叶酸修饰的碳量子点在体外癌细胞成像中的应用

引用本文: 胡国文, 乔玉玲. 叶酸修饰的碳量子点在体外癌细胞成像中的应用[J]. 应用化学, 2020, 37(9): 1003-1009. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2020.09.200100 shu

Citation: HU Guowen, QIAO Yuling. Folic Acid-Carbon Dot Conjugates for Cancer Cell Targeting[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2020, 37(9): 1003-1009. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2020.09.200100 shu

叶酸修饰的碳量子点在体外癌细胞成像中的应用

胡国文 ^{a,
,} ,
乔玉玲 ^b,

a.
兰州大学化学化工学院, 功能有机分子化学国家重点实验室兰州 730000
b.
北京生物制品研究所有限责任公司北京 100024

通讯作者: 胡国文, 工程师; Tel:0931-8912500;E-mail:hugw@lzu.edu.cn; 研究方向:功能材料

摘要: 具有癌细胞靶向性的荧光纳米探针在生物分析、生物医学和临床诊断等领域有着重要的应用前景。本文基于碳量子点的低毒性、低成本、环境友好、制备方法简单及高发光特性等优点，采用水热法合成了表面富含氨基的荧光碳量子点（CDs），进一步通过1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）缩合的方法，将叶酸（FA）分子中的羧基与其共价连接，从而得到叶酸共价修饰的碳量子点复合材料（FA-CDs）。通过将该复合材料分别与海拉（Hela）和小鼠胚胎成纤维（NIH-3T3）细胞共培养，发现该复合材料能够特异性识别并标记癌细胞，且制备的该复合材料具有低毒性和高发光性等优点。该工作对癌细胞的早期诊断具有重要意义。

关键词:

English

Folic Acid-Carbon Dot Conjugates for Cancer Cell Targeting

HU Guowen ^{a,
,} ,
QIAO Yuling ^b,

a.
State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry, College of Chemistry and Chemical Engineering, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
b.
Beijing Institute of Biological Products Co. LTD, Beijing 100024, China

Corresponding author: HU Guowen, engineer; Tel:0931-8912500; E-mail:hugw@lzu.edu.cn; Research interests:functional materials

Received Date: 08 April 2020
Accepted Date: 01 July 2020
Revised Date: 09 June 2020
Available Online: 01 September 2020

Abstract: Fluorescent nanobioprobes with cell-targeting specificity are promising to find important applications in bioanalysis, biomedicine, and clinical diagnosis. In this work, folic acid-carbon dot conjugates (FA-CDs) were prepared via hydrothermal method and 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) chemistry. The as-prepared FA-CDs with low toxicity and high luminescence can specifically target cancer cells. The specificity of this receptor-mediated internalization was confirmed by comparing the uptake by Hela and NIH-3T3 cells. This work is of great significance for the early diagnosis of cancer cells.

Key words:

近年来，荧光纳米材料，如半导体量子点、有机染料等，在生物成像领域的应用越来越受到科技工作者的关注，并得到了广泛的研究^[1-4]，在生物医学成像方面具有重要的应用前景^[5-9]。然而，传统荧光材料的毒性、光漂白现象等严重制约了其在生物成像方面的应用^[10-14]。荧光碳量子点(CDs)是一种碳基零维材料，与传统的半导体量子点和有机染料相比，具有低毒性、低成本、环境友好、良好的水溶性和生物相容性等特点，在生物成像领域有着重要的应用价值，被认为是替代传统荧光材料最具潜力的新兴发光材料。

叶酸(FA)是叶酸受体(FR)的理想配体，FR可主动结合叶酸，进而通过内吞作用使得叶酸及其复合材料进入癌细胞^[15-17]。同时，FR被多种肿瘤细胞过度表达，包括卵巢、乳腺、肺、肾、脑、前列腺和喉咙的恶性肿瘤^[18-20]。因此，本文首先合成了一种表面富含氨基的CDs，进一步通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)缩合的方法，用FA修饰该荧光CDs。通过将该复合材料分别海拉(Hela)和小鼠胚胎成纤维(NIH-3T3)细胞共培养，发现该复合材料能够特异性识别并标记癌细胞，具有低毒性和高发光性等优点。该工作对癌细胞的早期诊断具有重要意义。

1.   实验部分

1.1   试剂和仪器

无水柠檬酸和乙二胺购自中国Alfa Aesar公司。4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和叶酸(FA)均购自中国Sigma Aldrich公司，均为分析纯试剂。除乙醚和二甲基亚砜(分析纯，利安隆博华，天津)做无水处理外，其它所有化学品均未经进一步纯化。水溶液采用Millipore系统(＞18 MΩ·cm)的二次蒸馏水(dd H₂O)制备。Hela和NIH-3T3细胞，购自中国科学院上海细胞库

Vertex 70V型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR，美国布鲁克公司)，样品的制备采用KBr粉末压片；G2 F30型透射电子显微镜(TEM，美国Tecnai公司)，工作电压为300 kV, 用于TEM表征的样品的基底为无定形碳涂覆的铜网，制样过程为将复合纳米材料分散液滴在上面并在室温下将溶剂(己烷或乙醇)挥发来制备TEM测试的样品；LS 55型荧光光谱仪(PL, 美国Perkin-Elmer公司)；TU-1810型紫外/可见吸收光谱(UV-Vis, 北京普析通用仪器有限责任公司)；LSM710型共焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM), 德国蔡司公司)；318C型酶标仪(上海三科仪器有限公司)。

1.2   CDs的合成

柠檬酸(10 g)和乙二胺(3.35 mL)溶解在去离子水中(40 mL)。然后将溶液转移到聚四氟乙烯(Teflon)水热反应釜中(100 mL)，在150 ℃下加热5 h，反应后用水或自然冷却至室温，得到呈棕黑色透明溶液。经透析、冷冻干燥得到CDs粉末。

1.3   FA-CDs纳米复合材料的合成

本文采用EDC化学的方法，通过在FA的羧基和CDs的胺基之间形成酰胺键，获得叶酸共价修饰的碳量子点(Scheme 1)。其合成方法具体为：首先将0.113 g CDs分散在10 mL DMSO中并超声约30 min以形成棕色分散液。随后在上述分散液中依次加入含有10 mg叶酸(0.023 mmol)的DMSO(2 mL)溶液、DMAP(2.8 mg，0.023 mmol)、HOBT(3.1 mg，0.023 mmol)和EDC(3.5 mg，0.023 mmol)。室温黑暗中搅拌14 h后，通过离心除去沉淀物，并将滤液加入乙醚(50 mL)以沉淀出产物。最后用DMSO/二乙醚混合液(体积比1: 5)洗涤3次，将得到的黄褐色产品冷冻干燥并储存在-20 ℃下。

Scheme 1

Scheme 1. Schematic of synthesis of CDs and FA-CDs

下载: 全尺寸图片幻灯片

1.4   CDs和FA-CDs的细胞毒性试验

用四唑盐(MTT)比色法测定了CDs和FA-CDs纳米复合材料对Hela细胞的毒性。具体过程为，首先将细胞接种于密度为5×10⁴细胞/孔的96孔细胞培养板中，于37 ℃，含有质量分数5%CO₂和质量分数10%牛血清(FBS)的Dulbecco′s Modified Eagle Medium (DMEM)培养基中培养24 h。然后用不同浓度(0、10、50、75、100、200和400 μg/mL)的CDs和CDs-FA与其分别共培。在37 ℃和5%CO₂条件下培养48和72 h。此后，将MTT(20 mL，5 mg/mL)加入各孔中，37 ℃培养4 h。加入DMSO(100 μL/孔)后，在37 ℃下放置15 min，用酶标仪于492 nm处检测各孔的吸光度值。

1.5   CDs和FA-CDs的细胞培养和生物成像

将Hela和NIH-3T3细胞系在RPMI1640培养基(Gibco BRL)中，在37 ℃，5%CO₂环境中，加入10%FBS进行培养。将细胞于玻璃底培养皿中培养24 h后，再与CDs和FA-CDs分别共培(质量浓度均为1 mg/mL)，37 ℃下培养1h后，用冷PBS洗涤细胞3次。最后用CLSM成像。所有CLSM图像均在相同的激光功率、共焦针孔、增益、偏移量和扫描速度参数下获得。

2.   结果和讨论

2.1   CDs和FA-CDs的结构表征

首先，对得到的产物通过UV-Vis进行了表征，其结果如图 1所示，可以看出CDs的最大吸收波长约为353 nm，FA在280和347 nm处有很强的吸收峰，而FA-CDs的吸收峰则位于306和338 nm处且为较宽吸收带。该结果一方面说明了FA和CDs的存在，另一方面相较于FA和CDs直接混合，峰位的移动一般归因为产物的集体吸收^[11]。为了进一步验证FA-CDs的共价结合，通过FT-IR对CDs和FA-CDs进行了表征，相较于CDs，FA-CDs的FT-IR光谱(图 2)在1655 cm^-1处出现了新吸收峰，1655 cm^-1处吸收峰是由CO—NH官能团的羰基伸缩振动引起，证实了FA成功与CDs通过酰胺键的共价结合^[21]。图 3显示了CDs和FA-CDs的TEM图像和尺寸分布图，可以看出，CDs和FA-CDs均呈球形且尺寸分布均匀，此外CDs和FA-CDs的平均粒径分别为4.25和4.91 nm，FA-CDs的稍大尺寸可能是由于CDs表面修饰FA分子引起。

图 1

图 1. FA(a)、CDs(b)和FA-CDs(c)紫外可见吸收光谱

Figure 1. Normalized UV-Vis absorption spectra of FA(a), CDs(b) and FA-CDs(c)

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 2

图 2. CDs(a)和FA-CDs(b)傅里叶变换红外光谱

Figure 2. FT-IR spectra of CDs (a) and FA-CDs (b)

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 3

图 3. CDs和FA-CDs透射电子显微镜照片及粒径分布

Figure 3. TEM images (A, C) and distributions(B, D) of CDs (A, B) and FA-CDs (C, D)

下载: 全尺寸图片幻灯片

2.2   CDs和FA-CDs的生物成像性能

为了考察该FA-CDs纳米复合材料生物成像性能，对其光致发光(PL)特性和细胞毒性进行了研究。对于CDs，如图 4所示，可以得到激发依赖的PL行为，最大激发和发射波长分别出现在360和443 nm处，与其它文献[22-24]报道一致。对于FA-CDs，其最大发射峰位移动到457 nm，这是由于FA与CDs表面共价结合而引起的。进一步通过MTT方法评价了CDs和FA-CDs的细胞毒性，通过分别与Hela细胞共培养，图 5显示了在不同浓度下(0、10、50、75、100、200和400 μg/mL)与CDs和FA-CDs共培养48 h(图 5A)和72 h(图 5B)后的细胞毒性。可以看出，FA-CDs与CDs对Hela细胞均表现出较小的毒性且无明显差异。此外，CDs的PL强度在与FA共轭后无明显变化(图 4)。这些结果表明FA-CDs具有很好的荧光性能，且FA-CDs的细胞毒性实验为其在生物成像中的应用提供了可行性。

图 4

图 4. CDs(A)和FA-CDs(B)荧光光谱

Figure 4. PL emission spectra of CDs(A) and FA-CDs(B)

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 5

图 5. CDs和FA-CDs分别培养48 h(A)和72 h(B)后的细胞毒性

Figure 5. Cytotoxicity of CDs and FA-CDs with increasing concentrations from 0 to 400 μg/mL for 48 h (A) and 72 h (B)

下载: 全尺寸图片幻灯片

2.3   FA-CDs特异性靶向癌细胞

为了研究FA-CDs特异性细胞靶向的能力，我们将所制备的FA-CDs作为荧光探针进行了癌细胞成像实验。首先，将FR阳性的Hela细胞和FR阴性的NIH-3T3细胞与FA-CDs共培养1 h，然后洗涤细胞去除未结合的FA-CDs。如图 6所示，FR阳性的Hela细胞可以观察到明显的蓝色荧光，而FR阴性的NIH-3T3细胞在共培养1 h后几乎没有荧光，也就是说，FA-CDs可以特异性进入Hela细胞。为了进一步证明FA-CDs对FR阳性细胞的特异性识别能力，将CDs和FA-CDs分别与Hela细胞共培养1 h，如图 7所示，可以很明显地看出FA-CDs大量进入了Hela细胞，而只有很少的CDs进入或者吸附在Hela细胞上。这些结果表明，FA-CDs对富含FR的肿瘤细胞具有特异性靶向性，这与肿瘤细胞中的量子点、金纳米粒子等其它纳米材料表现出来的现象类似^[25]。此外，在Hela细胞中，FA-CDs的细胞毒性略高于CDs(图 5)，这与FA受体介导的内吞作用增加FA-CDs的摄入有关。更重要的是，相较于常见的细胞培养时间为24 h甚至更长^[26-27]，本文仅使用了1 h实现了FA-CDs对癌细胞的特异性标记，该结果表明，FA-CDs可以作为潜在的靶向肿瘤细胞的纳米生物探针。

图 6

图 6. FA-CDs分别与NIH-3T3和Hela细胞共培养后的共焦显微镜照片

Figure 6. Confocal laser scanning microscopic images of NIH-3T3 (A, B, C) and Hela cells (D, E, F) after incubation at 37 ℃ for 1 h with FA-CDs

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 7

图 7. CDs(A-C)和FA-CDs(D-F)分别和Hela细胞共培养后的共焦显微镜照片

Figure 7. Confocal laser scanning microscopic images of Hela cells after incubation at 37 ℃ for 1 h with CDs(A, B, C) and FA-CDs(D, E, F)

下载: 全尺寸图片幻灯片

3.   结论

本文合成了一种具有低毒、高发光特性的叶酸-碳量子点复合材料(FA-CDs)，其具有显著的靶向肿瘤细胞的能力。该材料通过简单、低成本的方法合成，通过分别与海拉(Hela)和小鼠胚胎成纤维(NIH-3T3)细胞共培养，可以得出该FA-CDs一方面具有较低的细胞毒性和较好的稳定性，另一方面具有对癌细胞的特异性识别能力。该纳米生物探针有望在生物医学领域发挥重要作用。
1. [1]
  Eck W, Nicholson A I, Zentgraf H. Anti-CD4-targeted Gold Nanoparticles Induce Specific Contrast Enhancement of Peripheral Lymph Nodes in X-ray Computed Tomography of Live Mice[J]. Nano Lett, 2010, 10(7): 2318-2322. doi: 10.1021/nl101019s doi: 10.1021/nl101019s
2. [2]
  Liu D, Wu W, Ling J. Effective PEGylation of Iron Oxide Nanoparticles for High Performance in Vivo Cancer Imaging[J]. Adv Funct Mater, 2011, 21(8): 1498-1504. doi: 10.1002/adfm.201001658 doi: 10.1002/adfm.201001658
3. [3]
  Michalet X, Pinaud F F, Bentolila L A. Quantum Dots for Live Cells, in Vivo Imaging, and Diagnostics[J]. Science, 2005, 307(5709): 538-544. doi: 10.1126/science.1104274 doi: 10.1126/science.1104274
4. [4]
  Gao X, Cui Y, Levenson R M. In Vivo Cancer Targeting and Imaging with Semiconductor Quantum Dots[J]. Nat Biotechnol, 2004, 22(8): 969-976. doi: 10.1038/nbt994 doi: 10.1038/nbt994
5. [5]
  Medintz I L, Uyeda H T, Goldman E R. Quantum Dot Bioconjugates for Imaging, Labelling and Sensing[J]. Nat Mater, 2005, 4(6): 435-446. doi: 10.1038/nmat1390 doi: 10.1038/nmat1390
6. [6]
  Pellegrino T, Kudera S, Liedl T. On the Development of Colloidal Nanoparticles Towards Multifunctional Structures and Their Possible Use for Biological Applications[J]. Small, 2005, 1(1): 48-63.
7. [7]
  Gill R, Zayats M, Willner I. Semiconductor Quantum Dots for Bioanalysis[J]. Angew Chem Int Ed, 2008, 47(40): 7602-7625. doi: 10.1002/anie.200800169 doi: 10.1002/anie.200800169
8. [8]
  Chen W. Nanoparticle Fluorescence Based Technology for Biological Applications[J]. J Nanosci Nanotechnol, 2008, 8(3): 1019-1051. doi: 10.1166/jnn.2008.301 doi: 10.1166/jnn.2008.301
9. [9]
  José, Costa-Fernández. The Use of luminescent Quantum Dots for Optical Sensing[J]. TrAC, Trends Anal Chem, 2006, 25(3): 207-218. doi: 10.1016/j.trac.2005.07.008 doi: 10.1016/j.trac.2005.07.008
10. [10]
  Baker S N, Baker G A. Luminescent Carbon Nanodots:Emergent Nanolights[J]. Angew Chem Int Ed, 2010, 49(38): 6726-6744. doi: 10.1002/anie.200906623 doi: 10.1002/anie.200906623
11. [11]
  Zhu S, Meng Q, Wang L. Highly Photoluminescent Carbon Dots for Multicolor Patterning, Sensors, and Bioimaging[J]. Angew Chem, 2013, 125(14): 4045-4049. doi: 10.1002/ange.201300519 doi: 10.1002/ange.201300519
12. [12]
  Shen J, Zhu Y, Yang X. Graphene Quantum Dots:Emergent Nanolights for Bioimaging, Sensors, Catalysis and Photovoltaic Devices[J]. Chem Commun, 2012, 48(31): 3686-3699. doi: 10.1039/c2cc00110a doi: 10.1039/c2cc00110a
13. [13]
  Ray S C, Saha A, Jana N R. Fluorescent Carbon Nanoparticles:Synthesis, Characterization, and Bioimaging Application[J]. J Phys Chem C, 2009, 113(43): 18546-18551. doi: 10.1021/jp905912n doi: 10.1021/jp905912n
14. [14]
  Li H, He X, Liu Y. One-Step Ultrasonic Synthesis of Water-Soluble Carbon Nanoparticles with Excellent Photoluminescent Properties[J]. Carbon, 2011, 49(2): 605-609. doi: 10.1016/j.carbon.2010.10.004 doi: 10.1016/j.carbon.2010.10.004
15. [15]
  Lu Y, Low P S. Folate-Mediated Delivery of Macromolecular Anticancer Therapeutic Agents[J]. Adv Drug Delivery Rev, 2012, 54(5): 675-693.
16. [16]
  Kamen B A, Capdevila A. Receptor-mediated Folate Accumulation is Regulated by the Cellular Folate Content[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 1986, 83(16): 5983-5987. doi: 10.1073/pnas.83.16.5983 doi: 10.1073/pnas.83.16.5983
17. [17]
  Leamon C P, Low P S. Delivery of Macromolecules into Living Cells:A Method that Exploits Folate Receptor Endocytosis[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 1991, 88(13): 5572-5576. doi: 10.1073/pnas.88.13.5572 doi: 10.1073/pnas.88.13.5572
18. [18]
  Sudimack J, Lee R J. Targeted Drug Delivery via the Folate Receptor[J]. Adv Drug Delivery Rev, 2000, 41(2): 147-162.
19. [19]
  Lu Y J, Low P S. Folate-mediated Delivery of Macromolecular Anticancer Therapeutic Agents[J]. Adv Drug Delivery Rev, 2002, 54(5): 675-693. doi: 10.1016/S0169-409X(02)00042-X doi: 10.1016/S0169-409X(02)00042-X
20. [20]
  Weitman S D, Lark R H, Coney L R. Distribution of the Folate Receptor GP38 in Normal and Malignant Cell Lines and Tissues[J]. Cancer Res, 1992, 52(12): 3396-3401.
21. [21]
  Suriamoorthy P, Zhang X, Hao G. Folic Acid-CdTe Quantum Dot Conjugates and Their Applications for Cancer Cell Targeting[J]. Cancer Nanotechnol, 2010, 1(1): 19-28.
22. [22]
  Liu R, Wu D, Liu S. An Aqueous Route to Multicolor Photoluminescent Carbon Dots Using Silica Spheres as Carriers[J]. Angew Chem, 2009, 48(25): 4598-4601. doi: 10.1002/anie.200900652 doi: 10.1002/anie.200900652
23. [23]
  Krysmann M J, Kelarakis A, Dallas P. Formation Mechanism of Carbogenic Nanoparticles with Dual Photoluminescence Emission[J]. J Am Chem Soc, 2012, 134(2): 747-750. doi: 10.1021/ja204661r doi: 10.1021/ja204661r
24. [24]
  Liu H, Ye T, Mao C. Fluorescent Carbon Nanoparticles Derived from Candle Soot[J]. Angew Chem, 2007, 46(34): 6473-6475. doi: 10.1002/anie.200701271 doi: 10.1002/anie.200701271
25. [25]
  Bharali D J, Lucey D W, Jayakumar H. Folate-Receptor-Mediated Delivery of InP Quantum Dots for Bioimaging Using Confocal and Two-Photon Microscopy[J]. J Am Chem Soc, 2005, 127(32): 11364-11371. doi: 10.1021/ja051455x doi: 10.1021/ja051455x
26. [26]
  Fowley C, Mccaughan B, Devlin A. Highly Luminescent Biocompatible Carbon Quantum Dots by Encapsulation with an Amphiphilic Polymer[J]. Chem Commun, 2012, 48(75): 9361-9363. doi: 10.1039/c2cc34962k doi: 10.1039/c2cc34962k
27. [27]
  罗信, 彭霞, 陈广成. 叶酸修饰的聚乙烯亚胺聚合物载PD-L1 siRNA体外靶向胃癌细胞的研究[J]. 中国病理生理杂志, 2017,33,(12): 2179-2187. LUO Xin, PENG Xia, CHEN Guangcheng. Using Folic Acid-Modified Polyethylenimine-SPIO Nanoparticles for PD-L1 siRNA Delivery to Target Gastric Cancer[J]. Chinese J Pathophysiol, 2017, 33(12): 2179-2187.
Scheme 1 Schematic of synthesis of CDs and FA-CDs

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 1 FA(a)、CDs(b)和FA-CDs(c)紫外可见吸收光谱

Figure 1 Normalized UV-Vis absorption spectra of FA(a), CDs(b) and FA-CDs(c)

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 2 CDs(a)和FA-CDs(b)傅里叶变换红外光谱

Figure 2 FT-IR spectra of CDs (a) and FA-CDs (b)

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 3 CDs和FA-CDs透射电子显微镜照片及粒径分布

Figure 3 TEM images (A, C) and distributions(B, D) of CDs (A, B) and FA-CDs (C, D)

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 4 CDs(A)和FA-CDs(B)荧光光谱

Figure 4 PL emission spectra of CDs(A) and FA-CDs(B)

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 5 CDs和FA-CDs分别培养48 h(A)和72 h(B)后的细胞毒性

Figure 5 Cytotoxicity of CDs and FA-CDs with increasing concentrations from 0 to 400 μg/mL for 48 h (A) and 72 h (B)

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 6 FA-CDs分别与NIH-3T3和Hela细胞共培养后的共焦显微镜照片

Figure 6 Confocal laser scanning microscopic images of NIH-3T3 (A, B, C) and Hela cells (D, E, F) after incubation at 37 ℃ for 1 h with FA-CDs

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 7 CDs(A-C)和FA-CDs(D-F)分别和Hela细胞共培养后的共焦显微镜照片

Figure 7 Confocal laser scanning microscopic images of Hela cells after incubation at 37 ℃ for 1 h with CDs(A, B, C) and FA-CDs(D, E, F)

下载: 全尺寸图片幻灯片