English

• 生命体系中的硫醇小分子如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)在氧化还原稳态和细胞生长，甲基转移和辅酶A相关的反应等生理过程中具有重要作用^[1]。 硫醇分子浓度的异常与一些重要疾病如癌症、艾滋病、老年痴呆症和心血管疾病的形成密切相关^[2-4]。 GSH是细胞内最丰富的生物硫醇之一，其结构中的巯基在含巯基分子和二硫化物二者之间存在着氧化与还原的平衡，由此可参与对细胞的保护和解毒，细胞内的硫醇水平在氧化应激反应中的变化，会对细胞产生氧化还原的调节作用，可作为氧化还原调节剂^[5]。 GSH浓度的变化与包括帕金森病、免疫功能障碍、肝脏疾病和许多类型的癌症有关^[6-7]。 快速、灵敏和选择性地检测GSH在医学方面具有重要意义。 荧光探针被认为是监测细胞内分析物的有效分子工具^[8-9]。 迄今为止，已开发出许多识别检测GSH的方法，如高效液相色谱法(HPLC)^[10]、毛细管电泳^[11]以及电化学方法^[12]等。 这些方法大多都需要复杂且较昂贵的仪器和繁琐的预处理程序，使得在实际使用中具有一定的局限性。 在各种检测GSH的策略中，荧光探针光学测定法^[13]，具有简单便捷、稳定性强和灵敏度高等优点，能够对待测样品进行有效的实时检测，在临床医学、化学、生物学以及环境等领域受到广泛关注^[14-15]。

  喹啉酮是一种具有高荧光量子产率和高稳定性的荧光团^[16]，其衍生物可作为荧光传感器^[17]。 喹啉酮类衍生物还具有良好的生物相容性，含有喹啉酮组块的许多类药物也已在临床疾病的预防和治疗中得到应用^[18]。 依布硒啉在与巯基反应时，硒杂环结构中Se—N键会发生断裂^[19]，可应用此性质将其作为荧光分子的反应位点。 由于GSH具有巯基，通过巯基提供的具有亲核性的HS^-，使探针分子中硒氮(—Se—N—)断裂，可导致探针分子结构发生改变，进而产生荧光强度的变化以达到检测目的^[20-22]。 因此，若首先将荧光团喹啉酮MQ1中7号位氨基与顺式马来酸酐进行酰化等多步反应制备得到产物MQ4，后者经环化引入含巯基的噁二唑衍生物MQ5，最后与硒啉组块SQ6反应，即可将喹啉酮与依布硒啉共筑于同一分子中，该分子有望作为检测生物硫醇的荧光探针。 目标分子的合成路线如Scheme 1所示。

  图 1

  

  Figure 1.  Synthetic route of target product MNQ

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  1.   实验部分

  1.1   试剂和仪器

  半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、高半胱氨酸(Hcy)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Proline)、缬氨酸(Valine)、谷氨酸(Glutamic acid)、苯丙氨酸(Phenylalanine)、丙氨酸(Alanine)、蛋氨酸(Methionine)、色氨酸(Tryptophan)、亮氨酸(Leucine)、赖氨酸(Lysine)、酪氨酸(Tyrosine)、甘氨酸(Glycine)、间苯二胺和乙酰乙酸乙酯均购于阿拉丁化学试剂公司；甲苯、对甲苯磺酸、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、冰乙酸、甲醇、乙醇、浓盐酸、浓硫酸、水合肼、二硫化碳、氯化亚砜、氢氧化钾均购于天津市科密欧化学试剂有限公司；甲苯、对溴苯胺购于国药集团化学试剂有限公司。 所用试剂均为分析纯

  Avance-500MHz型核磁共振波谱仪(NMR，瑞士Bruker公司);F-7000型荧光光谱仪(日本日立公司)；Agilent 6224型高分辨质谱仪(HRMS, 美国Agilent公司)；TENSOR27型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR, 德国Bruker AXS公司)；WFH-203B型三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司)；X-5型数字显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司)；Lambda35型紫外可见分光光度计(UV-Vis，美国珀金埃尔默公司)。

  1.2   实验方案

  1.2.1   中间体MQ1和MQ2的合成

  中间体化合物MQ1和MQ2根据文献[23]的方法合成，产物均为淡黄色固体，收率分别为74.8%和65.4%，mp分别为279.4~280.2 ℃和232.7~233.5 ℃。

  MQ1  ¹H NMR(500 MHz, DMSO-d₆), δ:11.07(s, 1H, Ar—NH), 7.30(d, J=8.65 Hz, 1H, PhH), 6.42(d, J=8.65 Hz, 1H, PhH), 6.34(s, 1H, PhH), 5.91(s, 1H, ArH), 5.68(s, 2H, —NH₂), 2.25(s, 3H, CH₃)。

  MQ2  ¹H NMR(500 MHz, DMSO-d₆), δ:12.85(s, 1H, COOH), 11.54(s, 1H, Ar—NH), 10.57(s, 1H, NH), 7.84(d, J=1.90 Hz, 1H, CH), 7.65(d, J=8.70 Hz, 1H, PhH), 7.33(m, 1H, CH), 6.49(d, J=7.55 Hz, 1H, PhH), 6.34(d, J=7.00 Hz, 1H, PhH), 6.27(s, 1H, ArH), 2.37(s, 3H, CH₃)，所得结果与文献值相符。

  1.2.2   中间体MQ3的合成

  取2.6 mmol MQ2[ST]于100 mL烧瓶中，加入20 mL甲醇升温至68 ℃，缓慢滴加2 mL浓硫酸，继续回流8 h，TLC监测反应进程。 反应停止后，冷却至室温，蒸除溶剂，用稀NaHCO₃溶液调PH至中性，过滤，干燥，得MQ3， 棕黄色固体, 收率53.2%;mp 175.8~176.6 ℃; ¹H NMR(500 MHz, DMSO-d₆), δ:11.49(s, 1H, Ar—NH), 10.50(s, 1H, NH), 7.80(d, J=8.10 Hz, 1H, PhH), 7.63(d, J=8.75 Hz, 1H, PhH), 7.30(d, J=7.95 Hz, 1H, PhH), 6.53(d, J=7.65 Hz, 1H, CH), 6, 43(d, J=7.05 Hz, 1H, CH), 6.25(s, 1H, ArH), 3.66(s, 3H, CH₃), 2.36(s, 3H, CH₃);IR(KBr), σ/cm^-1 :3414, 3060, 2933, 1665, 1611, 1562, 1254, 1105, 783。

  1.2.3   中间体MQ4的合成

  取1.5 mmol MQ3于三颈瓶中，加入15 mL甲苯搅拌溶解，逐渐升温至110 ℃，加入4 mL水合肼，继续回流，TLC监测反应进程，补加2 mL水合肼。反应结束后，冷却至室温，析出固体，抽滤，干燥，得MQ4， 棕黄色固体, 收率56.3%;mp 229.5~230.3 ℃;¹H NMR(500 MHz, DMSO-d₆), δ:11.17(s, 1H, Ar—NH), 10.76(s, 1H, NH), 10.12(s, 1H, NH), 7.82(d, J=8.25 Hz, 1H, PhH), 7.45(d, J=8.10 Hz, 1H, PhH), 7.34(d, J=8.30 Hz, 1H, PhH), 6.35(d, J=7.05 Hz, 1H, CH), 6.29(d, J=7.10 Hz, 1H, CH), 6.25(s, 1H, ArH), 4.48(s, 2H, NH₂), 2.34(s, 3H, CH₃);IR(KBr), σ/cm^-1:3412, 3025, 2929, 1680, 1618, 1560, 1250, 1124, 857。

  1.2.4   中间体MQ5的合成

  在室温条件下，取0.75 mmol KOH和0.5 mmol MQ4于三颈瓶中，加入30 mL乙醇，缓慢滴加60 μL CS₂，室温搅拌6 h。 将反应体系转移至油浴中，回流8 h，TLC监测反应进程。 反应停止后，倒入冰水中，用稀盐酸调节pH=4，抽滤，干燥，得MQ5， 棕黄色固体, 收率61.3%;mp 276.8~277.5 ℃;¹H NMR(500 MHz, DMSO-d₆), δ:14.27(s, 1H, SH), 10.43(s, 1H, Ar—NH), 9.86(s, 1H, NH), 7.83(d, J=8.6 Hz, 2H, PhH), 7.78(d, J=8.7 Hz, 1H, PhH), 6.45(d, J=7.10 Hz, 1H, CH), 6.38(d, J=7.15 Hz, 1H, CH), 6.29(s, 1H, ArH), 2.43(s, 3H, CH₃);IR(KBr), σ/cm^-1:3418, 3030, 2982, 2530, 1675, 1660, 1632, 1250, 1110, 764。

  1.2.5   中间体SQ2的合成

  中间体SQ1根据文献[24-25]的方法合成，产物为亮黄色固体, 收率70.2%，mp 63.7~64.3 ℃，中间体SQ2根据文献[26]的方法合成，产物为白色固体, 收率76.3%，mp 194.2~195.1 ℃，所得结果均与文献值相符。

  1.2.6   探针MNQ的合成

  称取0.41 mmol的K₂CO₃和0.3 mmol MQ5置于100 mL三颈瓶中，加入20 mL DMF溶解，再加入0.3 mmol SQ2，室温搅拌，TLC监测反应完成后，抽滤，滤液倒入冰水中，过滤干燥，乙醇重结晶得MNQ， 黄色固体, 收率53.2%;mp ＞300 ℃;¹H NMR(500 MHz, DMSO-d₆), δ:11.10(s, 1H, Ar—NH), 10.52(s, 1H, NH), 8.17(d, J=8.55 Hz, 2H, PhH), 7.99(d, J=8.65 Hz, 2H, PhH), 7.75(d, J=8.45 Hz, 1H, PhH), 7.51(d, J=8.75 Hz, 1H, PhH), 7.25(d, J=8.40Hz, 2H, PhH), 7.05(d, J=8.70 Hz, 2H, PhH), 6.84(s, 1H, PhH), 6.51(d, J=6.95 Hz, 1H, CH), 6.37(d, J=6.90 Hz, 1H, CH), 6.24(s, 1H, ArH), 2.37(s, 3H, CH₃);¹³C NMR(125 MHz, DMSO-d₆), δ:170.26, 169.46, 164.76, 164.23, 163.89, 162.81, 158.23, 144.02, 132.84, 129.09, 127.56, 126.83, 119.07, 115.34, 20.32;IR(KBr), σ/cm^-1:3421, 3030, 2937, 1670, 1635, 1442, 1249, 1200, 1101, 831;HRMS(positive-SIMS) m/z (calcd.), [M+H]⁺:602.0307, found 602.0314。

  1.2.7   溶液配制

  为了研究MNQ对硫醇小分子的识别性能，首先，将探针MNQ溶解在2 mL的DMSO中，然后将其转移至100 mL的容量瓶中，加入二次蒸馏水配制100 mL浓度为2.0×10^-5 mol/L的探针MNQ测试溶液(DMSO/H₂O体积比为1∶49)；其次，称取0.27 g KH₂PO₄、1.42 g Na₂HPO₄、8 g NaCl和0.2 g KCl加入蒸馏水溶解后，用稀盐酸调pH=7.4，配制PBS缓冲溶液。 用PBS缓冲溶液分别配制15种[2.0×10^-5 mol/L，DMSO/PBS(pH=7.4)体积比1∶49]的氨基酸溶液，留置备用。所选用氨基酸为Cys、GSH、Hcy、Ser、Proline、Valine、Glutamic acid、Phenylalanine、Alanine、Methionine、Tryptophan、Leucine、Lysine、Tyrosine和Glycine。

  2.   结果与讨论

  2.1   探针MNQ对GSH的识别

  利用荧光光谱法研究了在荧光探针MNQ对不同氨基酸的选择性识别。 将2.0×10^-5 mol/L探针MNQ测试溶液分别与上述配制的15种2.0×10^-5 mol/L的氨基酸溶液等体积均匀混合，室温下静置2 h，在激发波长λ=330 nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm的条件下，测定探针的荧光发射光谱，测试结果如图 1所示。 图 1A为探针MNQ溶液中存在不同金属离子时的荧光发射光谱图，当荧光探针MNQ溶液中加入GSH后发生显著的荧光猝灭，而在相同条件下加入其它氨基酸时猝灭效果不明显，表明MNQ对GSH具有高选择性的识别能力。 图 1B为探针MNQ溶液中时添加等体积GSH溶液的紫外-可见吸收光谱图。 可见，探针GSH的最大吸收波长为330 nm，向探针MNQ溶液中加入GSH时，330 nm处的吸收峰降低。

  图 1

  

  图 1.  探针MNQ添加不同氨基酸的荧光光谱(A)；探针MNQ添加1倍化学计量GSH的UV-Vis谱图(B)

  Figure 1.  Fluorescence spectra for probe MNQ with addition of different amino acids(A); UV-Vis spectra of probe MNQ with 1 stoichiometry of GSH(B)

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  2.2   荧光滴定

  为了进一步研究荧光探针MNQ对GSH的识别能力，在探针(2.0×10^-5 mol/L)溶液中加入不同浓度GSH的荧光滴定实验，如图 2A所示。 结果发现，随着GSH的浓度逐渐增加荧光强度逐渐减弱，当GSH的浓度为探针浓度的2.2倍化学计量时荧光猝灭程度不再变化，此时体系已达到饱和状态。 根据检测限公式detection limit=3σ/k^[27](式中，σ为空白样的标准偏差即探针在加入检测离子前荧光强度的标准偏差，k为荧光滴定过程中的峰值和相应金属离子浓度作直线图的斜率)，经扫10次空白样，得出σ为2，MNQ对GSH的检测限为2.99×10^-8 mol/L，根据图 2B可得，相关系数R²值为0.99，表明MNQ可作为识别检测GSH的荧光探针。

  图 2

  

  图 2.  探针MNQ添加0~2.2倍化学计量GSH的荧光滴定曲线(A)；探针MNQ溶液中加入GSH的线性关系(B)

  Figure 2.  Fluorescence titration curves of probe MNQwith addition of GSH from 0 to 2.2 stoichiometry(A) and the linear relation of adding GSH into probe MNQ(B)

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  2.3   干扰实验研究

  为探究当其它氨基酸存在时探针对GSH识别检测的影响，进行了干扰实验，结果如图 3所示。 结果发现在2.0×10^-5 mol/L探针MNQ测试溶液中加入其它氨基酸时，荧光猝灭程度无明显变化，但继续向其中加入GSH的溶液后，均发生明显猝灭，表明其它干扰氨基酸存在时，探针对GSH的识别检测无影响，探针对GSH的检测与识别具有较强的抗干扰能力。

  图 3

  

  图 3.  探针MNQ与不同种氨基酸同时存在时与GSH结合的荧光强度柱状图

  Figure 3.  Histogram of the fluorescence intensity of the probe MNQ combined with GSH in the presence of different amino acids

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  2.4   时间响应研究

  为了探究探针MNQ能否快速识别检测GSH，通过荧光光谱研究了荧光探针MNQ对GSH的响应时间，如图 4所示，荧光探针MNQ的荧光强度不受时间影响，当GSH加入至荧光探 针MNQ中，体系均在在35 s内荧光强度逐渐减弱，35 s后荧光强度趋于平稳。

  图 4

  

  图 4.  MNQ荧光光谱对GSH的时间响应

  Figure 4.  Effect of time on the fluorescence response of probe MNQ to GSH

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  2.5   反应机理研究

  由于巯基具有将依布硒啉环中的Se—N键断裂的特性^[28]，GSH分子中含有较活泼的巯基，推测当探针溶液中加入GSH时，GSH分子中的—SH与探针MNQ分子中的硒唑环反应，使Se—N键断裂，破坏了原有的荧光结构，结果发生荧光猝灭，实现了识别检测GSH的目的。推测应机理如图 5所示。

  图 5

  

  图 5.  探针MNQ与GSH的结合机理

  Figure 5.  Binding mechanism of probe MNQ and GSH

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  3.   结 论

  设计合成了一种新型含喹啉酮荧光探针MNQ，研究了MNQ对硫醇小分子的荧光识别性能。结果发现相比于其它14种氨基酸，荧光探针MNQ对GSH具有高选择性，检测限为2.99×10^-8 mol/L，检测迅速，抗干扰能力强，达到了预期研究的目的，MNQ有望作为识别检测GSH的荧光猝灭型探针。

  
  
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  Figure 1  Synthetic route of target product MNQ

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  图 1  探针MNQ添加不同氨基酸的荧光光谱(A)；探针MNQ添加1倍化学计量GSH的UV-Vis谱图(B)

  Figure 1  Fluorescence spectra for probe MNQ with addition of different amino acids(A); UV-Vis spectra of probe MNQ with 1 stoichiometry of GSH(B)

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  图 2  探针MNQ添加0~2.2倍化学计量GSH的荧光滴定曲线(A)；探针MNQ溶液中加入GSH的线性关系(B)

  Figure 2  Fluorescence titration curves of probe MNQwith addition of GSH from 0 to 2.2 stoichiometry(A) and the linear relation of adding GSH into probe MNQ(B)

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  图 3  探针MNQ与不同种氨基酸同时存在时与GSH结合的荧光强度柱状图

  Figure 3  Histogram of the fluorescence intensity of the probe MNQ combined with GSH in the presence of different amino acids

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  图 4  MNQ荧光光谱对GSH的时间响应

  Figure 4  Effect of time on the fluorescence response of probe MNQ to GSH

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  图 5  探针MNQ与GSH的结合机理

  Figure 5  Binding mechanism of probe MNQ and GSH

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