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• 过氧化氢(H₂O₂)是一种氧化剂，广泛应用在食品、制药、工业和环境领域^[1]。是哺乳动物细胞中许多信号通路的关键中间体^[2-3]，在人体内它被证明是氧化代谢过程的副产品。葡萄糖是人类生命必需的营养素之一，健康人的血糖水平在一天内保持在窄范围内(4.0~8.0 mmol/L)^[4]。大多数葡萄糖等生物检测原理是基于酶催化产生H₂O₂的氧化或还原^[5-7]进行的。到目前为止，已经开发了多种技术灵敏和准确地测定H₂O₂方法，如光谱测定^[8-11]、化学发光测定^[12]、荧光测定^[13]、液相色谱^[14]和电化学^[15-16]等。在这些方法中，基于过氧化物酶(Peroxidase，POD)催化的吸光度改变方法测定H₂O₂，由于具有反应快和低成本的特性而被广泛应用。POD虽然特异性和灵敏度较高，但是天然酶的蛋白质性质在一定范围内应限制它的应用^[17]。

  近年模拟酶的应用已经引起广泛关注，与天然酶相比，模拟酶具有低成本，易于储存的高稳定性优点，在化学检测、免疫测定开发、癌症诊断和治疗以及环境保护方面具有巨大发展空间^[18]。

  过氧化物酶模拟酶主要是以含金属卟啉结构的过氧化物酶模拟酶和纳米材料模拟酶为主。血红素是由原卟啉和铁离子所形成的配合物，它由Fe²⁺离子与原卟啉组成，可进行一系列的氧化还原反应^[19]。因此，作为模拟酶血红素和卟啉结构的化合物得到了广泛的研究^[20-22]。黄应平等^[20]通过实验证明，血红蛋白对H₂O₂-4-氨基安替吡啉(4-AAP)-氯代苯酚显色体系的催化反应，H₂O₂具有高的较灵敏度，具有过氧化物模拟酶的功能。在H₂O₂浓度为1.12×10^-5 mmol/L时的重复性为2.1%。与葡萄糖氧化酶偶联成催化体系，可测定人血清中葡萄糖的含量，其线性范围为5.44~11.0 mmol/L，回收率为98%~106%。

  席永清等^[21]采用血红蛋白作为模拟酶，以L-酪氨酸(L-Tyr)作为荧光底物，组成葡萄糖氧化酶组成偶联催化反应体系试剂，建立了一种新的测定果蔬中葡萄糖浓度的方法。H₂O₂浓度在6.3×10^-5~3.1×10^-1 mmol/L范围线性良好，对浓度为3.16×10^-3 mmol/L H₂O₂进行平行测定，精密度(n=9)3.83%。陈秋影等^[22]利用四磺基铁酞菁(FeTSPc)催化H₂O₂与L-Tyr的反应，建立了酶动力学测定H₂O₂和葡萄糖的方法。其回收率为94%~104.2%。平行测定的日内CV%为4.7%和5.0%。

  Gao等首次^[23]报道了具有类似于过氧化物酶活性的Fe₃O₄磁纳米颗粒(Fe₃O₄ Magnetic Nano particles；Fe₃O₄ MNPs)，在H₂O₂的存在下催化底物3, 3, 5, 5-四甲基联苯胺(TMB)显色，在652 nm具有最大吸收。证明Fe₃O₄ MNPs催化过氧化物酶底物，产生与辣根过氧化酶(HRP)相同的颜色变化，Fe₃O₄ MNPs的过氧化物酶样活性也具有H₂O₂、pH和温度依赖性，Fe₃O₄ MNPs催化显示典型的米氏动力学，与催化乒乓机制一致。Zhang等^[24]报道了普鲁士蓝纳米粒子(Prussian Blue Nanoparticles，PB NPs)可催化H₂O₂，使过氧化物酶底物2, 2′-叠氮双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)在420 nm产生吸收峰。PB NPs呈现典型的米氏动力学和表现出较高的催化效率。用PB NPs作为过氧化物酶模拟物，比色法测定H₂O₂的线性范围为0.05~50.0 μmol/L，检测限0.031 μmol/L。实现了葡萄糖检测的灵敏比色。葡萄糖的检测限为0.03 μmol/L，线性范围为0.1~50 μmol/L。与葡萄糖的其它过氧化物酶模拟物相比，PB NPS测定H₂O₂具有10~100倍的灵敏度。其它的一些纳米材料，包括金纳米粒子^[25]、磁性铁酸钴纳米颗粒^[26]、氧化铜纳米粒子^[27]、V₂O₅纳米颗粒^[28]和Rh纳米材料^[29]等已发现具有过氧化物酶样活性。作为过氧化物酶模拟物，纳米材料与POD相比具有成本低、稳定性高和易于制备的特点，在医药、食品和环境等领域有许多潜在的应用价值^[30]。

  吉林大学生命学院利用血红素和卟啉结构的模拟酶原理，采用固相合成法，产物通过C₁₈反相高效液相色谱(HPLC)纯化，设计了一种含有亚血红素和组氨酸的DhHP-6的六肽衍生物，命名为次血红素六肽(Deuterohemin-AlaHisThrValGluLys，DhHP-6)^[31-32]，其结构式如Scheme 1所示。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  The chemical structure of DhHP-6

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  DhHP-6具有分子结构稳定、相对分子质量小、可模拟过氧化物酶催化的特性。DhHP-6合成后，被应用于抗氧化损伤的研究。王丽萍等^[31]将DhHP-6模拟过氧化氢酶的催化特性应用于抗白内障药物的研究。郭常闰等^[33]研究了DhHP-6对纳米金诱导线虫热激损伤的保护作用，彭燕等^[34]研究了DhHP-6保护心肌线粒体抗氧化损伤作用。侯玥等^[35]研究了DhHP-6替代过氧化物酶在葡萄糖检测中的应用，使用N-乙基-N-(2-羟基-3-磺酸基丙基)-3, 5-二甲氧基苯胺(DAOS)和4-氨基安替比林(4-AAP)进行显色反应，H₂O₂的线性范围为0.69~22.0 mmol/L；葡萄糖测定的线性范围为0.35~22.0 mmol/L。测定血样中葡萄糖浓度，重复性：CV=2.6%(n=20)；稳定性：3 h内，浓度CV≤5.0%。

  本文在前期工作基础上^[35]，利用DhHP-6的过氧化物酶样活性催化H₂O₂的原理，选择4-AAP-氯代苯酚显色体系替代4-AAP-DAOS体系检测H₂O₂。该体系与4-AAP-DAOS体系相比具有线性范围宽、显色稳定、易于储存、便于自动分析仪使用和规模化产生等特点DhHP-6的过氧化物酶样活性催化H₂O₂氧化4-AAP-氯代苯酚显色体系，为食品安全、监控环境质量以及有机过氧化物的分析打下基础。

  1.   实验部分

  1.1   试剂和仪器

  所用试剂均为分析纯。4-氨基安替吡啉(4-Aminoantipyrine，4-AAP)天津市化学试剂研究所; 氯代苯酚和葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，GOx，E.C.1.1.3.4)美国Sigma公司; 葡萄糖和30%H₂O₂北京化工厂；葡萄糖检测商品试剂盒长春汇力生物技术有限公司；过氧化物酶(Peroxidase，POD，E.C.1.11.1.7，辣根)购自日本TOYOBO公司；DhHP-6由吉林大学生命科学院提供(相对分子质量为1228.48，等电点为7.2；易溶于水，溶解度为0.05 g/mL，溶液呈棕红色，透明；催化以下反应：2H₂O₂→O₂+2H₂O^[32-33]；UV-2550型紫外-可见分光光度计(UV-Vis)购自日本岛津公司。

  1.2   H₂O₂测试实验

  1.2.1   DhHP-6试剂

  在pH=7.7的300 mmol/L磷酸盐缓冲液中(每升溶液中NaH₂PO₄·2H₂O 4.914 g，Na₂HPO₄·2H₂O 47.79 g)，加入氯代苯酚12 mmol/L、4-AAP 0.5 mmol/L和DhHP-6 10 μmol/L，溶解后2~8 ℃保存备用。

  1.2.2   过氧化物酶(POD)试剂

  在pH=7.7的300 mmol/L磷酸盐缓冲液中，分别加入POD 3000 U/L，4-AAP 0.5 mmol/L，氯代苯酚12 mmol/L，溶解后2~8 ℃保存备用。

  1.2.3   H₂O₂标准液

  将30%H₂O₂稀释成浓度为25、18.75、12.5、9.38、6.25、3.15、1.625、0.875和0.39 mmol/L。2~8 ℃保存备用。

  1.2.4   检测方法

  分别取DhHP-6和POD试剂3000 μL，加入不同浓度H₂O₂溶液300 μL。在505 nm处进行UV-Vis光谱测定，记录反应3 min内吸光度值的变化。测定记录仅含有底物溶液的空白反应吸光度值。研究DhHP-6在pH值3.0~12.0的催化活性、DhHP-6最佳浓度、米氏常数(K_m)、精密度、准确度、线性和相关性。所有测定均在25 ℃下进行分析。

  1.3   葡萄糖测试实验

  1.3.1   DhHP-6检测葡萄糖试剂

  在pH=7.7的300 mmol/L磷酸盐缓冲液中，分别加入氯代苯酚12 mmol/L，4-AAP 0.5 mmol/L，DhHP-6 10 μmol/L，葡萄糖氧化酶3000 U/L，溶解后2~8 ℃保存备用。

  1.3.2   检测方法

  首先，取36例校医院教工体检血液进行葡萄糖检测，将血液样品以4000 r/min离心5 min，分离血清后使用。分别取葡萄糖检测商品试剂盒试剂和DhHP-6检测葡萄糖试剂各3000 μL、加入血清样本30 μL。在505 nm处进行UV-Vis光谱测定，记录5 min吸光度变化值(ΔA₁)，与葡萄糖标准溶液(5.55 mmol/L)吸光度变化值(ΔA₂)比较，计算葡萄糖浓度(mmol/L出)。研究DhHP-6检测葡萄糖试剂与葡萄糖检测商品试剂盒之间的线性和相关性。所有测定均在37 ℃下进行分析。选3种浓度的血液标本添加已知浓度的葡萄糖进行加标检测，用于表征该测试方法的稳定性和重现性。

  1.4   统计分析

  采用SPSS 19.0统计软件对葡萄糖检测两方法之间采用配对T检验进行统计，P＜0.05为差异有统计学意义。

  2.   结果及讨论

  2.1   测试原理

  DhHP-6催化H₂O₂产生氧自由基(O^-)，导致4-AAP-氯代苯酚体系氧化后显红色，颜色在一定范围内与H₂O₂浓度呈现线性关系，如反应式(1)所示。

  $ 2{{\text{H}}_2}{{\text{O}}_2} + 4-{\text{AAP}}-{\text{chlorophenol}}\xrightarrow{{{\text{DhHP}}-6}}4{{\text{H}}_2}{\text{O}} + {\text{quinoneimine}}\left( {{\text{red}}} \right) $

  (1)

  在图 1的光谱显示中可以看出，在H₂O₂或DhHP-6单独存在下的底物溶液没有显示强吸收，而当将H₂O₂和DhHP-6添加到系统中时，DhHP-6催化H₂O₂-4-AAP-氯代苯酚体系产物的最大吸收波长在505 nm处，与POD催化相同体系的一致，证明DhHP-6具有POD的催化特性，能够作为模拟酶催化H₂O₂使底物显色。

  图 1

  

  图 1.  DhHP-6和H₂O₂(a)、DhHP-6(b)和H₂O₂(c)在4-AAP-氯代苯酚体系UV-Vis光谱

  Figure 1.  UV-Vis spectra of DhHP-6 and H₂O₂ mixture(a), DhHP-6(b) and H₂O₂(c) in 4-AAP-chlorophenol system

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  2.2   pH值的影响

  如图 2所示，研究了pH值(pH 3.0~12.0)对于POD和DhHP-6催化的影响。在强酸条件下，POD和DhHP-6均无催化活性；最适pH值在5.0~9.0范围；虽然在碱性下活性均有不同程度下降，但POD在pH=11.0条件下无活性，而DhHP-6仍有一定活性。当pH值为7~8时，DhHP-6与4-AAP-氯代苯酚的OD_{505 nm}达到最大值。DhHP-6与4-AAP-氯代苯酚的反应的最佳pH值与文献^[10]中报道的值一致。因此，选择pH=7.7用于H₂O₂和葡萄糖检测。

  图 2

  

  图 2.  pH值对POD和DhHP-6催化反应影响

  Figure 2.  Effects of pH on catalytical behaviors of POD and DhHP-6

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  2.3   DhHP-6浓度的筛选

  如图 3所示，将DhHP-6稀释为12.5、6.25、3.125和1.65 μmol/L，在反应系统中H₂O₂为22 mmol/L时的OD_{505 nm}值(光密度)随DhHP-6模拟酶的浓度逐渐增加。当浓度为6.25 μmol/L时，较适合分光光度计的检测范围。

  图 3

  

  图 3.  DhHP-6浓度对催化反应的影响

  Figure 3.  Screening of DhHP-6 concentrations

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  2.4   DhHP-6对H₂O₂的K_m和v_max

  H₂O₂浓度在一定范围内，获得DhHP-6和POD的典型的Michaelis-Menten曲线(图 4)。使用Lineweaver-Burk图得到K_m和最大反应速率(v_max)。DhHP-6和POD的动力学参数见表 1。DhHP-6与POD的K_m和v_max分别为0.171 mmol/L和0.112 mmol/s，均对底物H₂O₂具有较强的亲和能力，但POD和DhHP-6的v_max分别为7.56×10^-6 mol/s和4.22×10^-6 mol/s，显示出在中性条件下POD比DhHP-6具有更快的反应速度。

  图 4

  

  图 4.  DhHP-6和POD在不同H₂O₂浓度下Lineweaver-Burk双倒数图

  Figure 4.  Double-reciprocal Lineweaver-Burk plots of DhHP-6 and POD with different H₂O₂ concentrations

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  表 1

  

  表 1  DhHP-6和POD的动力学参数K_m和v_max

  Table 1.  Kinetic parameters K_m and v_max of DhHP-6 and POD

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  Enzyme	Substrate	Km/(mmol·L-1)	vmax/(mol·s-1)
  DhHP-6	H2O2	0.171	4.22× 10-6
  POD	H2O2	0.112	7.56 × 10-6

  2.5   H₂O₂标准曲线及方法的精密度、准确度

  在优化的反应条件下，检测DhHP-6方法的灵敏度并绘制H₂O₂的标准曲线(图 5)。结果显示，在37 ℃下3 min时测定505 nm处有最大吸光度值，H₂O₂测定的线性回归方程：Y=0.081X+0.007, 相关系数R²=0.999；线性范围为0.39~25.0 mmol/L；5次平行测定样品的相对标准偏差为(CV)在1.29%~2.16%之间；高、中、低3水平的加标回收率在94.5%~101.1%之间。

  图 5

  

  图 5.  DhHP-6测定H₂O₂的浓度与吸光度标准曲线

  Figure 5.  Standard curve of H₂O₂ concentration and absorption under DhHP-6

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  表 2

  

  表 2  DhHP-6测定H₂O₂含量的准确度(n=10)

  Table 2.  Accuracy of DhHP-6 for determination of H₂O₂ content(n=10)

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  Amount of H2O2 added/(mmol·L-1)	Background value/(mmol·L-1)	Measured value/(mmol·L-1)	CV/%	Recovery rate/%
  5.5	2.75	8.31	2.16	101.1
  5.5	5.50	10.8	1.54	96.4
  5.5	11.0	16.2	1.29	94.5

  2.6   DhHP-6测定葡萄糖

  使用DhHP-6试剂方法，将36例血液样品与葡萄糖检测商品试剂盒进行比较(图 6，相关系数R²=0.9946)。根据计算，血液样品中的葡萄糖浓度在4.26~17.48 mmol/L之间。两组数据经配对t检验统计，P＞0.05，无显著差异。表明该比色法适用于实际血液样品中葡萄糖浓度测定。

  图 6

  

  图 6.  DhHP-6测定和葡萄糖试剂盒检测血液样本的比对

  Figure 6.  Comparison of blood samples with DhHP-6 reagent and glucose assay kit

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  葡萄糖浓度-吸光度曲线和相关系数如图 7所示。选取4.26、5.11和7.68 mmol/L这3种浓度的血液标本添加5.5 mmol/L的葡萄糖进行检测，表征该测试方法的稳定性和重现性(见表 3)。

  图 7

  

  图 7.  葡萄糖浓度与吸收曲线

  Figure 7.  Glucose concentration and absorbance curve

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  表 3

  

  表 3  DhHP-6测定葡萄糖含量的准确度(n=5)

  Table 3.  Accuracy of DhHP-6 for determination of glucose content(n=5)

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  Amount of glucose added/(mmol·L-1)	Background value/(mmol·L-1)	Measured value/(mmol·L-1)	Recovery rate/%
  5.5	4.26	10.1	103.5
  5.5	5.11	10.3	97.1
  5.5	7.68	12.9	97.7

  测定结果显示，线性回归方程：Y=0.066X+0.076, 相关系数R²=0.9894；5次平行测定高、中、低3水平的加标回收率在97.1%~103.5%之间，证明该方法具有较好的稳定性和重现性。

  3.   结论

  利用DhHP-6具有过氧化物酶功能的原理，制备了H₂O₂检测试剂，建立一种对液体样品中H₂O₂和葡萄糖进行定量测定的比色检测方法。该方法精密度、准确度、线性范围及回收率较好，操作简便快速，可广泛应用于对液体样品中H₂O₂量进行监测的领域。

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  Scheme 1  The chemical structure of DhHP-6

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  图 1  DhHP-6和H₂O₂(a)、DhHP-6(b)和H₂O₂(c)在4-AAP-氯代苯酚体系UV-Vis光谱

  Figure 1  UV-Vis spectra of DhHP-6 and H₂O₂ mixture(a), DhHP-6(b) and H₂O₂(c) in 4-AAP-chlorophenol system

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  图 2  pH值对POD和DhHP-6催化反应影响

  Figure 2  Effects of pH on catalytical behaviors of POD and DhHP-6

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  图 3  DhHP-6浓度对催化反应的影响

  Figure 3  Screening of DhHP-6 concentrations

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  图 4  DhHP-6和POD在不同H₂O₂浓度下Lineweaver-Burk双倒数图

  Figure 4  Double-reciprocal Lineweaver-Burk plots of DhHP-6 and POD with different H₂O₂ concentrations

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  图 5  DhHP-6测定H₂O₂的浓度与吸光度标准曲线

  Figure 5  Standard curve of H₂O₂ concentration and absorption under DhHP-6

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  图 6  DhHP-6测定和葡萄糖试剂盒检测血液样本的比对

  Figure 6  Comparison of blood samples with DhHP-6 reagent and glucose assay kit

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  图 7  葡萄糖浓度与吸收曲线

  Figure 7  Glucose concentration and absorbance curve

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  表 1  DhHP-6和POD的动力学参数K_m和v_max

  Table 1.  Kinetic parameters K_m and v_max of DhHP-6 and POD

  Enzyme	Substrate	Km/(mmol·L-1)	vmax/(mol·s-1)
  DhHP-6	H2O2	0.171	4.22× 10-6
  POD	H2O2	0.112	7.56 × 10-6

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  表 2  DhHP-6测定H₂O₂含量的准确度(n=10)

  Table 2.  Accuracy of DhHP-6 for determination of H₂O₂ content(n=10)

  Amount of H2O2 added/(mmol·L-1)	Background value/(mmol·L-1)	Measured value/(mmol·L-1)	CV/%	Recovery rate/%
  5.5	2.75	8.31	2.16	101.1
  5.5	5.50	10.8	1.54	96.4
  5.5	11.0	16.2	1.29	94.5

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  表 3  DhHP-6测定葡萄糖含量的准确度(n=5)

  Table 3.  Accuracy of DhHP-6 for determination of glucose content(n=5)

  Amount of glucose added/(mmol·L-1)	Background value/(mmol·L-1)	Measured value/(mmol·L-1)	Recovery rate/%
  5.5	4.26	10.1	103.5
  5.5	5.11	10.3	97.1
  5.5	7.68	12.9	97.7

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