具有过氧化物酶活性的Imm-Fe3+-IL的制备及用于比色法测定H2O2和葡萄糖

喻昌木 张荣 卢小鸾 杨敏 彭黔荣

引用本文: 喻昌木, 张荣, 卢小鸾, 杨敏, 彭黔荣. 具有过氧化物酶活性的Imm-Fe3+-IL的制备及用于比色法测定H2O2和葡萄糖[J]. 应用化学, 2020, 37(10): 1211-1220. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2020.10.200064 shu
Citation:  YU Changmu, ZHANG Rong, LU Xiaoluan, YANG Min, PENG Qianrong. Preparation of Imm-Fe3+-IL with Peroxidase Activity and Its Colorimetric Determination of H2O2 and Glucose[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2020, 37(10): 1211-1220. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2020.10.200064 shu

具有过氧化物酶活性的Imm-Fe3+-IL的制备及用于比色法测定H2O2和葡萄糖

    通讯作者: 杨敏, 教授; Tel:0851-85588075;E-mail:2578973180@qq.com; 研究方向:催化材料的合成与应用; 彭黔荣, 副教授; Tel:0851-83981462;E-mail:3435391@qq.com; 研究方向:烟草化学与工程
  • 基金项目:

    国家自然科学基金资助(21562014)、贵州中烟科技(黔烟工技[2015]8号)项目

摘要: 通过溶胶-凝胶法制备的Imm-Fe3+-IL纳米材料具有类过氧化物酶的活性,能够催化过氧化氢(H2O2)快速氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)产生相应的颜色变化。稳态动力学分析表明,Imm-Fe3+-IL纳米材料遵循典型的Michaelis-Menten模型和乒乓机理。辣根过氧化物酶(HRP)相比,Imm-Fe3+-IL纳米材料纳米材料具有更强的亲和性。联合葡萄糖氧化酶建立了H2O2和葡萄糖的比色检测方法。结果显示:H2O2和葡萄糖的浓度与反应体系的吸光度呈良好的线性关系,H2O2的线性范围为1~200 μmol/L,葡萄糖的线性范围为10~200 μmol/L,最低检出限(LOD)分别为0.35和3.31 μmol/L。

English

  • 过氧化氢(H2O2)作为环境和生物过程中的关键中间体,以及细胞信号转导的信使,在生物体中起着重要作用[1]。葡萄糖是人体内不可缺少的一种物质,是细胞新陈代谢的能量来源。人类的生理健康和疾病都与葡萄糖的浓度密切相关,如糖尿病、中风、失明、肾衰竭、周围神经病变等疾病[2-4]。在生物体内,在葡萄糖氧化酶(GOx)的作用下将葡萄糖氧化葡萄糖醛酸和H2O2;在过氧化物酶的催化作用下,将H2O2分解为氧气或氧化合适的底物。因此,H2O2和葡萄糖的准确检测在食品、制药、临床、工业和环境保护等许多领域都非常重要[5]

    酶是由活细胞产生的一类具有催化功能的有机分子,过氧化物酶属于天然酶,具有催化效率高、底物专一、反应条件温和等特点。由于酶的化学本质是蛋白质,在酸、碱、热等非生理环境中容易发生结构变化而失活[6]。而纳米材料模拟酶具有成本低、稳定性好和易于存储的优点[7],所以具有酶类活性的纳米材料日益成为研究的热点。比色法是一种快速、方便的H2O2和葡萄糖检测方法。与其它荧光[8]、化学发光[9]和电化学[10]比较,比色分析方法具有成本低、方便、快速、实用等特点,并且可以用肉眼观察到底物的颜色变化[11]。Wang等[12]通过共沉淀法制备了Fe3O4磁性纳米材料(Fe3O4 MNPs)具有过氧化物酶活性,在H2O2存在下,将制备好的Fe3O4 MNP催化过氧化物酶底物2, 2′-叠氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)氧化成有色产物。使用GOx和Fe3O4 MNP开发了一种灵敏且选择性的葡萄糖检测方法。其葡萄糖的线性范围为5×10-5~1×10-3 mol/L,最低检测限(LOD)为3×10-5 mol/L。Guo等[13]通过共沉淀法制备Fe3(PO4)2·8H2O纳米花具有过氧化物酶的活性。研究表明:Fe3(PO4)2·8H2O纳米花比辣根过氧化物酶(HRP)对H2O2和3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB)具有更强的结合亲和力。开发了基于Fe3(PO4)2·8H2O纳米花的比色平台,以确定H2O2和葡萄糖。H2O2和葡萄糖的线性范围分别为1.0×10-8~2.5×10-3 mol/L和8.0×10-7~1.2×10-3 mol/L,LOD分别低至5 nmol/L和35 nmol/L。Aghayan等[14]通过溶胶-凝胶法制备的Fe修饰的介孔二氧化硅纳米粒子(Fe-MSN)纳米材料具有过氧化物酶的活性。采用制备的Fe-MSN模拟过氧化物酶催化H2O2氧化底物TMB产生可溶性的蓝色产物。联合GOx建立了H2O2和葡萄糖的比色检测平台。其H2O2和葡萄糖的线性范围分别为7.2~100 μmol/L和4.1~100 μmol/L,最低检测限均为1.2 μmol/L。迄今为止,已发现许多过氧化物酶模拟物如Fe3O4-Cu2+[15]、PCN-222(Fe)[16]、石墨烯量子点-铜氧化物纳米复合材料(GQDs/CuO)[17]、镍铁层双氢氧化物纳米片(NiFe-LDHNS)[18]、三磷酸腺苷二钠盐(ATP)-Fe3O4纳米粒子[19]NN′-二羧甲基二酰亚胺(PDI)-Fe3O4纳米粒子[20],并成功开发并应用于H2O2和葡萄糖的检测。

    离子液体具有独特的溶剂性能,可以溶解有机、无机、金属化合物和气体[21],固载功能化离子液体是一类集功能化离子液体和载体的优点于一身的新材料和催化剂[22]。SiO2固载咪唑鎓离子液体金属催化剂,可以催化Heck反应[23]、Suzuki反应[24]、烯烃的环氧化[25]、不对称环氧化[26]和烯丙位氧化反应[27-28],但是未见其用于H2O2和葡萄糖的检测。我们推测制备简单的SiO2固载咪唑氯鎓离子液体-Fe3+催化剂可能具有过氧化物酶的活性,可用于比色法测定H2O2和葡萄糖。

    因此,本研究以N-甲基咪唑和3-氯丙基三乙氧基硅烷(CPTES)为原料合成中间体为1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑氯鎓盐,在碱性条件下与模板剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)通过溶胶-凝胶法制得离子液体修饰有序介孔氧化硅材料,再与无水FeCl3进行配位螯合制得离子液体的固载化(Imm)-Fe3+-IL。测试表明Imm-Fe3+-IL纳米材料具有类过氧化物酶的活性,能够催化过氧化氢(H2O2)快速氧化TMB产生相应的颜色变化。因此,构建了一种简单、快速的H2O2和葡萄糖的比色检测方法,其检出限分别为0.35和3.31 μmol/L。

    3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB)、蔗糖、葡萄糖和麦芽糖,均为分析纯试剂,购自阿拉丁试剂(上海)有限公司;98%葡萄糖氧化酶(GOx,来源于黑曲霉,购自北京百灵威科技有限公司);无水乳糖(分析纯),乙酸钠三水合物(优级纯),购自苏州市麦克林医疗器械制品有限公司;30%过氧化氢(H2O2,分析纯),购贵州博奥瑞杰生物科技有限公司;磷酸二氢钠、CTAB和γ-氯丙基三乙氧基硅烷,均为分析纯试剂,购自国药集团化学试剂有限公司;柠檬酸,无水三氯化铁,均为分析纯试剂,购自萨恩化学技术(上海)有限公司;N-甲基咪唑(分析纯),购自常州市中凯化工有限公司;氨水(分析纯),购自成都金山化学试剂有限公司,原硅酸四乙酯(TEOS,分析纯)购自成都科龙化工试剂公司。

    采用S-3400N型扫描电子显微镜(SEM,日本HITACHI(日立)公司)对产物的表面微观形态进行表征;采用Nicolet is5型傅里叶转换红外光谱图(FTIR,美国赛默飞世尔)对产物进行红外光谱扫描;UV-9000型紫外可见光分光光度计(UV-Vis,上海元析仪器有限公司)。

    Imm-Fe3+-IL纳米材料的制备路线如Scheme 1所示。

    Scheme 1

    Scheme 1.  Synthesis of Imm-Fe3+-IL
    1.2.1   中间体1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑氯鎓盐(IL)的合成

    首先根据文献[29-30]制备中间体,具体步骤如下:将新蒸馏的N-甲基咪唑(0.05 mol,4 mL)加入到回流装置的50 mL干燥的两口烧瓶中,在搅拌下向烧瓶中缓慢滴加(20 min内滴完)0.05 mol(12 mL)3-氯丙基三乙氧基硅烷(CPTES),在110 ℃条件下剧烈搅拌,用薄层色谱(TLC,展开剂V(甲醇):V(二氯甲烷)=1:1)跟踪反应,反应48 h后结束,体系呈淡黄色粘稠液体。将体系冷却至室温,向混合产物中加入10 mL×3乙醚洗涤使其剧烈搅拌,然后静置移走上层液体,再在30 ℃下旋蒸除去乙醚溶剂,最后在60 ℃下真空干燥6 h得到纯的1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑氯鎓盐中间体(IL)。

    1.2.2   Imm-IL合成

    参考文献[31],将1.02 g(2.8 mmol)CTAB、6.15 mL(160 mmol)NH3·H2O和36 mL H2O加入到100 mL圆底烧瓶中在80 ℃下搅拌30 min,然后向上述溶液中滴加4.16 mL(20 mmol)TEOS和1.13 g(1.6 mmol)IL的混合溶液,在80 ℃下搅拌4 h后将温度升高到100 ℃陈化24 h。反应完后,待冷却至室温后,进行过滤用H2O洗涤滤饼,然后在60 ℃下真空干燥24 h。将所得固体下加入150 mL乙醇和5 mL HCl(37%)的溶液中,并将混合物在50 ℃中搅拌6 h除去表面活性剂。然后过滤并用乙醇(20 mL×3)洗涤,并在60 ℃下干燥24 h。得到白色粉末材料(Imm-IL)。

    1.2.3   Imm-Fe3+-IL的合成

    参考文献[32],将上述制备的Imm-IL(0.5 g)和无水的三氯化铁(0.5 g,FeCl3)在乙腈中回流24 h,最后过滤并洗涤,在真空60 ℃下干燥6 h,得到淡黄色的产物(Imm-Fe3+-IL)。

    通过在H2O2存在下,Imm-Fe3+-IL纳米材料作为模拟酶催化底物TMB的氧化来评估其过氧化物酶的催化活性。催化实验如下:混合物由300 μL Imm-Fe3+-IL(0.35 mg/mL),300 μL H2O2(80 mmol/L),300 μL NaAc缓冲溶液(50 mmol/L,pH=3)和300 μL TMB(7 mmol/L)在50 ℃下孵育20 min。然后,记录了在652 nm处的UV-Vis吸收光谱。

    此外,研究了缓冲溶液pH值(2~9)、孵育温度(20~80 ℃)和催化剂Imm-Fe3+-IL浓度(0~0.5 mg/mL)对Imm-Fe3+-IL的过氧化物酶活性的影响。

    为了研究Imm-Fe3+-IL的稳态动力学,通过许多实验计算了两个最重要的动力学参数:米氏常数(Km,单位为mmol/L)和最大反应速率(vmax,单位为mol/(L·s))。首先,保持TMB浓度恒定并改变H2O2浓度(0.1~1.0 mmol/L),混合溶液由乙酸钠缓冲液(300 μL,50 mmol/L,pH=3)、Imm-Fe3+-IL(300 μL,0.35 mg/mL)以及TMB和H2O2溶液,并在50 ℃下反应20 min。最后,通过UV-Vis在652 nm处记录混合物的吸光度。类似地,通过在相同条件下保持H2O2浓度和改变TMB浓度来研究用于以H2O2为底物进行动力学分析。

    通过从Michaelis-Menten方程导出的Lineweaver-Burk图以计算酶动力学参数,详见式(1)和(2):

    $ A = kbc $

    (1)

    $ \frac{1}{v} = \frac{{{K_{\rm{m}}}}}{{{v_{\max }}}}\left( {\frac{1}{{{K_{\rm{m}}}}} + \frac{1}{{\left[ {\rm{S}} \right]}}} \right) $

    (2)

    式中,v是反应的初始速度,vmax是最大反应速率(mol/(L·s)),[S]是底物的浓度(mmol/L),Km是代表酶亲和力的米氏常数(mmol/L)[33-34]。在此,根据Lambert-Beer定律对Ox-TMB浓度进行定量,其中,A为吸光度,b为溶液的厚度(cm),c为Ox-TMB的物质的量浓度(mmol/L),k为摩尔吸收系数。通常被认为是39000 cm-1[35]

    在典型的检测和测量中:1)将300 μL TMB(7.0 mmol/L),300 μL Imm-Fe3+-IL储备溶液(0.35 mg/mL)和不同浓度的H2O2溶液(0.001~1 mmol/L)加入到2 mL乙酸盐缓冲液(pH=3.0,50 mmol/L);2)将混合溶液在50 ℃温育20 min;3)用分光光度计测量所得反应混合物的吸光度变化。

    葡萄糖的检测步骤:1)将200 μL,浓度为1.0 mg/mL的GOx和1.0 mL的不同葡萄糖浓度加入1 mL的磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.0)中混合并在37 ℃下温育30 min。2)将300 μL的TMB(4 mmol/L),浓度为0.35 mg/mL的Imm-Fe3+-IL催化剂和2 mL的乙酸盐缓冲液中(50 mmol/L,pH=3)加入到上述的混合物中并在50 ℃下温育20 min,最后用UV-Vis测量其混合物的吸光度的变化。

    为了评估Imm-Fe3+-IL纳米材料的长期储存稳定性,将Imm-Fe3+-IL纳米材料在含有0.35 mg/mL的水溶液中室温条件下储存7 d,每天记录其吸光度值得变化。

    为了测试葡萄糖检测的选择性,使用蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖代替葡萄糖进行对照实验,对照样品的浓度是葡萄糖的浓度的5倍。

    通过溶胶-凝胶法合Imm-Fe3+-IL纳米材料,产物的颜色为淡黄色粉末并且能够很好地分散在水中。图 1为Imm-IL和Imm-Fe3+-IL的FT-IR谱图。

    图 1

    图 1.  Imm-IL和Imm-Fe3+-IL纳米材料的FT-IR谱图
    Figure 1.  FT-IR spectra of Imm-IL and Imm-Fe3+-IL nanomaterials

    图 1中可以得出,1575 cm-1出现的振动峰归因于咪唑环上的C=C的吸收峰;1636 cm-1左右的峰是吸附水的弯曲振动峰;3405 cm-1是可能含有少量的水中OH的伸缩振动峰;1077 cm-1左右的峰归因于咪唑的H—C—N的弯曲振动;2978、2738和1390 cm-1左右的峰带分别为甲基上的C—H的反对称伸缩振动、对称伸缩振动和弯曲振动;802 cm-1左右的峰归因于Si—O—Si的伸缩振动;728 cm-1左右的峰是FeCl4的峰。这证明了已经成功合成了Imm-Fe3+-IL。

    Imm-Fe3+-IL的SEM图(如图 2所示)显示所制备的Imm-Fe3+-IL呈颗粒状,颗粒轮廓分明,并且表面光滑柔软;进一步放大到3000倍时候,可以显示出非常均匀的颗粒(图 2B)。

    图 2

    图 2.  Imm-Fe3+-IL纳米材料的SEM照片
    Figure 2.  SEM images of Imm-Fe3+-IL nanomaterial

    在H2O2存在下,通过在过氧化物酶底物TMB的催化氧化下来评估Imm-Fe3+-IL的过氧化物酶活性。过氧化物酶底物TMB是一种典型的生色试剂,经常与过氧化物酶一起使用,可以将H2O2还原为H2O,用于检测Imm-Fe3+-IL纳米材料的过氧化物酶样活性。如图 3所示,图 3谱线a是H2O2+TMB+Imm-Fe3+-IL体系,在H2O2和TMB混合溶液中添加Imm-Fe3+-IL之后,体系呈现明显的蓝色,并在652 nm处出现很大的吸收峰。图 3谱线b是TMB+Imm-Fe3+-IL体系,可以看出在没有H2O2的情况下,体系在652 nm有特征吸收峰。表明在没有H2O2的存在下,Imm-Fe3+-IL表现出过氧化氢酶的活性。图 3谱线c是H2O2+Imm-Fe3+-IL体系,没有TMB存在,所以在652 nm处无TMB的特征吸收。表明Imm-Fe3+-IL在H2O2存在下能氧化TMB使溶液变蓝,并且在652 nm处有最大吸收,具有很好的类过氧化物酶活性。

    图 3

    图 3.  不同反应体系溶液的紫外可见吸收图谱,插图为相应的颜色变化照片
    Figure 3.  UV-Vis absorption spectra of different reaction system solutions. The inset is the photo corresponding color change

    a.H2O2+TMB+Imm-Fe3+-IL; b.TMB+Imm-Fe3+-IL; c.H2O2+Imm-Fe3+-IL

    天然的HRP和其它基于纳米材料的过氧化物酶的催化活性取决于pH值和温度。因此,进一步研究了pH值、孵育温度、H2O2的浓度、TMB的浓度和催化剂浓度对Imm-Fe3+-IL的催化活性的影响(见辅助材料图S1)。考察了pH值在2~9之间,温度从20~80 ℃变化对Imm-Fe3+-IL的过氧化物酶样活性的影响(见辅助材料图S1A和S1B),结果发现,当pH=3、反应温度为50 ℃时,体系的吸光度达到最大值。其中,pH值对体系反应的影响较大,当pH值逐渐增加时,其吸光度值逐渐降低,当pH值为7~9时,基本无反应活性。当反应温度20~50 ℃,体系的吸光度随着温度的增加而增加;当温度达到50 ℃时,体系的吸光度达到最大值;当反应温度在50~80 ℃时,体系的吸光度逐渐降低。表明了合成的Imm-Fe3+-IL具有类似酶的活性。因此,选择了pH=3,50 ℃作为后续实验的标准条件。辅助材料图S1C、S1D和S1E表明,在652 nm处的吸光度值会随着H2O2或TMB浓度或催化剂浓度的增加而增加。另外,在催化剂浓度达到0.5 mg/mL或H2O2浓度高达100 mmol/L或TMB浓度高达10.0 mmol/L时,没有发现Imm-Fe3+-IL催化反应的抑制,表明Imm-Fe3+-IL在高催化剂浓度或高H2O2或TMB浓度下也表现出稳定的催化活性。因此,本文采用相对高浓度的催化剂浓度(0.35 mg/mL)、H2O2(80 mmol/L)和TMB(7 mmol/L)进行后续实验。

    为了开发基于过氧化物酶的传感器,重要的是确定表观稳态动力学参数,例如Michaelis-Menten常数(Km)和最大反应初始速度(vmax)。观察到TMB和H2O2的典型Michaelis-Menten曲线(见辅助材料图S2A和S2C)和相应的Lineweaver-Burk图(见辅助材料图S2B、S2D、S2E和S2F),Michaelis-Menten常数(Km)和最大反应初始速度(vmax)。从辅助材料图S2E和S2F可见所有线的斜率是平行的,表明符合典型的乒乓机制[36]。表明了Imm-Fe3+-IL纳米材料首先与第一底物结合并反应,生成第一产物,然后与第二底物反应。Km是米氏常数,它反映了纳米酶对其底物的亲和力。Km值越高,对底物的亲和力越低,反之,Km值越低,对底物的亲和力越高。动力学参数的总结如辅助材料表S1所示,Imm-Fe3+-IL对TMB的Kmvmax值为0.324 mmol/L和8.03×10-8 mol/(L·s),对H2O2的值为0.467 mmol/L和1.79×10-8 mol/(L·s)。值得注意的是,Imm-Fe3+-IL与TMB和H2O2Km值低于HRP,表明Imm-Fe3+-IL对TMB和H2O2的亲和力高于对HRP的亲和力。对于底物H2O2和TMB,该催化剂Imm-Fe3+-IL的Km值均低于其它具有过氧化物酶活性的纳米材料Pt/PCN、5, 10, 15, 20-四(4-羧苯基)-卟啉(H2TCPP)-Fe3O4β-环糊精(β-CD)-CuNCs、GO-Fe3O4、Ag@Fe3O4。这进一步证实了Imm-Fe3+-IL纳米材料可以用作替代过氧化物酶的人工模拟酶。

    Imm-Fe3+-IL纳米材料的催化活性依赖于H2O2浓度,开发了基于Imm-Fe3+-IL纳米材料的传感器,用于比色定量检测H2O2图 4A显示了在最佳条件下,当H2O2浓度从1 μmol/L到0.1 mmol/L,在652 nm处测量的典型H2O2浓度-响应曲线。从该图中,可以观察到随着H2O2浓度增加,吸光度逐渐增加。此外,同源线性校准曲线(图 4B)表现出H2O2浓度在1~200 μmol/L范围内的线性相关性,其线性方程为y=0.0557+1.30082x(y是吸收值,x是H2O2浓度),相关系数为0.99458。LOD为0.35 μmol/L,根据信号计算,相当于空白标准偏差3倍。其中LOD精确度(相对标准偏差(RSD%))计算为0.213%(n=5)。与其它铁基过氧化物酶模拟物相比,例如Fe3O4、PDI-Fe3O4、Fe3O4-Cu2+、PDI-Fe3O4、PCN-222(Fe)、Fe-MSN以及CoFe-LDHs,Imm-Fe3+-IL具有一个更宽的线性检测范围和低的检测限,如表 2所示。

    图 4

    图 4.  (A) H2O2浓度与吸光度的剂量-响应曲线以及(B)同源性校准曲线
    Figure 4.  (A) Dose-response curve of H2O2 concentration vs absorbance and (B) the homology calibration curve

    表 1

    表 1  比较了检测H2O2的传感材料的性能
    Table 1.  Comparison of the performance of sensing materials for detecting H2O2
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    Catalyst Method Linear range/(μmol·L-1) LOD/(μmol·L-1) References
    Imm-Fe3+-IL Colorimetry 1~200 0.35 This work
    PDI-Co3O4 NPs Colorimetry 3~60 2.37 [11]
    Fe3O4 Colorimetry 5~100 3 [12]
    Fe-MSN Colorimetry 7.2~100 1.2 [14]
    Fe3O4-Cu2+ Colorimetry 2.5~100 0.212 [15]
    PCN-222(Fe) Colorimetry 3~200 1 [16]
    GQDs/CuO Colorimetry 2~100 0.59 [17]
    PDI-Fe3O4 Colorimetry 1~100 2 [20]

    表 2

    表 2  检测葡萄糖的纳米材材料的性能比较
    Table 2.  Performance comparison of nanomaterials for glucose detection
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    Catalyst Method Line range/(μmol·L-1) LOD/(μmol·L-1) References
    Imm-Fe3+-IL Colorimetry 10~200 3.31 This work
    Fe3O4 Colorimetry 50~1 000 30 [12]
    NiFe-LDHNS Colorimetry 50~2 000 23 [18]
    ATP-Fe3O4 MNPs Colorimetry 50~1 000 50 [19]
    N-GQDs Colorimetry 25~375 16 [38]
    CuNCs Colorimetry 100~2 000 100 [39]
    Cu-SBA-15 Colorimetry 2~80 5.4 [40]

    现如今,葡萄糖的鉴定和检测是非常必要的,特别是在化学,制药和医疗行业的各个部分。此外,H2O2是葡萄糖氧化酶(GOx)催化葡萄糖氧化的主要产物之一;开发了基于纳米材料具有过氧化物酶活性的比色传感器,用于间接检测葡萄糖[12, 37]。一般机制包括两个步骤,首先葡萄糖与GOx和O2相互作用,产生葡萄糖醛酸和H2O2,并在Imm-Fe3+-IL存在下用H2O2催化过氧化物酶底物TMB氧化成蓝色产物(Scheme 2)。

    Scheme 2

    Scheme 2.  Schematic diagram for glucose colorimetric determination in combination with glucose oxidase (GOx)

    图 5A显示了在最佳条件下在652 nm处测量了葡萄糖浓度从1 μmol/L到0.1 mmol/L的典型葡萄糖浓度-响应曲线。从该图中,可以观察到随着葡萄糖浓度增加,吸光度逐渐增加的明显趋势。此外,同源线性校准曲线(图 5B)表现出葡萄糖浓度在10~200 μmol/L范围内的线性相关性,其线性方程为y=0.04767+0.26221x(y是吸收值,x是葡萄糖浓度),相关系数为0.9929。检测限(LOD)为3.31 μmol/L,根据信号计算,相当于空白标准偏差的3倍。其中LOD的精确度(相对标准偏差(RSD/%))计算为0.34%(n=5)。与表 2中列出的其它酶类纳米材料如Fe3O4、NiFe-LDHNS、ATP-Fe3O4 MNPs、N-GQDs、CuNCs和Cu-SBA-15相比,Imm-Fe3+-IL纳米材料具有更灵敏的线性范围和低的检测限。

    图 5

    图 5.  (A) 葡萄糖浓度与吸光度的剂量-响应曲线以及(B)同源性校准曲线
    Figure 5.  (A) Dose-response curve of glucose concentration vs absorbance and (B) the homology calibration curve

    为了测试葡萄糖检测的选择性,使用蔗糖,果糖,乳糖和麦芽糖进行对照实验。比色法的选择性如图 6A所示。即使对照样品的浓度是葡萄糖浓度的5倍,含葡萄糖样品的吸光度也远高于对照样品。此外,肉眼观察到葡萄糖样品的蓝色变化,而对照样品的颜色变化可忽略不计。因此,此处开发的比色法显示出对葡萄糖检测的高选择性。

    图 6

    图 6.  (A) 与其它糖(对照样品)相比,葡萄糖检测的选择性和(B)Imm-Fe3+-IL的长期储存稳定性(误差棒表示3次试验的标准偏差)
    Figure 6.  Selectivity of glucose detection compared to other sugars (control samples) and (B) Long-term storage stability of Imm-Fe3+-IL (error bars represent standard deviation of 3 trials)

    Imm-Fe3+-IL模拟酶显示出比天然过氧化物酶更好的稳定性。为了评估长期储存稳定性,将Imm-Fe3+-IL在室温下储存在含有0.35 mg/mL的水溶液中超过7 d,结果表明催化剂达到了约85%的初始活性,表明Imm-Fe3+-IL具有良好的长期储存稳定性(图 6B)。

    通过溶胶-凝胶法制备的Imm-Fe3+-IL纳米材料,已经证明其具有高效的内在过氧化物酶样活性,在H2O2存在下催化底物3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB)的氧化并产生蓝色反应。动力学分析表明,符合典型的米氏方程和遵循乒乓机制。基于Imm-Fe3+-IL纳米材料的过氧化物酶活性,可以检测H2O2,其线性范围为1~200 μmol/L,最低检测限为0.35 μmol/L。当与葡萄糖氧化酶(GOx)偶联时,葡萄糖可以在10~200 μmol/L的范围内呈现良好的线性关系,葡萄糖最低检测限为3.31 μmol/L。这些发现意味着Imm-Fe3+-IL纳米材料具有构建低成本和简单的生物传感器的有巨大潜力,可用于测定生物学上重要的分析物,如葡萄糖和过氧化氢。

    辅助材料(Supporting Information)[Imm-Fe3+-IL催化条件的优化、Imm-Fe3+-IL的稳态动力学测定]可以免费从本刊网站(http://yyhx.ciac.jl.cn/)下载。


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  • Scheme 1  Synthesis of Imm-Fe3+-IL

    图 1  Imm-IL和Imm-Fe3+-IL纳米材料的FT-IR谱图

    Figure 1  FT-IR spectra of Imm-IL and Imm-Fe3+-IL nanomaterials

    图 2  Imm-Fe3+-IL纳米材料的SEM照片

    Figure 2  SEM images of Imm-Fe3+-IL nanomaterial

    图 3  不同反应体系溶液的紫外可见吸收图谱,插图为相应的颜色变化照片

    Figure 3  UV-Vis absorption spectra of different reaction system solutions. The inset is the photo corresponding color change

    a.H2O2+TMB+Imm-Fe3+-IL; b.TMB+Imm-Fe3+-IL; c.H2O2+Imm-Fe3+-IL

    图 4  (A) H2O2浓度与吸光度的剂量-响应曲线以及(B)同源性校准曲线

    Figure 4  (A) Dose-response curve of H2O2 concentration vs absorbance and (B) the homology calibration curve

    Scheme 2  Schematic diagram for glucose colorimetric determination in combination with glucose oxidase (GOx)

    图 5  (A) 葡萄糖浓度与吸光度的剂量-响应曲线以及(B)同源性校准曲线

    Figure 5  (A) Dose-response curve of glucose concentration vs absorbance and (B) the homology calibration curve

    图 6  (A) 与其它糖(对照样品)相比,葡萄糖检测的选择性和(B)Imm-Fe3+-IL的长期储存稳定性(误差棒表示3次试验的标准偏差)

    Figure 6  Selectivity of glucose detection compared to other sugars (control samples) and (B) Long-term storage stability of Imm-Fe3+-IL (error bars represent standard deviation of 3 trials)

    表 1  比较了检测H2O2的传感材料的性能

    Table 1.  Comparison of the performance of sensing materials for detecting H2O2

    Catalyst Method Linear range/(μmol·L-1) LOD/(μmol·L-1) References
    Imm-Fe3+-IL Colorimetry 1~200 0.35 This work
    PDI-Co3O4 NPs Colorimetry 3~60 2.37 [11]
    Fe3O4 Colorimetry 5~100 3 [12]
    Fe-MSN Colorimetry 7.2~100 1.2 [14]
    Fe3O4-Cu2+ Colorimetry 2.5~100 0.212 [15]
    PCN-222(Fe) Colorimetry 3~200 1 [16]
    GQDs/CuO Colorimetry 2~100 0.59 [17]
    PDI-Fe3O4 Colorimetry 1~100 2 [20]
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    表 2  检测葡萄糖的纳米材材料的性能比较

    Table 2.  Performance comparison of nanomaterials for glucose detection

    Catalyst Method Line range/(μmol·L-1) LOD/(μmol·L-1) References
    Imm-Fe3+-IL Colorimetry 10~200 3.31 This work
    Fe3O4 Colorimetry 50~1 000 30 [12]
    NiFe-LDHNS Colorimetry 50~2 000 23 [18]
    ATP-Fe3O4 MNPs Colorimetry 50~1 000 50 [19]
    N-GQDs Colorimetry 25~375 16 [38]
    CuNCs Colorimetry 100~2 000 100 [39]
    Cu-SBA-15 Colorimetry 2~80 5.4 [40]
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  • 发布日期:  2020-10-01
  • 收稿日期:  2020-03-12
  • 接受日期:  2020-06-11
  • 修回日期:  2020-05-19
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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