叶酸修饰的碳量子点在体外癌细胞成像中的应用

胡国文 乔玉玲

引用本文: 胡国文, 乔玉玲. 叶酸修饰的碳量子点在体外癌细胞成像中的应用[J]. 应用化学, 2020, 37(9): 1003-1009. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2020.09.200100 shu
Citation:  HU Guowen, QIAO Yuling. Folic Acid-Carbon Dot Conjugates for Cancer Cell Targeting[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2020, 37(9): 1003-1009. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2020.09.200100 shu

叶酸修饰的碳量子点在体外癌细胞成像中的应用

    通讯作者: 胡国文, 工程师; Tel:0931-8912500;E-mail:hugw@lzu.edu.cn; 研究方向:功能材料
摘要: 具有癌细胞靶向性的荧光纳米探针在生物分析、生物医学和临床诊断等领域有着重要的应用前景。本文基于碳量子点的低毒性、低成本、环境友好、制备方法简单及高发光特性等优点,采用水热法合成了表面富含氨基的荧光碳量子点(CDs),进一步通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)缩合的方法,将叶酸(FA)分子中的羧基与其共价连接,从而得到叶酸共价修饰的碳量子点复合材料(FA-CDs)。通过将该复合材料分别与海拉(Hela)和小鼠胚胎成纤维(NIH-3T3)细胞共培养,发现该复合材料能够特异性识别并标记癌细胞,且制备的该复合材料具有低毒性和高发光性等优点。该工作对癌细胞的早期诊断具有重要意义。

English

  • 近年来,荧光纳米材料,如半导体量子点、有机染料等,在生物成像领域的应用越来越受到科技工作者的关注,并得到了广泛的研究[1-4],在生物医学成像方面具有重要的应用前景[5-9]。然而,传统荧光材料的毒性、光漂白现象等严重制约了其在生物成像方面的应用[10-14]。荧光碳量子点(CDs)是一种碳基零维材料,与传统的半导体量子点和有机染料相比,具有低毒性、低成本、环境友好、良好的水溶性和生物相容性等特点,在生物成像领域有着重要的应用价值,被认为是替代传统荧光材料最具潜力的新兴发光材料。

    叶酸(FA)是叶酸受体(FR)的理想配体,FR可主动结合叶酸,进而通过内吞作用使得叶酸及其复合材料进入癌细胞[15-17]。同时,FR被多种肿瘤细胞过度表达,包括卵巢、乳腺、肺、肾、脑、前列腺和喉咙的恶性肿瘤[18-20]。因此,本文首先合成了一种表面富含氨基的CDs,进一步通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)缩合的方法,用FA修饰该荧光CDs。通过将该复合材料分别海拉(Hela)和小鼠胚胎成纤维(NIH-3T3)细胞共培养,发现该复合材料能够特异性识别并标记癌细胞,具有低毒性和高发光性等优点。该工作对癌细胞的早期诊断具有重要意义。

    无水柠檬酸和乙二胺购自中国Alfa Aesar公司。4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和叶酸(FA)均购自中国Sigma Aldrich公司,均为分析纯试剂。除乙醚和二甲基亚砜(分析纯,利安隆博华,天津)做无水处理外,其它所有化学品均未经进一步纯化。水溶液采用Millipore系统(>18 MΩ·cm)的二次蒸馏水(dd H2O)制备。Hela和NIH-3T3细胞,购自中国科学院上海细胞库

    Vertex 70V型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR,美国布鲁克公司),样品的制备采用KBr粉末压片;G2 F30型透射电子显微镜(TEM,美国Tecnai公司),工作电压为300 kV, 用于TEM表征的样品的基底为无定形碳涂覆的铜网,制样过程为将复合纳米材料分散液滴在上面并在室温下将溶剂(己烷或乙醇)挥发来制备TEM测试的样品;LS 55型荧光光谱仪(PL, 美国Perkin-Elmer公司);TU-1810型紫外/可见吸收光谱(UV-Vis, 北京普析通用仪器有限责任公司);LSM710型共焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM), 德国蔡司公司);318C型酶标仪(上海三科仪器有限公司)。

    柠檬酸(10 g)和乙二胺(3.35 mL)溶解在去离子水中(40 mL)。然后将溶液转移到聚四氟乙烯(Teflon)水热反应釜中(100 mL),在150 ℃下加热5 h,反应后用水或自然冷却至室温,得到呈棕黑色透明溶液。经透析、冷冻干燥得到CDs粉末。

    本文采用EDC化学的方法,通过在FA的羧基和CDs的胺基之间形成酰胺键,获得叶酸共价修饰的碳量子点(Scheme 1)。其合成方法具体为:首先将0.113 g CDs分散在10 mL DMSO中并超声约30 min以形成棕色分散液。随后在上述分散液中依次加入含有10 mg叶酸(0.023 mmol)的DMSO(2 mL)溶液、DMAP(2.8 mg,0.023 mmol)、HOBT(3.1 mg,0.023 mmol)和EDC(3.5 mg,0.023 mmol)。室温黑暗中搅拌14 h后,通过离心除去沉淀物,并将滤液加入乙醚(50 mL)以沉淀出产物。最后用DMSO/二乙醚混合液(体积比1: 5)洗涤3次,将得到的黄褐色产品冷冻干燥并储存在-20 ℃下。

    Scheme 1

    Scheme 1.  Schematic of synthesis of CDs and FA-CDs

    用四唑盐(MTT)比色法测定了CDs和FA-CDs纳米复合材料对Hela细胞的毒性。具体过程为,首先将细胞接种于密度为5×104细胞/孔的96孔细胞培养板中,于37 ℃,含有质量分数5%CO2和质量分数10%牛血清(FBS)的Dulbecco′s Modified Eagle Medium (DMEM)培养基中培养24 h。然后用不同浓度(0、10、50、75、100、200和400 μg/mL)的CDs和CDs-FA与其分别共培。在37 ℃和5%CO2条件下培养48和72 h。此后,将MTT(20 mL,5 mg/mL)加入各孔中,37 ℃培养4 h。加入DMSO(100 μL/孔)后,在37 ℃下放置15 min,用酶标仪于492 nm处检测各孔的吸光度值。

    将Hela和NIH-3T3细胞系在RPMI1640培养基(Gibco BRL)中,在37 ℃,5%CO2环境中,加入10%FBS进行培养。将细胞于玻璃底培养皿中培养24 h后,再与CDs和FA-CDs分别共培(质量浓度均为1 mg/mL),37 ℃下培养1h后,用冷PBS洗涤细胞3次。最后用CLSM成像。所有CLSM图像均在相同的激光功率、共焦针孔、增益、偏移量和扫描速度参数下获得。

    首先,对得到的产物通过UV-Vis进行了表征,其结果如图 1所示,可以看出CDs的最大吸收波长约为353 nm,FA在280和347 nm处有很强的吸收峰,而FA-CDs的吸收峰则位于306和338 nm处且为较宽吸收带。该结果一方面说明了FA和CDs的存在,另一方面相较于FA和CDs直接混合,峰位的移动一般归因为产物的集体吸收[11]。为了进一步验证FA-CDs的共价结合,通过FT-IR对CDs和FA-CDs进行了表征,相较于CDs,FA-CDs的FT-IR光谱(图 2)在1655 cm-1处出现了新吸收峰,1655 cm-1处吸收峰是由CO—NH官能团的羰基伸缩振动引起,证实了FA成功与CDs通过酰胺键的共价结合[21]图 3显示了CDs和FA-CDs的TEM图像和尺寸分布图,可以看出,CDs和FA-CDs均呈球形且尺寸分布均匀,此外CDs和FA-CDs的平均粒径分别为4.25和4.91 nm,FA-CDs的稍大尺寸可能是由于CDs表面修饰FA分子引起。

    图 1

    图 1.  FA(a)、CDs(b)和FA-CDs(c)紫外可见吸收光谱
    Figure 1.  Normalized UV-Vis absorption spectra of FA(a), CDs(b) and FA-CDs(c)

    图 2

    图 2.  CDs(a)和FA-CDs(b)傅里叶变换红外光谱
    Figure 2.  FT-IR spectra of CDs (a) and FA-CDs (b)

    图 3

    图 3.  CDs和FA-CDs透射电子显微镜照片及粒径分布
    Figure 3.  TEM images (A, C) and distributions(B, D) of CDs (A, B) and FA-CDs (C, D)

    为了考察该FA-CDs纳米复合材料生物成像性能,对其光致发光(PL)特性和细胞毒性进行了研究。对于CDs,如图 4所示,可以得到激发依赖的PL行为,最大激发和发射波长分别出现在360和443 nm处,与其它文献[22-24]报道一致。对于FA-CDs,其最大发射峰位移动到457 nm,这是由于FA与CDs表面共价结合而引起的。进一步通过MTT方法评价了CDs和FA-CDs的细胞毒性,通过分别与Hela细胞共培养,图 5显示了在不同浓度下(0、10、50、75、100、200和400 μg/mL)与CDs和FA-CDs共培养48 h(图 5A)和72 h(图 5B)后的细胞毒性。可以看出,FA-CDs与CDs对Hela细胞均表现出较小的毒性且无明显差异。此外,CDs的PL强度在与FA共轭后无明显变化(图 4)。这些结果表明FA-CDs具有很好的荧光性能,且FA-CDs的细胞毒性实验为其在生物成像中的应用提供了可行性。

    图 4

    图 4.  CDs(A)和FA-CDs(B)荧光光谱
    Figure 4.  PL emission spectra of CDs(A) and FA-CDs(B)

    图 5

    图 5.  CDs和FA-CDs分别培养48 h(A)和72 h(B)后的细胞毒性
    Figure 5.  Cytotoxicity of CDs and FA-CDs with increasing concentrations from 0 to 400 μg/mL for 48 h (A) and 72 h (B)

    为了研究FA-CDs特异性细胞靶向的能力,我们将所制备的FA-CDs作为荧光探针进行了癌细胞成像实验。首先,将FR阳性的Hela细胞和FR阴性的NIH-3T3细胞与FA-CDs共培养1 h,然后洗涤细胞去除未结合的FA-CDs。如图 6所示,FR阳性的Hela细胞可以观察到明显的蓝色荧光,而FR阴性的NIH-3T3细胞在共培养1 h后几乎没有荧光,也就是说,FA-CDs可以特异性进入Hela细胞。为了进一步证明FA-CDs对FR阳性细胞的特异性识别能力,将CDs和FA-CDs分别与Hela细胞共培养1 h,如图 7所示,可以很明显地看出FA-CDs大量进入了Hela细胞,而只有很少的CDs进入或者吸附在Hela细胞上。这些结果表明,FA-CDs对富含FR的肿瘤细胞具有特异性靶向性,这与肿瘤细胞中的量子点、金纳米粒子等其它纳米材料表现出来的现象类似[25]。此外,在Hela细胞中,FA-CDs的细胞毒性略高于CDs(图 5),这与FA受体介导的内吞作用增加FA-CDs的摄入有关。更重要的是,相较于常见的细胞培养时间为24 h甚至更长[26-27],本文仅使用了1 h实现了FA-CDs对癌细胞的特异性标记,该结果表明,FA-CDs可以作为潜在的靶向肿瘤细胞的纳米生物探针。

    图 6

    图 6.  FA-CDs分别与NIH-3T3和Hela细胞共培养后的共焦显微镜照片
    Figure 6.  Confocal laser scanning microscopic images of NIH-3T3 (A, B, C) and Hela cells (D, E, F) after incubation at 37 ℃ for 1 h with FA-CDs

    图 7

    图 7.  CDs(A-C)和FA-CDs(D-F)分别和Hela细胞共培养后的共焦显微镜照片
    Figure 7.  Confocal laser scanning microscopic images of Hela cells after incubation at 37 ℃ for 1 h with CDs(A, B, C) and FA-CDs(D, E, F)

    本文合成了一种具有低毒、高发光特性的叶酸-碳量子点复合材料(FA-CDs),其具有显著的靶向肿瘤细胞的能力。该材料通过简单、低成本的方法合成,通过分别与海拉(Hela)和小鼠胚胎成纤维(NIH-3T3)细胞共培养,可以得出该FA-CDs一方面具有较低的细胞毒性和较好的稳定性,另一方面具有对癌细胞的特异性识别能力。该纳米生物探针有望在生物医学领域发挥重要作用。


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  • Scheme 1  Schematic of synthesis of CDs and FA-CDs

    图 1  FA(a)、CDs(b)和FA-CDs(c)紫外可见吸收光谱

    Figure 1  Normalized UV-Vis absorption spectra of FA(a), CDs(b) and FA-CDs(c)

    图 2  CDs(a)和FA-CDs(b)傅里叶变换红外光谱

    Figure 2  FT-IR spectra of CDs (a) and FA-CDs (b)

    图 3  CDs和FA-CDs透射电子显微镜照片及粒径分布

    Figure 3  TEM images (A, C) and distributions(B, D) of CDs (A, B) and FA-CDs (C, D)

    图 4  CDs(A)和FA-CDs(B)荧光光谱

    Figure 4  PL emission spectra of CDs(A) and FA-CDs(B)

    图 5  CDs和FA-CDs分别培养48 h(A)和72 h(B)后的细胞毒性

    Figure 5  Cytotoxicity of CDs and FA-CDs with increasing concentrations from 0 to 400 μg/mL for 48 h (A) and 72 h (B)

    图 6  FA-CDs分别与NIH-3T3和Hela细胞共培养后的共焦显微镜照片

    Figure 6  Confocal laser scanning microscopic images of NIH-3T3 (A, B, C) and Hela cells (D, E, F) after incubation at 37 ℃ for 1 h with FA-CDs

    图 7  CDs(A-C)和FA-CDs(D-F)分别和Hela细胞共培养后的共焦显微镜照片

    Figure 7  Confocal laser scanning microscopic images of Hela cells after incubation at 37 ℃ for 1 h with CDs(A, B, C) and FA-CDs(D, E, F)

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  • 发布日期:  2020-09-01
  • 收稿日期:  2020-04-08
  • 接受日期:  2020-07-01
  • 修回日期:  2020-06-09
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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