

Citation: XING Yayan, SHI Yuzhe, DENG Shixian, ZHAO Baihan, LIU Zhiguo. Preparation and Application of Catechin-Silver Nanocomposites[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2020, 37(9): 1062-1068. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2020.09.200076

儿茶素-银纳米复合材料的制备及其应用
English
Preparation and Application of Catechin-Silver Nanocomposites
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Key words:
- catechin
- / silver nanocomposite
- / antibacterial activity
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银纳米材料因具有高效抑菌活性而受到了研究者们广泛关注[1]。银纳米材料不仅仅局限于科学研究,目前已经逐渐应用到日常生活的不同领域中,如医疗用品、纺织品和食品储存容器领域等[2]。银纳米材料表面的银离子在使用或处理过程中可能释放到环境中而具有污染环境的风险,这是银纳米材料在实际应用上存在的一个问题[3]。目前,银纳米材料开发的新方向主要是在可以提高其抑菌效率的同时还减少其有害影响的前提下探索新的制备方法和使用新型稳定剂来合成银纳米材料。因此,优化银纳米材料的合成方法对于改善其抗菌性能和环境危害性均非常重要[4]。
近年来文献报道了一些绿色合成金属纳米材料的方法和策略[5]。其中,植物提取物不仅可以稳定银纳米材料而且还有降低其毒性的作用,因而植物提取物是绿色合成银纳米材料的宝库。儿茶素是一种天然植物抗氧化剂,广泛存在于植物中,是茶叶的主要成分,它具有广泛的生物、药理和抗氧化活性[6]。因儿茶素具有一定的还原性,所以本研究探索使用儿茶素作为还原剂和稳定剂绿色合成银纳米复合材料。儿茶素作为绿色制备金属纳米材料的还原剂具有既安全又环保的优势。
1. 实验部分
1.1 试剂和仪器
儿茶素购自Sigma-Aldrich(中国上海),分析纯;硝酸银购自科欧密化学试剂公司,氨水购自天津市富宇精细化工有限公司,磷酸二氢钠和磷酸氢二钠购自天津市天力化学试剂公司,以上试剂均为分析纯;本研究中使用了超纯水,其电阻率>18 MΩ·cm。抑菌活性实验中的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌从黑龙江省科学院应用微生物研究所获得。
UV5500型的紫外-可见光分光光度计(UV-Vis,上海元析仪器有限公司);JEM-2100型透射电镜(TEM,日本电子公司);IR Affinity-1型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR,日本岛津公司);D/max-2200VCX射线衍射仪(XRD,日本理学株式会社)。
1.2 儿茶素-银纳米复合材料的制备
首先,配制0.32 mmol/L儿茶素溶液,称取0.232 g儿茶素放入250 mL的容量瓶中,定容。配制质量分数5%的硝酸银溶液,称取0.05 g硝酸银放于5 mL小试管中加入1 mL水,超声溶解。取5%的硝酸银溶液0.4 mL和0.32 mmol/L儿茶素溶液40 mL放入烧杯中混合,用pH计测得反应溶液的初始pH=5.9,用浓氨水调整混合溶液的pH=7.0,充分混合后搅拌30 min,最后取40 mL混合溶液放入50 mL的水热反应釜中,反应釜放入烘箱后加热,在温度升到140 ℃时开始计时,混合溶液在140 ℃下反应4 h,反应结束后,等反应釜温度降低到室温后取出反应釜,收集反应所得的溶液。
1.3 抑菌实验
大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病微生物,可寄生于动物肠道中,适宜于在体温的条件下(37 ℃)生长。白色念珠菌是一种真菌,在25~28 ℃时生长良好。将稀释到1×106 CFU/mL的对数期菌液,取200 μL加入到营养琼脂平板里,均匀涂抹直至涂干。用打孔器制作直径为6 mm的圆形滤纸片,进行灭菌,滴加待测溶液15 μL在每片圆形滤纸上。将滴加了待测溶液的滤纸片在无菌条件下晾干。用灭菌后的镊子把晾干的滤纸片放入含菌的营养琼脂平板中,封口膜密封平板。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在37 ℃培养24 h,白色念球菌在28 ℃培养24 h。使用数码相机拍照滤纸片边缘菌落生长情况。
测量了儿茶素-银纳米复合材料的最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。初始儿茶素-银纳米溶液含银质量浓度为314 μg/mL,通过两倍稀释法用营养液将其稀释到2.45 μg/mL。对照组也进行同样的稀释,然后转移至96孔微量滴定板中。将体积相等的新鲜制备的细菌悬浮液(1×106 CFU/mL)移入每个小孔中,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在37 ℃、白色念珠菌在28 ℃下培养24 h。无菌落生长的最低银纳米溶液浓度为最低抑制浓度(MIC)。从96孔板中分别取10 μL不同浓度的悬浮液重新接种在营养琼脂平板上培养24 h。营养琼脂平板上菌落小于5个的最小浓度确定为最低杀菌浓度(MBC)。
为了进一步确认儿茶素-银纳米溶液的抑菌效率,通过测定儿茶素-银纳米溶液和对照样品的抑制率来进行比较。使用营养液将细菌悬液稀释至1×106 CFU/mL。测试样品包括儿茶素-银纳米溶液,儿茶素和硝酸银溶液以及青霉素溶液,使用营养液将样品释至每种样品的2MIC。将100 μL测试样品与100 μL细菌悬浮液混合,使用100 μL细菌悬浮液与100 μL盐水的混合溶液(Acon)和200 μL营养液(A0)的光密度值(Optic density, OD)作为对照。并在37 ℃(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)和28 ℃(白色念珠菌)中培养24 h。通过酶标仪测量培养液在630 nm处的OD值。抑制率(Inhibition ratio, IR)计算方法如式(1)所示:
$ {\rm{IR/\% = 100}} - \frac{{100 - \left( {{A_t} - {A_0}} \right)}}{{\left( {{A_{{\rm{con}}}} - {A_0}} \right)}} $
(1) 式中,At是测试样品的OD值, A0是肉汤培养基的OD值;Acon是等体积细菌悬浮液和盐水混合溶液的OD值作为对照。
2. 结果与讨论
2.1 儿茶素-银纳米复合材料的结构和形貌表征
图 1是儿茶素-银纳米胶体溶液紫外吸收光谱,图 1中也给出了儿茶素溶液的紫外吸收光谱便于比较。图 1插图是测定光谱时儿茶素银纳米溶液的照片,水热合成后的溶液呈黄褐色。儿茶素溶液在400~500 nm之间没有出现吸收峰。儿茶素-银纳米溶液在418 nm处出现强吸收峰,这是由于银的表面等离子共振所产生的吸收,此结果与之前的文献[7]报道一致。根据Mie理论,单一的表面等离子共振带证明合成的银纳米材料主要为球形,并且没有形成各向异性粒子[8]。银纳米材料的形状、尺寸和表面覆盖率都会影响其吸收峰的强度和位置。银纳米材料的表面包裹剂或稳定剂可以显著影响它们的UV吸收特性。本实验中,银纳米材料溶液的紫外吸收带位于相对较长波长范围内,这是由于儿茶素在银纳米粒子表面的吸附所造成的[9]。
图 1
纯儿茶素和儿茶素-银纳米复合材料的FTIR光谱如图 2所示。纯儿茶素图中3417 cm-1的宽吸收带归因于儿茶素O—H键的拉伸振动及其氢键作用,1604 cm-1处的吸收带归属于儿茶素中苯环的C=C基团,1285 cm-1的吸收峰来源于儿茶素的C—O伸缩振动[10]。在儿茶素-银纳米复合材料的FTIR光谱中,其特征吸收谱带与纯儿茶素相比几乎相同。儿茶素-银纳米材料在1615 cm-1处的吸收带(苯环的C=C伸缩振动)比纯儿茶素样品稍稍增强,说明银纳米粒子与儿茶素中的官能团存在相互作用。
图 2
图 3是儿茶素-银纳米粒子的TEM图,图 3右上角插图是粒子大小分布图。如图 3所示,银纳米粒子主要呈球形,其分布较为均匀。大部分粒子尺寸分布在20~40 nm范围内,平均直径为22.7 nm(n=100)。如图 4是儿茶素-银纳米粒子的能谱图(EDS),图 4中出现了C、O和Ag元素,其中C和O是儿茶素的成分。该结果证实了纳米复合材料中有银纳米的存在。表 1是利用EDS测得的儿茶素-银纳米材料的元素含量,可以看到银原子物质的量分数高达38.41%。
图 3
图 4
表 1
Element Mass fraction/% Molar fraction/% C, K 13.10 53.58 O, K 2.61 8.01 Ag, K 84.30 38.41 图 5是儿茶素-银纳米材料的XRD图谱。如图 5所示,在38°、44°、64°、77°和81°处的衍射峰,分别对应面心立方银晶体结构的(111)、(200)、(220)、(311)和(222)面。XRD图谱结果证明合成的儿茶素-银纳米材料具有高度结晶结构[11]。
图 5
2.2 儿茶素-银纳米复合材料的抑菌性结果
图 6是儿茶素-银纳米溶液抑菌圈的实验结果。本实验使用了儿茶素溶液、AgNO3溶液还有青霉素(Penicillin)作为对照品,因为在近年来的研究中,评价抑菌能力的阳性对照常常使用青霉素。如图 6所示,儿茶素-银纳米复合材料可以显着抑制大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和白色念珠菌(C.albicans)的生长。从图 6中可以看出,儿茶素-银纳米材料溶液对于大肠杆菌和白色念珠菌的抑制效果明显高于儿茶素和AgNO3溶液,同时儿茶素-银纳米溶液的抗菌效果几乎与青霉素相同。虽然儿茶素-银纳米溶液对金黄色葡萄球菌的杀菌作用稍稍低于AgNO3溶液,但是仍然具有很强的抑菌效果。从图 6中还可以看出,儿茶素本身也是具有杀菌效果的,但是与儿茶素-银纳米溶液相比较,儿茶素是极易被氧化失去活性的。如图 6所示,Ag+(AgNO3溶液)也是有非常高的杀菌效率,但是Ag+直接应用于产品可能会对人体健康造成有害影响。
图 6
表 2是儿茶素-银纳米溶液、儿茶素溶液、青霉素溶液和AgNO3溶液的MIC和MBC数据。如图儿茶素-银纳米粒溶液对大肠杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的抑菌活性,它对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)和白色念珠菌(C.albicans)的MIC和MBC分别为19.63和39.26 μg/mL。此结果表明,由于细菌细胞壁结构的不同和不同细菌细胞表面上官能团的丰度的差异并没有影响儿茶素-银纳米材料对不同细菌的杀菌效果。
表 2
表 2 儿茶素-银纳米粒子对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定值Table 2. The MIC and MBC of Catechin-AgNPs against E.coli, S.aureus and C.albicansE.coli S.aureus C.albicans MIC/(μg·mL-1) MBC/(μg·mL-1) MIC/(μg·mL-1) MBC/(μg·mL-1) MIC/(μg·mL-1) MBC/(μg·mL-1) Catechin-AgNPs 19.63 39.26 19.63 39.26 19.63 39.26 Penicillin 12.50 25.00 12.50 25.00 25.00 50.00 Catechin 919.0 1838 459.5 919.0 919.0 1838 AgNO3 9.800 19.60 4.900 9.800 9.800 19.60 *Penicillin, catechin and AgNO3 solution were also tested as controls for comparison. 进一步比较了儿茶素-银纳米溶液与青霉素等对照样品的抑制率。如图 7所示, 儿茶素-银纳米溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌都有较高的抑制率。由于这3种微生物分别是典型的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌,因此可以得出结论,儿茶素-银纳米溶液具有广泛的抗菌活性。儿茶素-银纳米溶液对白色念珠菌的抑制率高于AgNO3溶液和青霉素溶液,对金黄色葡萄球菌的抑制率略低于AgNO3溶液和于青霉素,对大肠杆菌的抑制率略高于AgNO3溶液且等于青霉素溶液。从图 7中可以看出,儿茶素-银纳米溶液的抑制率均高于儿茶素溶液。虽然儿茶素本身也具有抗菌活性,但是活性比较弱。根据上述抑菌结果,可以得出儿茶素-银纳米材料具有广谱的抗菌活性。
图 7
在本实验中,Ag纳米粒子被认为是儿茶素-银纳米溶液的抗菌活性的主要来源,近年来有许多研究者认为银纳米粒子具有有效的抗菌活性主要的原因是银纳米粒子可以释放银原子或离子[12]。根据研究已经知道银离子发挥其抗菌活性是通过与生物配体如核酸、蛋白质和细胞膜发生配体交换反应[13]。银原子还对细菌细胞壁上的含硫和磷的化合物具有高亲和力,因此银纳米粒子与细菌细胞表面的直接相互作用有助于它们结合并进入细菌细胞来破坏细菌[14]。已经有研究证明银纳米可以使细胞膜的透性增加,进而使细胞破裂[15]。
图 8是显示了儿茶素银纳米溶液中Ag离子随时间变化的释放图。用原子吸收光谱法测定了儿茶素银纳米溶液释放的银离子。银纳米粒子在PBS中分散15 d,定期采样释放的银离子。如图 8所示,第一天时银离子质量浓度为0.69 mg/L,第15 d时银离子质量浓度为1.8 mg/L,并且银离子的浓度呈持续升高的状态。所以可以得出儿茶素银纳米材料中释放Ag+是一个可持续的过程。Ag+的持续释放特性与银纳米复合材料中的离子释放的文献报道有些相似[16-17]。
图 8
本研究中儿茶素-银纳米粒子可持续释放Ag+离子,从而对其抑菌活性起着非常关键的作用。大多数银离子来自于银纳米粒子表面零价银原子的氧化,最典型的是与溶液中溶解的氧气反应,并受到纳米粒子周围的质子和其他组分的影响。释放出的银离子可与含有生物活性巯基的酶发生相互作用,例如与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADH)相结合,破坏细菌产生活性氧(ROS)的呼吸链,导致氧化应激和细胞损伤。银纳米粒子的抗菌性能与其尺寸也密切相关,本研究中制备的儿茶素-银纳米粒子的平均直径为22.7 nm,粒径较小,比表面积较大,有利于其表面的银原子逐步氧化或以儿茶素-银的可溶性复合物缓慢释放。另外,儿茶素-银纳米粒子也有可能直接与细菌表面的膜蛋白产生相互作用,从而增加细胞壁的通透性,破坏细胞结构的完整性,来达到抑菌的效果。此外,银纳米粒子表面包裹的儿茶素是植物多酚类物质,它本身对细菌和真菌具有一定的抑制作用,因而制备得到的儿茶素-银纳米粒子复合材料具有一定的协同效应而具有较高的抑菌活性。
3. 结论
本研究通过一步水热合成法合成了儿茶素-银纳米复合材料,其中儿茶素既为还原剂又是稳定剂。紫外光谱测定显示儿茶素-银纳米胶体在418 nm处出现银纳米粒子的特征吸收峰。儿茶素-银纳米材料的FTIR光谱特征吸收与纯儿茶素样品非常一致,此结果表明儿茶素包裹在银纳米粒子的表面。TEM观察结果显示儿茶素银纳米材料为球形粒子,粒子平均直径为22.7 nm(n=100)。XRD结果表明,合成的银纳米粒子具有面心立方晶体结构。抑菌实验结果表明,儿茶素-银纳米复合粒子对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及白色念球菌均有很强抑制作用,尤其对白色念球菌的抑制作用最强。儿茶素-银纳米粒子强抑菌活性可归因于其表面Ag+的持续释放。本研究中儿茶素-银纳米复合材料有望应用于长效抑菌制剂产品。
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表 1 能谱测得的儿茶素-银纳米材料的元素含量(物质的量分数)
Table 1. The element content of Catechin-Ag nanoparticles
Element Mass fraction/% Molar fraction/% C, K 13.10 53.58 O, K 2.61 8.01 Ag, K 84.30 38.41 表 2 儿茶素-银纳米粒子对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定值
Table 2. The MIC and MBC of Catechin-AgNPs against E.coli, S.aureus and C.albicans
E.coli S.aureus C.albicans MIC/(μg·mL-1) MBC/(μg·mL-1) MIC/(μg·mL-1) MBC/(μg·mL-1) MIC/(μg·mL-1) MBC/(μg·mL-1) Catechin-AgNPs 19.63 39.26 19.63 39.26 19.63 39.26 Penicillin 12.50 25.00 12.50 25.00 25.00 50.00 Catechin 919.0 1838 459.5 919.0 919.0 1838 AgNO3 9.800 19.60 4.900 9.800 9.800 19.60 *Penicillin, catechin and AgNO3 solution were also tested as controls for comparison. -

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