二硫化钼纳米材料的制备及其对心肌细胞的保护作用

高明 赵开东 刘祥永 金元哲

引用本文: 高明, 赵开东, 刘祥永, 金元哲. 二硫化钼纳米材料的制备及其对心肌细胞的保护作用[J]. 应用化学, 2020, 37(9): 1010-1021. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2020.09.200042 shu
Citation:  GAO Ming, ZHAO Kaidong, LIU Xiangyong, JIN Yuanzhe. Preparation of Molybdenum Disulfide Nanoparticles and the Cytoprotection on Cardiac Myocytes[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2020, 37(9): 1010-1021. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2020.09.200042 shu

二硫化钼纳米材料的制备及其对心肌细胞的保护作用

    通讯作者: 金元哲, 教授; Tel/Fax:024-62043559;E-mail:yzjin@cmu.edu.cn; 研究方向:纳米材料在心血管疾病中的应用
  • 基金项目:

    国家自然科学基金(21575071,21874079)项目资助

摘要: 目前,心血管疾病是世界上导致死亡的主要病因,而氧化应激损伤是心血管疾病的重要发病机制之一。本研究旨在探讨二硫化钼(MoS2)纳米材料在心肌细胞受到氧化应激损伤时的抗氧化保护作用。我们通过一步水热法合成了具备类抗氧化酶活性的MoS2纳米材料。通过MTT比色法、细胞内凋亡、细胞内活性氧(ROS)检测及Western Blot等实验证实MoS2纳米材料(100 μg/mL)可以很好地保护H9c2心肌细胞免受双氧水(H2O2)诱导的氧化应激损伤。同时,还促进了H9c2心肌细胞的增殖。本研究显示了MoS2纳米材料可用于构建针对氧化应激损伤引起的心血管疾病的抗氧化剂防御,为纳米药物在抗心肌氧化损伤研发提供实验数据及理论依据。

English

  • 心血管疾病是最常见的影响人类健康的疾病,占据人类死亡病因30%以上[1-2]。目前研究证明,氧化应激损伤是心血管疾病的重要发病机制之一,能引起多种心血管疾病,例如动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭心肌损伤等[1],而活性氧(ROS)被认为是氧化损伤因子,当机体产生过多的ROS或者细胞接触到高浓度的外源性ROS,会造成线粒体功能障碍、DNA断裂、代谢异常以及细胞死亡等,其参与了心血管疾病的发病过程[3-6]。因此,如何提高氧化应激时心肌细胞的抗氧化能力,减少ROS的产生得到了广泛的关注。

    在正常心肌细胞内,主要通过酶性抗氧化体系维持ROS的水平,主要包括过氧化氢酶(CAT),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)等,而氧化应激时会产生过多的ROS,超出了机体酶性抗氧化体系的清除能力[6]。随着纳米技术的发展,人们发现一些纳米材料具备内在类酶活性,如GPx[7]、氧化酶[8]及SOD[9]等,具有取代特定酶的能力,同时与天然酶相比,纳米酶在多个方面均具有优势,例如成本低、易于批量生产、高稳定性以及易于长期储存等[10。二硫化钼(MoS2)纳米材料目前已被广泛用于发射晶体管、传感器、光电及生物医学成像等[11-12]。MoS2纳米材料具有高的生物稳定性,良好的生物相容性和低的细胞毒性[13-14],目前已经证实MoS2纳米片具备CAT、过氧化物酶(POD)及SOD类酶活性[15]。因此,MoS2纳米材料具备作为一种新型天然抗氧化剂的可能。

    本研究中,通过水热法合成MoS2纳米材料,证实了其存在类抗氧化酶活性(Scheme 1)。由于双氧水(H2O2)为ROS的主要来源,用H2O2预处理心肌细胞(H9c2),进行一系列细胞内ROS、细胞凋亡、Western Blot及MTT等相关检测,揭示MoS2纳米材料对心肌细胞的抗氧化保护能力。

    Scheme 1

    Scheme 1.  Preparation of MoS2 nanoparticles(A), the reactive oxygen species removal progress of SOD-CAT-POD and MoS2 nanoparticles mimic intracellular antioxidant enzyme activities(B). RH2 and R represent the reducing substrate and oxidizing substrate, respectively

    钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)及硫代乙酰胺(C2H5NS)(>99.5%,上海麦克林生化科技有限公司);N, N-二甲基甲酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮及盐酸(分析纯,山东莱阳精细工厂);磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、二甲基亚砜(DMSO)及硫酸奎宁(分析纯,天津富宇集团);过氧化氢(分析纯,天津红岩工厂);超纯水(青岛富勒姆集团);青链霉素混合液、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、30%丙烯酰胺及双丙烯酰胺溶液、Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒(北京索莱宝公司);DMEM高糖培养基及胎牛血清(美国Gibco公司);3-(4, 5-二甲基噻唑2)-2.5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(美国Sigma公司);5-叔丁氧羰基-5-甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(BMPO)(上海Dojindo科技公司);ROS荧光法测试盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司);兔抗人Bax及Bcl-2抗体、GAPHD抗体及羊抗兔IgG(美国Santa Cruz公司);3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)(美国Alfa Aesar公司)。

    GZX-9070MBE型电热鼓风干燥箱(中国上海博讯实业有限公司医疗设备厂);SU8OIO型扫描电子显微镜(SEM,日本日立集团);XB220A型电子天平(中国上海普利赛斯集团);FBZ1002-UP标准试剂型纯水机(中国青岛富勒姆集团);IX53型荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);SPI3800N型原子力显微镜(AFM)及Rigaku D-MAX 2500 X型射线衍射仪(XRD,日本理学公司);XDS-1B型倒置生物显微镜(中国重庆光电仪器有限公司);Mapada UV-2200型紫外分光光度计(中国上海美普达仪器有限公司);ESCALAB MK II型X射线光电子能谱仪(XPS)、CO2恒温培养箱、Multiskan MK3酶联免疫检测仪及LEGEND X1离心机(美国Thermo Fisher公司);XY-XWH型涡旋混合器(中国上海昕仪仪器仪表有限公司);WB系统及凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司);IMS-40型制冰机(中国山东瑞康医药股份有限公司);A300-10/12型电子自旋共振谱仪(ESR,德国Bruker公司)。

    本实验采用水热法合成制备MoS2纳米材料:首先,称取30 mg钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)和60 mg硫代乙酰胺(C2H5NS)于20 mL去离子水中得到透明混合溶液,将其装入30 mL反应釜中,在200 ℃条件下反应24 h(180 ℃反应,材料最终团聚现象较明显)。待反应结束后取上清,离心(10000 r/min)20 min,弃掉沉淀,重复3次。将得到的上清液用纤维素透析袋((MWCO)=500~1000)过夜透析,最后得到的淡黄色液体为成品。通过冷冻干燥的方式计算样品浓度。

    1.3.1   扫描电子显微镜(SEM)检测

    将1.2节得到的淡黄色上清液直接滴加到硅片上,待自然风干后在扫描电子显微镜下观测。每组随机选取3个视野。

    1.3.2   X射线衍射(XRD)及X射线光电子能谱(XPS)检测

    将1.2节得到的淡黄色上清液直接滴加到硅片上烘干,重复滴加烘干多次,然后在X射线衍射仪及X射线光电子能谱仪下检测。

    1.4.1   电子自旋共振(ESR)谱检测

    100 mg MoS2纳米材料加入装有200 mL甲醇的烧杯中,超声0.5 h分散纳米材料,移取100 μL的溶液,加入10 mg/L的BMPO甲醇溶液,毛细吸管吸取溶液,加入石英核磁管中,在ESR谱中进行测试,具体检测方法同已发表的文献[15-16]

    1.4.2   对苯二甲酸(TA)检测羟自由基(·OH)

    TA是一种非荧光化合物,它可以捕获·OH,产生高度荧光的2-羟基对苯二甲酸(TAOH),用于检测·OH[17]。具体方法类似已发表的文献[15],简要过程为:用25 mmol/L pH=7.4磷酸缓冲液制备了含TA(0.5 mmol/L)、H2O2(10 mmol/L)和不同浓度MoS2纳米材料的溶液。室温下反应12 h后进行荧光分析。激发波长为320 nm,发射峰为425 nm。

    1.4.3   CAT活性检测

    具体的检测方法类似于早期发表的文献[18]。简要描述为:首先配制EuTc溶液,即取5 mL氯化铕溶液(EuCl3, 6.3 mmol/L)和5mL盐酸四环素溶液(2.1 mmol/L)加入到40 mL的MOPS缓冲液(10 mmol/L)中混匀。其中,EuCl3和盐酸四环素溶液均是以MOPS缓冲液为溶剂配制。将1650 μL MOPS、200 μL EuTc、100 μL MoS2纳米材料及100 μL H2O2依次加到离心管中充分混匀,相应的设置对照组和空白组,在室温下放置10 min后进行荧光分析。最佳激发波长405 nm,最佳发射波长620 nm。

    选取生长良好的H9c2细胞,重悬后将其接种于96孔板内,接种密度为1×104个/mL,每孔加入含有细胞的100 μL重悬液。设置空白组(只含血清的培养基)、对照组(不加入纳米材料)和实验组,放入37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h,然后向实验组中每孔加入100 μL的MoS2,最终浓度分别为5、12.5、25、50、75及100 μg/mL,每个浓度设置6个复孔,其它组加入等量的培养基,再次置于细胞培养箱中培养24 h。弃去所有培养基,使用PBS清洗2次,随后每孔加入100 μL培养基,然后加入MTT溶液(5 mg/mL),每孔加入20 μL,放回细胞培养箱中继续培养4 h,弃去所有培养基后加入DMSO,每孔150 μL,避光振摇15 min后使用酶联免疫检测仪测定490 nm波长处的吸光度(OD值)。

    选取生长良好的H9c2细胞,重悬后将其接种于96孔板内,接种密度为1×104个/mL,每孔加入含有细胞的100 μL重悬液。设置空白组(只含血清的培养基)、对照组(不加入H2O2)和实验组,放入37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h,然后向实验组中每孔加入100 μL的H2O2,最终浓度分别为50、100、150、200、260和333 μmol/L,每个浓度设置6个复孔,其它组加入等量的培养基,再次置于细胞培养箱中培养2 h。余下过程同MoS2纳米材料的细胞毒性实验。

    选取生长良好的H9c2细胞,重悬后将其接种于96孔板内,接种密度为1×104个/mL,每孔加入含有细胞的100 μL重悬液。设置空白组(只含血清的培养基)、对照组(不加入纳米材料)和实验组,放入37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h,向实验组中每孔加入100 μL的MoS2,最终质量浓度分别为5、12.5、25、50、75及100 μg/mL,每个浓度设置6个复孔,其它组加入等量的培养基,置于细胞培养箱中培养24 h。然后向对照组及实验组中每孔加入100 μL的H2O2,最终浓度为333 μmol/L,空白组加入等量的培养基,再次置于细胞培养箱中培养2 h,然后余下过程同MoS2纳米材料的细胞毒性实验。

    选取生长良好的H9c2细胞,加入MoS2纳米材料100 μL,加入后质量浓度分别为50和100 μg/mL,继续放入37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h,然后加入500 μL的H2O2,加入后浓度为333 μmol/L,继续培养2 h后用PBS洗涤2遍。之后应用Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂染色。严格按照试剂盒上说明配置工作液后,离心收集细胞(1000 r/min,5 min)。用1×测定缓冲液充分清洗细胞2~3次。用1×测定缓冲液制备细胞悬液,使其密度为1×105(细胞)/mL。取100 μL染色工作液加入200 μL细胞悬液内,混匀,37 ℃孵育15 min。荧光显微镜下使用490 nm激发滤片同时检测活细胞(黄、绿色荧光)以及死细胞(红色荧光),随机挑选不同视野拍片。

    选取生长良好的H9c2细胞,加入MoS2纳米材料100 μL,加入后质量浓度分别为50和100 μg/mL,继续放入37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h,然后加入500 μL的H2O2,加入后浓度为333 μmol/L,继续培养2h后用PBS洗涤2次。离心收集细胞(1000 r/min,5 min),PBS洗涤1次,重悬细胞并计数。取1×105重悬的细胞,离心收集细胞(1000 r/min,5 min),PBS洗涤1次,加入10 μmol/L的DCFH-DA重悬细胞,细胞浓度为1×105/mL。37 ℃,避光孵育细胞1 h,每隔3~5 min混匀一下,使探针和细胞充分接触。离心收集细胞(1000 r/min,5 min),用1×Buffer Solution洗涤2、3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。将收集好的细胞沉淀物重悬后,用荧光显微镜观察检测。

    方法类似已发表的文献[19]。具体为:选取生长良好的H9c2细胞,重悬后将其接种于6孔板内,接种密度为1×105个/mL,每孔加入含有细胞的1 mL重悬液,放入37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h。弃去培养液,每孔加入900 μL培养液,加入MoS2纳米材料100 μL,加入后质量浓度分别为50和100 μg/mL,继续培养24 h,然后加入500 μL的H2O2,加入后浓度为333 μmol/L,继续培养2 h,收集细胞,每组加入含1 mmol/L蛋白酶抑制剂(PMSF)的细胞裂解液,冰上充分裂解30 min,4 ℃离心(1000 r/min,5 min),收集上清液。超声后取15 μL上清液,经15%的SDS-PAGE分离后,转移到PVDF膜上,用含质量分数为5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h;分别加入用2%脱脂奶粉TBST稀释的Bax(质量比1: 1000,下同)、Bcl-2(1: 1000)和GAPDH(1: 1000)的一抗,4 ℃过夜孵育,用TBST洗膜3次,每次10 min,加入HRP标记的羊抗兔IgG(1: 3000),室温孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min,用ECL超敏化学发光试剂盒显影。

    所有的实验至少重复3次,同时实验数据均以均数±标准差(x±SD)呈现。统计学分析应用SPSS14.0软件(美国芝加哥SPSS公司)检测。*P<0.05认为具有统计学意义,* *P<0.01及* * *P<0.001认为具有显著统计学意义。

    本实验中的MoS2纳米材料是通过水热法制备而成(Scheme 1A)。通过SEM观察MoS2纳米材料的形貌和粒径大小。如图 1A1B所示,合成的MoS2主要呈现圆球形结构,粒径大小波动在0.6~0.9 μm之间,平均粒径大小为0.75 μm。通过XRD进一步对产物的晶体进行了分析。如图 1C所示,其特征峰2θ为13.35°、29.20°、33.50°、35.10°、39.35°和59.05°,分别对应的晶面为(002)、(004)、(101)、(102)、(103)和(110),与2H型MoS2的标准图谱(JCPDS 37-1492)上的衍射峰出现的位置基本吻合,产物为六方晶系,是纯净度较高的MoS2纳米材料,与早前发表的文献一致[12, 20]。通过XPS对合成的MoS2纳米材料进一步行组成元素分析。如图 1D及1E所示,分别是MoS2纳米材料的Mo3d和S2p峰拟合图。通过与已发表的文献[21-22]对比和查找XPS元素结合能表得知,图 1D中230.5和233.5 eV处两个峰对应的是MoS2中Mo3d5/2和Mo3d3/2图 1E中161.95和163.25 eV处两个峰分别对应S2p3/2和S2p1/2。通过XPS分析,进一步确定了合成的产物为MoS2

    图 1

    图 1.  MoS2纳米材料的SEM显微照片(A和B),XRD谱图(C)以及XPS中Mo和S曲线(D和E)
    Figure 1.  SEM images of MoS2 nanoparticles(A and B), XRD pattern(C) and XPS curves of Mo and S(D and E)

    SOD具有超氧化物歧化能力,可以催化超氧阴离子自由基(O2·)分解为普通的O2和H2O2[23]。黄嘌呤(Xan)/黄嘌呤氧化酶(XOD)混合物可以产生O2·,通过BMPO的自旋捕获,形成BMPO/·OOH,在ESR检测时形成特征谱线[4]。如图 2A所示,在中性条件下,对照组(即Xan/XOD混合物组)中ESR有4条相对强度为1: 1: 1: 1的特征性谱线。而添加了MoS2纳米材料的实验组,因其消除了O2·使ESR信号强度显著降低,表明材料具有类SOD活性。

    图 2

    图 2.  MoS2纳米材料的类SOD(A)、POD(B)及CAT(C)酶活性检测
    Figure 2.  SOD(A), POD(B) and CAT(C) activities detection of MoS2 nanoparticles

    在代谢过程中,H2O2会通过Fenton反应生成高反应性的·OH。MoS2纳米材料的类POD活性是基于其催化H2O2分解生成H2O而清除·OH的能力,因此进行了荧光实验来监测MoS2纳米材料与H2O2之间的相互作用过程中·OH的清除情况[24]。在这种情况下,采用TA是因为它可捕获·OH并变成TAOH,一种在425 nm附近具有峰值的荧光剂。如图 2B所示,在反应12 h后,TA、H2O2和MoS2纳米材料组的溶液中的荧光强度明显低于TA和H2O2组的混合物。此外,将TA和MoS2纳米材料一起孵育时未观察到荧光,这显然表明不存在·OH。以上结果表明MoS2纳米材料可以明显地清除·OH,具备类POD活性。

    CAT是几乎所有暴露于O2下的活生物体内的一种常见酶,具有催化H2O2分解成O2的能力[25]。通过EuTc溶液的荧光CAT测定法研究了MoS2纳米材料的类CAT活性[26]。如图 2C所示,单独的EuTc组不发荧光,而EuTc与H2O2形成的过氧化氢复合物(EuTc-HP)组具有很高的荧光强度。EuTc、H2O2及MoS2纳米材料的实验组中,荧光强度明显降低,反应了H2O2被大量分解清除,进一步确定了纳米材料的类CAT活性。

    综上所述,MoS2纳米材料在生理条件下表现出类抗氧化酶活性,包括SOD,CAT和POD活性(Scheme 1B)。像MoS2、硒化铁及硫化铁等这样的纳米粒子往往具有大的表面积与体积之比,相对于基于蛋白质的酶,其增强了结合能力,并且与H2O2具有很高的亲和力,从而促进了底物的结合和随后的电子转移[10]。MoS2纳米材料表面存在未成对电子Mo6+/Mo4+,其所具备的类抗氧化酶特性与此有关[27]。MoS2纳米材料表面上带正电的Mo4+离子被O2·-吸引,从而促进了O2·-的电子转移(见式(1)和(2)),使其具备类SOD活性。由于H2O2分子不稳定,在具有类CAT活性的MoS2纳米材料的存在下加速了其分解,这可能归因于Mo6+在H2O2上的较高氧化能力(见式(3)和(4)) [15]。MoS2表面的Mo6+与Mo4+之间的不断氧化还原过程使其具备了类POD活性,而纳米材料的类POD活性只是加速了还原底物(如3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺,TMB)和H2O2之间的电子转移,并不产生·OH(见式(4)和(5))[28]。在有氧生物中,SOD、CAT和POD构成了抵抗氧化应激的必要部分。所以,具有这3种类酶样活性的MoS2纳米材料可用于构建抗氧化剂系统,催化O2·-分解为H2O2,然后将H2O2分解为O2和H2O,在氧化应激损伤中提供一系列保护。反应式如下:

    $ \text{M}{{\text{o}}^{4+}}+\text{O}_{2}^{\cdot -}+{{\text{H}}^{+}}\to \text{M}{{\text{o}}^{6+}}+{{\text{H}}_{2}}{{\text{O}}_{2}} $

    (1)

    $ \text{M}{{\text{o}}^{6+}}+\text{O}_{2}^{\cdot -}\to \text{M}{{\text{o}}^{4+}}+{{\text{O}}_{2}}+{{\text{H}}^{+}} $

    (2)

    $ \text{M}{{\text{o}}^{6+}}+{{\text{H}}_{2}}{{\text{O}}_{2}}+2\text{O}{{\text{H}}^{-}}\to \text{M}{{\text{o}}^{4+}}+{{\text{O}}_{2}}+2{{\text{H}}_{2}}\text{O} $

    (3)

    $ \text{M}{{\text{o}}^{4+}}+{{\text{H}}_{2}}{{\text{O}}_{2}}\to \text{M}{{\text{o}}^{6+}}+2\text{O}{{\text{H}}^{-}} $

    (4)

    $ \text{M}{{\text{o}}^{6+}}+\text{TMB}+2\text{O}{{\text{H}}^{-}}\to \text{M}{{\text{o}}^{4+}}+\text{ox}-\text{TMB}+2{{\text{H}}_{2}}\text{O} $

    (5)

    目前,MTT比色法被广泛应用于评价药物及材料的细胞毒性。本研究中,MMT比色法被用于评估材料的生物相容性及对细胞的保护能力。如图 3A所示,在正常的H9c2细胞中,给予不同质量浓度的MoS2纳米材料(5、12.5、25、50、75及100 μg/mL)处理24 h后,与对照组相比,随着材料浓度的增加,不仅没有降低细胞的活力,反而进一步促进了细胞的增殖(P<0.001)。目前,已知不同的纳米材料可以通过影响基因来控制细胞周期进程以及诱导促凋亡或抗凋亡基因的表达。MoS2纳米材料主要考虑通过其一方面加速细胞周期进程,另一方面降低细胞的凋亡来促进细胞生长和增殖[29]。细胞在正常的代谢过程中,本身会产生ROS,其会诱发细胞的早期凋亡,而MoS2纳米材料由于其类抗氧化酶活性,消除了ROS,延缓了细胞的凋亡[30],实验结果与早前发表的文献结果类似[29]

    图 3

    图 3.  MoS2纳米材料(A)和H2O2(B)对H9c2细胞的细胞毒性,以及H2O2诱导下MoS2纳米材料对H9c2细胞的活性影响(C)。数据分析以x ± SD呈现(n=3;* * *P﹤0.001)
    Figure 3.  Cytotoxicity of MoS2 nanoparticles(A) and H2O2(B) on H9c2 cells, and the effect of MoS2 nanoparticles on H2O2-induced cytotoxicity on H9c2 cells(C). The statistical data are presented as mean x ± SD(n=3;* * *P﹤0.001)

    H2O2是ROS的主要成分,也是一种氧化代谢的中间产物,当H2O2浓度积累到一定程度就会引起细胞的损伤。外源性给予H2O2可造成氧化应激损伤模型。如图 3B所示,MTT法检测结果显示,与对照组比较,不同浓度的H2O2(50、100、150、200、260和333 μmol/L)处理2 h均可降低H9c2心肌细胞的存活率,并且随着H2O2浓度的增加,对H9c2细胞的抑制率逐渐增加(P<0.001),表明H2O2可以引起细胞死亡,在一定范围内呈剂量依赖性。在H2O2浓度为333 μmol/L时,心肌细胞存活率达到了44.70%,接近并低于50.00%,这说明333 μmol/L浓度的H2O2能够诱导适当的氧化应激损伤和细胞活力,氧化应激损伤模型成功,与早前的文献结果类似[31-32]。H2O2诱导心肌细胞损伤适合模拟体内氧化应激这一许多心血管疾病共同的病理生理过程。

    给予不同质量浓度MoS2纳米材料(5、12.5、25、50、75及100 μg/mL)处理24 h后,加入H2O2(333 μmol/L)处理2 h。如图 3C所示,MTT检测结果显示,与单纯H2O2组相比,不同质量浓度MoS2纳米材料预处理均可改善细胞的存活率,并随着质量浓度的增加而增高,于质量浓度为100 μg/mL时保护作用最大(P<0.001)。实验证明,MoS2纳米材料对H2O2诱导H9c2细胞的氧化应激损伤有保护作用,并在一定质量浓度范围内呈量效关系。表明随着材料质量浓度的增加,大量的ROS被清除,保护并促进了细胞的增殖。

    为了进一步明确MoS2纳米材料是否可减轻氧化应激诱导的心肌细胞凋亡,采用了Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂染色后荧光镜下观测。Calcein-AM是一种仅对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,当其进入到细胞质后,酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内,发出强绿色荧光。作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜,它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核,并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光,PI仅对死细胞染色。因此,绿色荧光量的多少代表了活细胞的数量。如图 4A所示,相比于空白组,H2O2组的绿色荧光量明显减少,表明细胞凋亡明显增多;而与H2O2组相比,MoS2纳米材料组(50和100 μg/mL)均明显抑制了细胞的凋亡,并且100 μg/mL材料组相对于空白组,还促进了细胞的增殖。为进一步证实细胞凋亡结果,通过ImageJ软件分析了各组绿色荧光相对应的光密度。空白组的光密度设置为“1”,相对光密度为各个组计算所得的光密度除以空白组的光密度。如图 4B所示,100 μg/mL材料组中的信号强度最强(P<0.001),分别是H2O2组、50 μg/mL材料组及空白组的2.34、1.68和1.51倍。

    图 4

    图 4.  H9c2细胞经PBS(对照组)、H2O2、50和100 μg/mL的MoS2纳米材料处理后的细胞凋亡检测(A)及计算所得的相对光密度(B)
    Figure 4.  The detection of apoptosis on H9c2 cells after being treated by PBS as a control, H2O2, 50 μg/mL and 100 μg/mL MoS2 nanoparticles (A), and relative optical densities(B)

    The statistical data are presented as mean x ± SD(n=3; * * *P < 0.001)

    上述结果表明,MoS2纳米材料组通过对抗H2O2,明显地降低了细胞的凋亡,并且随着材料质量浓度的增高,效果明显增强,与之前的MTT结果相一致,证明MoS2纳米材料对H2O2诱导的氧化应激损伤有很强的细胞保护作用。

    为了确定MoS2纳米材料预处理对心肌细胞氧化应激指标ROS的影响,本实验采用荧光探针DCFH-DA进行荧光镜下观测。DCFH-DA自身没有荧光,进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。在ROS存在时DCFH被氧化为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质DCF,强度与细胞内ROS水平成正比[29]。如图 5A所示,与空白组相比,H2O2组细胞内荧光强度明显增强,表明H2O2诱导H9c2细胞内产生了大量的ROS。而经过MoS2纳米材料预处理后,细胞荧光强度显著下降,表明应用材料预处理后可明显减少细胞内ROS的产生。并且随着材料组浓度的增加,清除ROS的效果增强。当细胞受刺激发生氧化应激损伤时,为了降低损伤对细胞的影响,通常抗氧化酶的活力会增强来消除因刺激产生的过多的ROS[33]。通过ImageJ软件分析了各组绿色荧光相对应的光密度,来进一步了解细胞内ROS情况。如图 5B所示,100 μg/mL材料组中的信号强度最弱,而H2O2组的信号强度最强,是100 μg/mL材料组的2.3倍(P<0.001)。

    图 5

    图 5.  H9c2细胞经PBS(对照组)、H2O2、50和100 μg/mL的MoS2纳米材料处理后的细胞内ROS检测(A)及计算所得的相对光密度(B)
    Figure 5.  The detection of ROS on H9c2 cells after being treated by PBS as a control, H2O2, 50 μg/mL and 100 μg/mL MoS2 nanoparticles (A), and relative optical densities(B)

    The statistical data are presented as mean x ± SD(n=3;* * *P﹤0.001)

    上述结果显示,H2O2加入后细胞内ROS明显增多,而通过MoS2纳米材料预处理后的细胞内ROS明显减少,证明了MoS2纳米材料的类抗氧化酶活性特征,具有强大的抗氧化作用和自由基清除能力,同时进一步阐述了MTT检测及凋亡实验中材料组中细胞存活率升高的原因。

    氧化应激引起的损伤通过线粒体介导的凋亡通路引起细胞凋亡,而Bcl-2家族是线粒体凋亡通路的主要调控者[34]。Bcl-2家族包括抗凋亡成员如Bcl-2,促凋亡成员如Bax,以及死亡蛋白。Bcl-2抗凋亡机制是直接抗氧化,而Bax是线粒体凋亡途径的主要介导者[35]。Bcl-2的上调和Bax的下调能够减轻凋亡的发生[36]。Western Blot结果表明(图 6A),与空白组相比,H2O2组Bcl-2的蛋白表达量明显减少,而Bax的蛋白表达量明显增加;而相比于H2O2组,MoS2纳米材料组的Bcl-2蛋白表达量明显增加,Bax蛋白表达量明显减少。考虑MoS2纳米材料通过抑制Bax基因蛋白的高表达来实现其拮抗H2O2损伤后的H9c2细胞凋亡的作用。通过ImageJ软件分析了各组相对的蛋白定量。如图 6B6C所示,相比于H2O2组,100 μg/mL MoS2纳米材料组在使Bcl-2蛋白表达增高的同时(P<0.001),明显地下调了Bax蛋白表达量(P<0.001)。

    图 6

    图 6.  H9c2细胞经PBS(对照组)、H2O2、50和100 μg/mL的MoS2纳米材料处理后的细胞相关凋亡蛋白的检测(A)及Bax(B)与Bcl-2(C)的定量分析。数据分析以x ± SD呈现(n=3;* * *P﹤0.001)
    Figure 6.  The detection of apoptosis protein on H9c2 cells after being treated by PBS as a control, H2O2, 50 μg/mL and 100 μg/mL MoS2 nanoparticles(A), and quantitative analysis of Bax(B) and Bcl-2(C)

    The statistical data are presented as mean x ±SD(n=3;* * *P﹤0.001)

    实验结果表明MoS2纳米材料上调Bcl-基因蛋白的同时,下调了Bax基因蛋白,这提示MoS2纳米材料通过改善H2O2诱导的心肌细胞线粒体功能进而减少了线粒体途径介导的心肌细胞凋亡,减轻了心肌细胞的氧化损伤。

    总之,我们成功制备了MoS2纳米材料,并证明了其在生理条件下具备内在的类抗氧化酶样活性,包括SOD、CAT及POD活性,从而可以有效去除包括O2·-、·OH及H2O2在内的多种ROS。成功构造了H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型,MoS2纳米材料对该模型进行了一系列处理。结果表明,该纳米材料具备出色的生物相容性和抗H2O2诱导的细胞氧化损伤的保护作用。因此,MoS2纳米材料可用于构建针对氧化应激损伤引起的心血管疾病的抗氧化剂防御,为纳米药物在抗心肌氧化损伤研发提供实验数据及理论依据。


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  • Scheme 1  Preparation of MoS2 nanoparticles(A), the reactive oxygen species removal progress of SOD-CAT-POD and MoS2 nanoparticles mimic intracellular antioxidant enzyme activities(B). RH2 and R represent the reducing substrate and oxidizing substrate, respectively

    图 1  MoS2纳米材料的SEM显微照片(A和B),XRD谱图(C)以及XPS中Mo和S曲线(D和E)

    Figure 1  SEM images of MoS2 nanoparticles(A and B), XRD pattern(C) and XPS curves of Mo and S(D and E)

    图 2  MoS2纳米材料的类SOD(A)、POD(B)及CAT(C)酶活性检测

    Figure 2  SOD(A), POD(B) and CAT(C) activities detection of MoS2 nanoparticles

    图 3  MoS2纳米材料(A)和H2O2(B)对H9c2细胞的细胞毒性,以及H2O2诱导下MoS2纳米材料对H9c2细胞的活性影响(C)。数据分析以x ± SD呈现(n=3;* * *P﹤0.001)

    Figure 3  Cytotoxicity of MoS2 nanoparticles(A) and H2O2(B) on H9c2 cells, and the effect of MoS2 nanoparticles on H2O2-induced cytotoxicity on H9c2 cells(C). The statistical data are presented as mean x ± SD(n=3;* * *P﹤0.001)

    图 4  H9c2细胞经PBS(对照组)、H2O2、50和100 μg/mL的MoS2纳米材料处理后的细胞凋亡检测(A)及计算所得的相对光密度(B)

    Figure 4  The detection of apoptosis on H9c2 cells after being treated by PBS as a control, H2O2, 50 μg/mL and 100 μg/mL MoS2 nanoparticles (A), and relative optical densities(B)

    The statistical data are presented as mean x ± SD(n=3; * * *P < 0.001)

    图 5  H9c2细胞经PBS(对照组)、H2O2、50和100 μg/mL的MoS2纳米材料处理后的细胞内ROS检测(A)及计算所得的相对光密度(B)

    Figure 5  The detection of ROS on H9c2 cells after being treated by PBS as a control, H2O2, 50 μg/mL and 100 μg/mL MoS2 nanoparticles (A), and relative optical densities(B)

    The statistical data are presented as mean x ± SD(n=3;* * *P﹤0.001)

    图 6  H9c2细胞经PBS(对照组)、H2O2、50和100 μg/mL的MoS2纳米材料处理后的细胞相关凋亡蛋白的检测(A)及Bax(B)与Bcl-2(C)的定量分析。数据分析以x ± SD呈现(n=3;* * *P﹤0.001)

    Figure 6  The detection of apoptosis protein on H9c2 cells after being treated by PBS as a control, H2O2, 50 μg/mL and 100 μg/mL MoS2 nanoparticles(A), and quantitative analysis of Bax(B) and Bcl-2(C)

    The statistical data are presented as mean x ±SD(n=3;* * *P﹤0.001)

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  • 发布日期:  2020-09-01
  • 收稿日期:  2020-02-17
  • 接受日期:  2020-04-28
  • 修回日期:  2020-03-23
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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