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• 菁染料具有光谱范围较广且易控(550~1200 nm)、摩尔消光系数大(约200000 L/(mol·cm))、光响应灵敏度高、线粒体靶向特异性好、抗生物自荧光干扰能力强和生物安全性高等优点，荧光成像和光治疗的研究^[1-3]。除了光诊疗方面的报道，少量报道也指出，随着菁染料脂溶性的提高，其自身对肿瘤细胞增殖的抑制作用会明显提升^[4-5]。因此，寻找合适基团对菁染料结构进行修饰，以增强其肿瘤化疗效果，可为菁染料在抗肿瘤领域的应用提供新的思路。菁染料中三甲川菁染料合成效率更高、光稳定性更好，更具备开发为多功能化疗药物的价值^[6]。基于此，为了兼顾菁染料的水溶性和脂溶性，我们利用聚乙二醇(PEG)被普遍地应用于生物医药领域，具有双亲性(亲水性和亲酯性)、生物相容性、生物可降解性、廉价易得的特点^[7-8]，采用将PEG链键入菁染料的策略，设计合成了两种PEG修饰及结构关联的三甲川吲哚菁染料，对其进行了光谱性能和体外抗肿瘤活性研究。目标化合物合成路线如Scheme 1所示。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Synthetic routes of the title compounds

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  1.   实验部分

  1.1   试剂和仪器

  对甲苯磺酰氯、三乙二醇单甲醚、3, 5-二羟基苯甲酸甲酯、三溴化磷、氢化铝锂、3-甲基-2-丁酮、4-磺酸基苯肼、苯肼盐酸盐、N, N′-二苯甲脒、罗丹明B和二甲基亚砜(DMSO)购自安耐吉试剂有限公司，均为分析纯；噻唑蓝(MTT)检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司；MitoTracker Green FM购自美国Invitrogen公司；细胞核染色试剂DAPI购自美国Invitrogen公司；人结直肠癌细胞SW480和HCT-116购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

  PE-Lambda35型双通道紫外-可见分光光度计(UV-Vis，美国珀金埃尔默仪器责任有限公司)；FluoroSENS型稳态荧光光谱仪(FL，英国Gilden公司)；AVANCE III400 MHz型核磁共振波谱仪(NMR，德国布鲁克公司)；Amazon SL型离子阱电喷雾质谱(ESI-MS，美国布鲁克·道尔顿公司)；FV10-ASW型激光共聚焦荧光显微镜(奥林巴斯公司)；Varioskan LUX型多功能微孔板读数仪(美国赛默飞公司)。

  1.2   实验方法

  1.2.1   Cy3-DIPEG的合成

  化合物1参照文献[9]方法合成，化合物2参照文献[10]方法合成，化合物5参照文献[11]方法合成。

  向50 mL二口圆底烧瓶中加入N, N′-二苯甲脒(111.2 mg，0.57 mmol，1.0倍化学计量)，乙酸钾(168.4 mg，1.72 mmol，3.0倍化学计量)，化合物2(651.5 mg，1.13 mmol，2.0倍化学计量)，除氧30 min，加入除氧的冰乙酸5 mL和乙酸酐5 mL，搅拌10 min，氩气保护下100 ℃反应4 h。TLC监控反应结束，冷却至室温，旋蒸除去溶剂得粗品。粗品经柱层析(粒径48~75 μm硅胶，流动相：V(甲醇):V(二氯甲烷)=1:20)分离得红色固体化合物Cy3-DIPEG：235.2 mg，产率：36%; mp＞300 ℃; ¹H NMR(DMSO-d₆, 400 MHz), δ:8.36(s, 1H), 7.67(d, J=7.2 Hz, 2H), 7.42~7.29(m, 6H), 6.56(d, J=13.2 Hz, 2H), 6.50(s, 2H), 6.38(s, 4H), 5.34(s, 4H), 4.04~4.02(m, 8H), 3.68~3.66(m, 8H), 3.53~3.46(m, 24H), 3.40~3.37(m, 8H), 3.20(s, 12H), 1.70(s, 12H); ¹³C NMR(DMSO-d₆, 100 MHz), δ:174.95, 160.14, 150.67, 142.00, 140.40, 136.67, 129.64, 128.77, 125.55, 122.66, 111.81, 105.24, 103.23, 99.87, 71.25, 69.88, 69.75, 69.58, 68.79, 67.28, 58.02, 49.23, 27.44;MS(ESI):理论值[M]⁺ 1157.65, 实验值1157.72。

  1.2.2   Cy3-SO₃-DIPEG的合成

  化合物3和4参照文献[12]方法合成。

  向50 mL二口圆底烧瓶中加入N, N′-二苯甲脒(93.4 mg，0.48 mmol，1.0倍化学计量)，乙酸钾(141.2 mg，1.44 mmol，3.0倍化学计量)，化合物4(622.8 mg，0.95 mmol，2.0倍化学计量)，除氧30 min，加入除氧的冰乙酸5 mL和乙酸酐5 mL，搅拌10 min，氩气保护下100 ℃反应4 h。TLC监控反应结束，冷却至室温，旋蒸除去溶剂得粗品。粗品经柱层析(粒径48~75 μm硅胶，流动相：V(甲醇):V(二氯甲烷)=1:5)分离得红色固体化合物Cy3-SO₃-DIPEG：243.7 mg，产率：39%; mp＞300 ℃; ¹H NMR(DMSO-d₆, 400 MHz), δ:8.37(s, 1H), 7.84(s, 2H), 7.63(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.28(d, J=8.4 Hz, 2H), 6.55(d, J=13.2 Hz, 2H), 6.49(s, 2H), 6.36(s, 4H), 5.33(s, 4H), 4.04~4.02(m, 8H), 3.68~3.66(m, 8H), 3.53~3.47(m, 24H), 3.40~3.38(m, 8H), 3.20(s, 12H), 1.72(s, 12H); ¹³C NMR(DMSO-d₆, 100 MHz), δ:175.34, 160.16, 150.70, 145.93, 142.00, 139.94, 136.57, 126.40, 120.02, 111.02, 105.13, 103.71, 100.02, 71.26, 69.89, 69.77, 69.59, 68.79, 67.29, 58.04, 49.25, 27.45;MS(ESI):理论值[M]⁺1315.55, 实验值1315.60。

  1.2.3   细胞毒性实验

  用MTT比色法测试了两种染料Cy3-DIPEG和Cy3-SO₃-DIPEG对人结直肠癌细胞株(SW480和HCT-116)的体外抗肿瘤活性。待肿瘤细胞增殖至对数生长期，经胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液制备成单细胞悬液，按5000~10000个/孔均匀接种于96孔培养板中(每孔100 μL)，在37 ℃于5% CO₂细胞培养箱中孵育24 h，待细胞贴壁后吸弃培养基，加入梯度浓度的含药培养基100 μL，浓度设置为0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L，每个浓度设5个复孔，另设只加培养基的空白组。置于37 ℃、5%CO₂细胞培养箱中继续培养48 h后，取出96孔板加入5 mg/mL的MTT溶液15 μL，继续培养4 h后吸弃板孔中培养液，每孔加入100 μL的DMSO，置脱色摇床避光轻轻振荡10 min，直至甲瓒充分溶解。用酶标仪在490 nm处测定OD值，通过式(1)计算两种染料各浓度下细胞生长抑制率(Inhibition rate，IR)。以抑制率对染料浓度作图，求出两个染料的半数抑制浓度(IC₅₀)值。

  $ {\rm{IR}} = \left( {{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{control }}}} - {\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{sample }}}}} \right)/\left( {{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{control }}}} - {\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{normal }}}}} \right) \times 100\% $

  (1)

  1.2.4   细胞染色

  将接种好的SW480结直肠癌细胞与1.0 μmol/L的吲哚菁染料孵育1 h，吸弃培养基，PBS缓冲溶液洗涤3次，加入0.2 mol/L的Mito Tracker Green FM孵育10 min，吸弃培养基，PBS溶液洗涤3次，再加入2.0 μg/mL的核酸染料DAPI孵育10 min，移除培养基，PBS溶液洗涤3次。最后在激光共聚焦显微镜下进行荧光检测，分别拍摄其明场和荧光图像。

  2.   结果与讨论

  2.1   目标染料的合成

  采用克脑文盖尔(Knoevenagel)缩合反应，通过“一步法”合成了两种三甲川菁染料，反应过程中必须使用乙酸酐和乙酸钾为反应提供碱性环境。Cy3-DIPEG和Cy3-SO₃-DIPEG均经过了¹H NMR、¹³C NMR和MS的表征，产率约40%。投料时，化合物2和化合物4与缩合剂N, N′-二苯甲脒的化学计量比应严格控制为2:1，因为反应物和目标染料均为有机离子型化合物，无论哪个化合物过多残留均会对后续柱层析分离带来困难。反应中要严格控制氧气含量，氧气过多会造成反应物和目标染料在高温时进一步氧化，目标染料的产率会降低至25%以下。柱层析分离时，结构中PEG链会使目标染料的极性比同类含有羧基的三甲川染料小，不必使用反相硅胶柱，使用正相硅胶柱就能分离，使分离成本降低。

  2.2   目标染料的光谱性能

  配制染料浓度为5×10^-6 mol/L的H₂O和DMSO溶液，分别测定UV-Vis光谱和FL光谱，参照文献[13]的方法计算其摩尔消光系数和荧光量子产率。表 1列出了染料在不同溶剂中的光谱数据，图 1和图 2为染料在两种溶剂中的UV-Vis光谱和FL光谱。可见，两种染料在H₂O和DMSO中的最大紫外吸收波长和荧光发射波长在红光区，荧光成像时能有效避免生物自荧光的干扰。与H₂O溶液对比，两种染料DMSO溶液中的最大吸收和发射波长发生了红移，这是由于DMSO极性弱于H₂O的极性，DMSO对分子激发态的溶剂效应较强，有利于激发态稳定的原因。

  表 1

  

  表 1  Cy3-DIPEG和Cy3-SO₃-DIPEG在H₂O和DMSO中的光学性能参数

  Table 1.  The optical properties of Cy3-DIPEG and Cy3-SO₃-DIPEG in H₂O and DMSO

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  Dyes	Solvent	λab/nm	λem/nm	Stoke shift/nm	ε/(L·mol-1·cm-1)	Φ
  Cy3-DIPEG	H2O	550	567	17	98 600	0.06
  	DMSO	557	573	16	99 300	0.19
  Cy3-SO3-DIPEG	H2O	555	569	14	123 800	0.13
  	DMSO	568	583	15	99 300	0.20

  图 1

  

  图 1.  染料Cy3-DIPEG和Cy3-SO₃-DIPEG在H₂O和DMSO中UV-Vis吸收光谱和荧光发射(FL)光谱

  Figure 1.  UV-Vis absorption and FL spectra of Cy3-DIPEG (A) and Cy3-SO₃-DIPEG (B) in H₂O and DMSO

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  图 2

  

  图 2.  染料Cy3-DIPEG、Mito Tracker Green FM、DAPI在SW480细胞中的激光共聚焦成像图

  Figure 2.  Laser confocal images of Cy3-DIPEG, Mito Tracker Green FM and DAPI in SW480 cells

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  菁染料的荧光量子产率易受溶剂和自身二聚体的影响。两种染料在DMSO中的Ф值均大于在水中的Ф值，这可能是由于菁染料在质子性溶剂水中有氢键生成的缘故。图 1A和1B中最大紫外吸收左侧的肩峰为菁染料二聚体的吸收峰，二聚体引起荧光淬灭，对菁染料的荧光光谱没有贡献^[14]，所以图 1中荧光光谱为一单峰。从图 1A和1B分析可知，在水溶液中Cy3-DIPEG二聚体紫外吸收强度比Cy3-SO₃-DIPEG大20%左右，说明Cy3-DIPEG在水中的聚集程度大于Cy3-SO₃-DIPEG，Cy3-DIPEG在水中的Ф值约是Cy3-SO₃-DIPEG在水中Ф值的1/2。

  2.3   体外抗肿瘤活性

  采用MTT法测试了两种染料对SW480和HCT-116的体外抗肿瘤活性。所有数据采用GraphPadPrism8应用软件进行统计学分析，实验数据均以(Mean±SD)表示，实验结果见表 2。Cy3-DIPEG对SW480和HCT-116的IC₅₀值分别为22和26 μmol/L，表现出显著的抗结直肠癌细胞活力的活性，而Cy3-SO₃-DIPEG对两种细胞株的IC₅₀值均大于100 μmol/L，表现出低的化学毒性。Cy3-DIPEG和Cy3-SO₃-DIPEG具有结构关联性，它们却对人结直肠癌细胞表现出极为明显的抑制作用差异，我们可以通过亚细胞器定位实验来分析原因。染料对SW480共染实验结果见图 2和图 3。图 2显示Cy3-DIPEG能穿过细胞膜蓄积在线粒体上，认为其是通过损伤线粒体结构来影响肿瘤细胞的供能体系，进而诱导细胞凋亡或坏死^[15]，图 3显示Cy3-SO₃-DIPEG对细胞无染色能力，说明其无法透膜进入细胞内引起细胞死亡，这可能与其较好的水溶性有关。

  表 2

  

  表 2  两种染料对人结直肠癌细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)

  Table 2.  The half inhibitory concentrations of two dyes to Anti-colorectal Cancer

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  Compounds	IC50/(μmol·L-1)
  	SW480	HCT-116
  Cy3-DIPEG	22±0.09	26±0.08
  Cy3-SO3-DIPEG	＞100	＞100

  图 3

  

  图 3.  染料Cy3-SO₃-DIPEG、Mito Tracker Green FM、DAPI在SW480细胞中的激光共聚焦成像图

  Figure 3.  Laser confocal images of Cy3-SO₃-DIPEG、Mito Tracker Green FM and DAPI in SW480 cells

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  3.   结论

  通过在吲哚氮原子上修饰PEG链，合成了两种双亲性三甲川花菁染料，其结构经过了核磁共振和质谱的表征。对比发现，Cy3-DIPEG能有效地蓄积于肿瘤细胞线粒体，对人结直肠癌细胞株(SW480和HCT-116)的半数抑制浓度(IC₅₀)值分别为22和26 μmol/L，能显著抑制人结直肠癌细胞增殖，是一种易于开发的既有细胞成像能力又有抗肿瘤活性的多功能小分子化疗药物，具备潜在的成药价值。

  
  
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  Scheme 1  Synthetic routes of the title compounds

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  图 1  染料Cy3-DIPEG和Cy3-SO₃-DIPEG在H₂O和DMSO中UV-Vis吸收光谱和荧光发射(FL)光谱

  Figure 1  UV-Vis absorption and FL spectra of Cy3-DIPEG (A) and Cy3-SO₃-DIPEG (B) in H₂O and DMSO

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  图 2  染料Cy3-DIPEG、Mito Tracker Green FM、DAPI在SW480细胞中的激光共聚焦成像图

  Figure 2  Laser confocal images of Cy3-DIPEG, Mito Tracker Green FM and DAPI in SW480 cells

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  图 3  染料Cy3-SO₃-DIPEG、Mito Tracker Green FM、DAPI在SW480细胞中的激光共聚焦成像图

  Figure 3  Laser confocal images of Cy3-SO₃-DIPEG、Mito Tracker Green FM and DAPI in SW480 cells

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  表 1  Cy3-DIPEG和Cy3-SO₃-DIPEG在H₂O和DMSO中的光学性能参数

  Table 1.  The optical properties of Cy3-DIPEG and Cy3-SO₃-DIPEG in H₂O and DMSO

  Dyes	Solvent	λab/nm	λem/nm	Stoke shift/nm	ε/(L·mol-1·cm-1)	Φ
  Cy3-DIPEG	H2O	550	567	17	98 600	0.06
  	DMSO	557	573	16	99 300	0.19
  Cy3-SO3-DIPEG	H2O	555	569	14	123 800	0.13
  	DMSO	568	583	15	99 300	0.20

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  表 2  两种染料对人结直肠癌细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)

  Table 2.  The half inhibitory concentrations of two dyes to Anti-colorectal Cancer

  Compounds	IC50/(μmol·L-1)
  	SW480	HCT-116
  Cy3-DIPEG	22±0.09	26±0.08
  Cy3-SO3-DIPEG	＞100	＞100

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