RCOOH, DCC, CH₂Cl₂

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  1.3   酰氯法合成衍生物(2a-2j)

  圆底烧瓶中，先将芳香酸a-f(3.39 mmol)与25 mL氯化亚砜混合回流3 h后，旋蒸后得到酰氯。再将其溶解在适量的二氯甲烷中。三颈瓶中分别加入3-氨基-7, 8-二甲氧基香豆素(4)(0.5 g，2.26 mmol)、二氯甲烷(10 mL)和三乙胺(1 mL，7.2 mmol)，冰浴下搅拌滴入酰氯，加毕，室温下搅拌，薄层色谱(TLC)跟踪反应，产品经二氯甲烷提取，然后在减压下蒸发溶剂，得到化合物2a-2f，用三氯甲烷重结晶。

  N-(7, 8-二甲氧基-3-香豆素)苯乙酰胺(2a)  白色固体；mp 228~230 ℃；收率64.94%；¹H NMR(400 MHz，CDCl₃), δ:8.61(s，1H，CONH)，8.02(s，1H，C＝CH)，7.39(dd，J=9.0，5.6 Hz，2H，Ar—H)，7.35~7.30(m，3H，Ar—H)，7.16(d，J=8.7 Hz，1H，Ar—H)，6.89(d，J=8.7 Hz，1H，Ar—H)，3.96(s，3H，OCH₃)，3.93(s，3H，OCH₃)，3.75(s，2H，CH₂)；¹³C NMR(101 MHz，CDCl₃), δ:171.47，159.73，155.42，145.38，137.57，135.99，135.09，130.65，130.54，129.10，123.86，122.98，115.64，110.93，62.88，57.79，46.19；ESI-MS(m/z) 362(M+Na⁺)。

  4-甲氧基-N-(7, 8-二甲氧基-3-香豆素)苯甲酰胺(2b)  白色固体；mp 235~237 ℃；收率62.24%；¹H NMR(400 MHz，CDCl₃), δ:8.79(s，1H，CONH)，8.68(s，1H，C＝CH)，7.89(d，J=8.7 Hz，2H，Ar—H)，7.23(d，J=8.7 Hz，1H, Ar—H)，7.00(d，J=8.7 Hz，2H，Ar—H)，6.93(d，J=8.7 Hz，1H，Ar—H)，4.01(s，3H，OCH₃)，3.95(s，3H，OCH₃)，3.89(s，3H，OCH₃)；¹³C NMR(101 MHz，CDCl₃), δ:166.92，164.38，160.27，155.37，146.32，145.04，137.64，136.59，130.46，123.90，123.47，115.91，115.52，111.01，62.95，57.82，56.88；ESI-MS(m/z) 378 (M+Na⁺)。

  N-(7, 8-二甲氧基-3-香豆素)肉桂酰胺(2c)  白色固体；mp 257~259 ℃；收率78.74%；¹H NMR(400 MHz，CDCl₃), δ:8.77(s，1H，CONH)，8.18(s，1H，C＝CH)，7.75(d，J=15.6 Hz，1H，CH＝CH)，7.57(dd，J=6.5，2.8 Hz，2H，Ar—H)，7.45~7.37(m，3H，Ar—H)，7.23(d，J=8.7 Hz，1H，Ar—H)，6.93(d，J=8.7 Hz，1H，Ar—H)，6.60(d，J=15.6 Hz，1H，CH＝CH)，4.00(s，3H，OCH₃)，3.95(s，3H，OCH₃)；¹³C NMR(101 MHz，CDCl₃), δ:172.4，166.05，160.04，155.47，144.57，137.63，135.70，131.70，130.34，129.49，125.78，123.97，123.31，121.40，115.85，111.01，62.93，57.82；ESI-MS(m/z) 374(M+Na⁺)。

  N-(7, 8-二甲氧基-3-香豆素)-3-吡啶甲酰胺(2d)  白色固体；mp 272~274 ℃；收率73.76%；¹H NMR(400 MHz，CDCl₃), δ:9.17(d，J=1.9 Hz，1H，CH＝N)，8.82(d，J=4.9 Hz，1H，CH＝N)，8.80(s，1H，CONH)，8.73(s，1H, CH＝C)，8.20(d，J=8.0 Hz，1H，CH＝C)，7.47(dd，J=7.9，4.8 Hz，1H，Ar—H)，7.28~7.24(t，1H，CH＝C)，6.95(d，J=8.7 Hz，1H，Ar—H)，4.02(s，3H，OCH₃)，3.96(s，3H，OCH₃)；¹³C NMR(101 MHz，CDCl₃), δ:165.58，160.06，155.79，154.48，149.82，145.53，137.71，136.11，130.81，126.35，124.97，124.14，122.88，115.51，111.12，62.97，57.84；ESI-MS(m/z) 349(M+Na⁺)。

  N-(7, 8-二甲氧基-3-香豆素)-4-吡啶甲酰胺(2e)  白色固体；mp 286~288 ℃；收率81.3%；¹H NMR(400 MHz，CDCl₃), δ:8.84(d，J=5.4 Hz，2H，CH＝N)，8.79(d，J=8.5 Hz，2H，Ar—H)，7.75(d，J=5.7Hz，2H，CH＝C)，6.96(d，J=8.7 Hz，1H，Ar—H)，4.01(s，3H，OCH₃)，3.96(s，3H, OCH₃)；¹³C NMR(101 MHz，CDCl₃), δ:165.40，159.99，155.92，152.37，141.99，137.72，126.63，124.21，122.67，122.05，115.40，111.37，111.15，62.97，57.84；ESI-MS(m/z) 349(M+Na⁺)。

  N-(7, 8-二甲氧基-3-香豆素)-1-萘甲酰胺(2f)  白色固体；mp 215~217 ℃；收率58.96%；¹H NMR(400 MHz，CDCl₃), δ:8.92(s，1H，CONH)，8.57(s，1H，CH＝C)，8.42(d，J=8.1 Hz，1H，Ar—H)，8.01(d，J=8.2 Hz，1H，Ar—H)，7.92(d，J=8.0 Hz，1H，Ar—H)，7.79(d，J=7.0 Hz，1H，Ar—H)，7.64~7.50(m，3H，Ar—H)，7.29(d，J=8.7 Hz，1H，Ar—H)，6.96(d，J=8.7 Hz，1H，Ar—H)，4.02(s，3H，OCH₃)，3.97(s，3H，OCH₃)；¹³C NMR(101 MHz，CDCl₃), δ:169.56，159.98，155.59，145.52，137.68，135.23，134.39，133.19，131.47，129.91，128.97，128.07，127.01，126.46，126.06，125.92，124.05，123.46，115.73，111.05，62.95，57.83；ESI-MS(m/z) 398(M+Na⁺)。

  1.4   酸胺缩合法合成衍生物(2g-2j)

  将芳香酸g-j(1 mmol)、化合物4(0.90 mmol)、二氯甲烷(15 mL)、DCC(1.1 mmol)加入到圆底烧瓶中。室温下搅拌，TLC跟踪反应。旋蒸，硅胶柱层析(V(乙酸乙酯):V(石油醚)=2:3)分离得化合物2g-2j。

  N-(7, 8-二甲氧基-3-香豆素)-1-萘乙酰胺(2g)  白色固体；mp 189~191 ℃；收率40.91%；¹H NMR(500 MHz，CDCl₃), δ:8.61(s，1H，CONH)，8.02(d，J=8.0 Hz，1H，Ar—H)，7.90~7.87(m，2H，Ar—H)，7.58~7.50(m，4H，Ar—H)，7.26(s，1H，C＝CH)，7.14(d，J=8.5 Hz，1H，Ar—H)，6.87(d，J=8.5 Hz，1H，Ar—H)，4.21(s，2H，CH₂)，3.93(s，3H，OCH₃)，3.92(s，3H，OCH₃)；¹³C NMR(125 MHz，CDCl₃), δ:171.6，160.1，155.4，145.4，137.4，135.5，133.4，131.4，130.4，130.3，129.7，128.3，127.2，125.5，124.9，123.9，122.9，115.8，115.6，110.8，62.9，57.8，44.2；ESI-MS(m/z) 412(M+Na⁺)。

  N-(7, 8-二甲氧基-3-香豆素)-2-萘氧乙酰胺(2h)  白色固体；mp 247~249 ℃；收率77.78%；¹H NMR(500 MHz，CDCl₃), δ:9.20(s，1H，CONH)，8.71(s，1H，C＝CH)，7.83(d，J=8.0Hz，1H，Ar—H)，7.81(d，J=8.0 Hz，1H，Ar—H)，7.76(d，J=8.0 Hz，1H，Ar—H)，7.47(t，1H，Ar—H)，7.39(t，1H，Ar—H)，7.33(dd，J=8.0，2.5 Hz，1H，Ar—H)，7.23(d，J=8.5 Hz，1H，Ar—H)，7.21(s，1H，Ar—H)，6.93(d，J=8.5 Hz，1H，Ar—H)，4.77(s，2H，CH₂)，4.00(s，3H，OCH₃)，3.95(s，3H，OCH₃)；¹³C NMR(125 MHz，CDCl₃), δ:166.8，159.6，158.2，156.2，155.4，145.8，137.7，135.6，131.6，131.2，129.9，128.6，128.2，126.3，125.9，124.7，122.7，119.8，115.6，111.0，66.7，63.0，57.9；ESI-MS(m/z) 428(M+Na⁺)。

  N-(7, 8-二甲氧基-3-香豆素)-2-呋喃甲酰胺(2i)  白色固体；mp 233~235 ℃；收率47.15%；¹H NMR(500 MHz，CDCl₃), δ:8.90(s，1H，CONH)，8.73(s，1H，C＝CH)，7.56(dd，J=1.0，1.5 Hz，1H，—O—CH＝C)，7.26(dd，J=1.5，3.0 Hz，1H，—O—C＝CH)，7.24(d，J=8.5 Hz，1H，Ar—H)，6.93(d，J=8.5 Hz，1H，Ar—H)，6.58(dd，J=2.0，3.5 Hz，1H，—C—CH＝C)，4.01(s，3H，OCH₃)，3.95(s，3H，OCH₃)；¹³C NMR(125 MHz，CDCl₃), δ:159.9，158.2，155.6，148.5，146.4，145.5，137.6，125.8，124.1，122.9，117.3，115.7，114.2，111.0，63.1，57.9；ESI-MS(m/z) 338(M+Na⁺)。

  N-(7, 8-二甲氧基-3-香豆素)-2-噻吩甲酰胺(2j)  白色固体；mp 241~242 ℃；收率47.97%；¹H NMR(500 MHz，CDCl₃), δ:8.74(s，1H，CONH)，8.39(s，1H，C＝CH)，7.69(dd，J=1.0，4.0 Hz，1H，—S—CH＝C)，7.61(dd，J=5.0，1.0 Hz，1H，S—C＝CH)，7.24(d，J=8.5 Hz，1H，Ar—H)，7.16(dd，J=5.0，4.0 Hz，1H，—C—CH＝C)，6.94(d，J=8.5 Hz，1H，Ar—H)，4.02(s，3H，OCH₃)，3.96(s，3H，OCH₃)；¹³C NMR(125 MHz，CDCl₃), δ:162.1，160.2，155.5，145.3，140.5，137.7，137.42，133.4，129.5，125.5，124.1，122.8，116.0，111.0，63.1，57.9；ESI-MS(m/z) 354(M+Na⁺)。

  1.5   3-氨基-7, 8-二甲氧基香豆素及其衍生物的抗氧化性能测定

  参考文献[9-11]方法，并作适当修改。以抗坏血酸为阳性对照，通过待测化合物与不同自由基系统(1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2, 2′-联氮二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐阳离子自由基(ABTS^+·)和羟自由基)反应前后的吸光度变化，利用UV-Vis对目标化合物清除DPPH、ABTS^+·及羟自由基的能力进行测试，自由基清除率(K)按式(1)计算：

  $ K/\% = \left[ {\left( {{A_0} - {A_1}} \right)/{A_0}} \right] \times 100 $

  (1)

  式中，A₀和A₁与分别代表实验组和对照组的吸光度值。

  2.   结果与讨论

  2.1   3-氨基-7, 8-二甲氧基香豆素芳酰胺衍生物的制备

  酰胺常见的制备方法有传统的酰氯法和酸胺直接缩合法。前者的优点是活性高，可与位阻大的氨基反应；但试剂毒性及腐蚀性较强，且在强酸环境下一些对酸敏感的基团无法承受。而后者则是目前应用较广的酰胺制备法，在缩合试剂的作用下，中间体活性酯不经分离直接进行后面的反应，形成酰胺键。具有简捷高效，反应条件温和的特点。因而成为本研究的首选。然而实验过程中发现，由于母体香豆素上的氨基可与香豆素环产生共轭，导致其亲核性下降，较难与羧酸反应，虽然2h收率尚可，估计与原料β-萘氧乙酸的空间位阻较小有关。但多数化合物收率不太理想，甚至难以合成，曾采取提高反应温度以及加入少量助催化剂与DCC一起脱水等措施，均收效不大。因此，部分衍生物的合成采用酰氯法，虽然操作步骤有所增加，但酰氯活性高，收率较为理想。反应过程中，加入三乙胺作为缚酸剂，中和反应生成的氯化氢，可减少香豆素上的氨基质子化，促进反应进行。

  2.2   目标化合物的抗氧化性能

  通过测定化合物分别对DPPH、ABTS^+·、羟基自由基的半抑制浓度(IC₅₀)来评价其抗氧化性能。先制作浓度-清除率曲线，求出线性回归方程，再根据回归方程计算出相应的IC₅₀。

  以目标化合物的浓度为横坐标，对应的自由基清除率为纵坐标，各测定化合物分别对DPPH、ABTS^+·、羟基自由基的清除率曲线见图 1A、1B及1C。

  图 1

  

  图 1.  DPPH(A)、ABTS^+·(B)、羟基自由基(C)实验结果

  Figure 1.  Scavenging results of DPPH (A), ABTS^+·(B)and ·OH(C) radicals

  Compounds:a.1; b.Vc; c.2a; d.2b; e.2c; f.2d; g.2e; h.2f; i.2g; j.2h; k.2i; l.2j

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  由以上实验结果求得的IC₅₀值见表 1。由表 1所知，在DPPH自由基清除活性测试中，化合物2b的清除能力最强，其清除自由基的能力为对照品的2倍，清除能力为母体化合物1的5倍；化合物2a和2c的清除能力也较母体化合物1强，接近对照品。

  表 1

  

  表 1  测定化合物对DPPH、ABTS^+·、羟自由基的清除作用

  Table 1.  Scavenging effect of compounds on DPPH, ABTS^+· and hydroxyl radical

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  Compounds	IC50 (DPPH)/(mmol·L-1)	IC50(ABTS+·)/(mmol·L-1)	IC50(·OH) /(mmol·L-1)
  1	0.41	0.12	1.88
  2a	0.24	0.8	1.08
  2b	0.08	0.92	0.44
  2c	0.23	1.85	1.59
  2d	0.62	5.64	2.77
  2e	1.88	4.1	3.12
  2f	0.48	3.54	2.72
  2g	2.38	1. 47	1.52
  2h	1.48	1.48	5.02
  2i	2.36	1.88	2.29
  2j	6.44	2.96	1.03
  Ascorbic acid	0.16	0.35	0.37

  在ABTS^+·自由基清除活性测试中，化合物1在此自由基清除实验中显示出最好的清除活性，约为对照品的3倍。但其衍生物大都表现欠佳，清除活性均低于母体化合物1。氨基的酰化未能观察到对该自由基清除能力的加强。说明在这个测试体系中，分子结构中的酰胺键不能有效地提高化合物清除ABTS^+·自由基的能力。

  羟自由基清除活性测试中，化合物2b的清除能力与对照品具有几乎相等的清除自由基活性，清除能力良好。而化合物2a、2b、2c、2g、2j的自由基清除能力也较母体化合物1强。表明氨基的酰化普遍提高了衍生物对羟自由基的清除能力。

  3.   结论

  设计合成了10个3-氨基-7, 8-二甲氧基香豆素的芳酰胺衍生物。体外抗氧化活性测试表明，分子中含有甲氧基修饰的化合物2b捕获DPPH及羟自由基的能力最强，而含有氨基的母体化合物1捕获ABTS^+·自由基的能力最强，二者均表现出良好的抗氧化活性，具备开发应用研究的潜在价值。在羟基自由基系统中，氨基的酰化对普遍提高衍生物抗氧化性能是有帮助的，但对ABTS^+·自由基系统来说，酰胺键的存在的减弱了衍生物的抗氧化性能，抗氧化构效关系有待更进一步的研究及更多的数据支持。

  
  
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  Scheme 1  Stynthesis of coumarin compounds with aromatic amide skeleton

  (I) RCOOH, SOCl₂; CH₂Cl₂, Triethylamine; (II) RCOOH, DCC, CH₂Cl₂

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  图 1  DPPH(A)、ABTS^+·(B)、羟基自由基(C)实验结果

  Figure 1  Scavenging results of DPPH (A), ABTS^+·(B)and ·OH(C) radicals

  Compounds:a.1; b.Vc; c.2a; d.2b; e.2c; f.2d; g.2e; h.2f; i.2g; j.2h; k.2i; l.2j

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  表 1  测定化合物对DPPH、ABTS^+·、羟自由基的清除作用

  Table 1.  Scavenging effect of compounds on DPPH, ABTS^+· and hydroxyl radical

  Compounds	IC50 (DPPH)/(mmol·L-1)	IC50(ABTS+·)/(mmol·L-1)	IC50(·OH) /(mmol·L-1)
  1	0.41	0.12	1.88
  2a	0.24	0.8	1.08
  2b	0.08	0.92	0.44
  2c	0.23	1.85	1.59
  2d	0.62	5.64	2.77
  2e	1.88	4.1	3.12
  2f	0.48	3.54	2.72
  2g	2.38	1. 47	1.52
  2h	1.48	1.48	5.02
  2i	2.36	1.88	2.29
  2j	6.44	2.96	1.03
  Ascorbic acid	0.16	0.35	0.37

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