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• 人体自身具有调节体液酸碱平衡的能力，只有当机体pH值稳定在一定范围内时，各器官组织才能正常地进行生命活动和新陈代谢，当机体pH超出正常范围时，则预示可能存在对应的病变。例如，Jawed M等^[1-2]使用数字pH计，汪双喜等^[3]采用广泛pH试纸分别测定了糖尿病患者、儿童等龋齿病高危群体唾液样品的pH，发现唾液pH与龋齿病之间呈负相关，与对照组比较，大约减小0.43~1.19个pH单位；Schmid-Wendtner M H等^[4-7]采用专用皮肤酸碱度测定仪或平板型pH玻璃电极测定了皮炎患者皮表汗液的pH值，发现皮炎，特应性湿疹，鱼鳞病和白色念珠菌感染等疾病患者的皮肤表面pH值比正常人分别高0.8~2.9个pH单位，使用一些皮炎类药物后可以使皮肤表面pH回到正常范围。这些研究表明：可以通过相关体液酸度的测定协助研究一些疾病的发生与治疗的机制。而不同疾病病态与正常态的pH差异大小不一，这就表明医学酸度测定需要精密酸度传感器。目前，用于测定体表微液酸度的商品化酸度计有以球状pH复合电极、平板pH玻璃电极为传感器的电势型仪器和电流型仪器，也有用广泛pH试纸进行研究的报道。然而由于pH玻璃电极的面积和体积相对于体表液体均过大，需要以某种化学或物理手段刺激体表以获取足量的体液，例如以维生素C片刺激舌尖味蕾^[3]，显然这种操作可能使测定结果与自主分泌物的pH产生差异，而精密pH试纸的精密度难以满足上述疾病诊断中微小pH变化的需求，因此有必要发展微型pH传感器。近年来，Liu等^[8-9]采用电化学方法将PdO、IrO₂等氧化物沉积在Pd丝、Pt丝等微型基体电极表面、Zhang等^[10]将聚苯胺电沉积在碳纤维表面制成微型pH传感器，以金属氧化物^[11-15]、醌类化合物^[16]以及聚合物^[17-18]作为酸度敏感物制成的常规面积全固态pH电化学传感器的研究则更多。然而，可以实现对人体微区体液有效酸度实时在体测定的无毒无害微型pH传感器却鲜有报道。

  木犀草素(Luteolin，Lu)是一种天然黄酮类化合物(结构如图 1所示)，广泛分布于植物中，具有抗炎、抗过敏、抗癌、减轻炎症^[19-20]等多种药理活性，已经作为中成药使用。木犀草素具有良好的氧化还原活性^[21]，水溶性极低，相对于其他酸度敏感试剂具有无毒无害的特性，提取工艺成熟，高纯度商品化试剂足以支撑其在传感器制作中的工业需求。因此，我们设想将Lu作为对酸度有识别作用的敏感试剂，固定在微型基体电极上，制成固态微型酸度传感器。市售常规甘汞电极或Ag-AgCl参比电极很难满足微体积液体的检测需求，因此我们将本实验室开发的凝胶型全固态Ag-AgCl参比电极^[22]微型化，然后与微型酸度传感器及微型铂丝电极组合成微电极组，将微电极组应用于微量体液酸度的测定，取得了一些有价值的结果。

  图 1

  

  图 1.  木犀草素结构式

  Figure 1.  Structural of luteolin

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  1.   实验部分

  1.1   仪器和试剂

  LK2005A微机电化学分析系统(天津市兰力科化学电子高技术有限公司)；以自制木犀草素碳纤维酸度微电极(Lu/CFME)为工作电极，自制全固态微型Ag/AgCl为参比电极，Pt丝为对极；pHS-3C型数字酸度计(上海雷磁仪器厂)，KQ-250B型超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

  木犀草素(纯度98%，西安天本生物工程有限公司)；pH值在2.00~10.00的系列磷酸盐缓冲溶液(PBS)，由浓度均为0.2 mol/L的H₃PO₄、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、Na₃PO₄在酸度计监控下混合而成；碳纤维(Φ 7 μm)，光谱纯石墨粉。除标明外其他化学试剂均为分析纯。实验用水为石英亚沸二次重蒸水。

  1.2   木犀草素碳纤维酸度微电极的制备

  将碳纤维依次置于0.1 mol/L NaOH和水中浸泡15 min，去油清洗，再依次在无水乙醇和蒸馏水中进行超声清洗，晾干备用。取一个100 μL移液器吸头作为电极杆，在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗10 min，晾干待用。在显微镜下，用小镊子将预处理后的碳纤维分成单根，取10根，捏在一起，插入前述吸头中，直至在尖嘴处露出碳纤维，将吸头尖嘴加热软化，用钳子迅速夹紧使吸头尖嘴完全封闭，用刀片将尖嘴处的碳纤维切断，向吸头中灌注导电胶封固碳纤维，插入铜丝作为导线，此为碳纤维基体电极。将Lu、石墨粉、固体石蜡粉末按质量比1:3.1的比例混合均匀，加热使石蜡熔融并使混合物成糊状，趁热将糊状物涂抹在碳纤维基体电极表面，压实，轻轻打磨至平滑。此为Lu/CFME。

  1.3   样液有效酸度测定

  用洁净玻璃载片刮取受试者唾液或汗液，将微电极组的三电极头插入唾液或汗液的微滴里，以-0.2 V为起点电势，在-0.2~1.0 V电势范围内进行方波伏安法扫描，记录氧化峰的峰电势，据此计算样液的pH。

  2.   结果与讨论

  2.1   全固态酸度微电极组对溶液有效酸度的响应

  以自制Lu/CFME为工作电极，另用100 μA移液器吸头作为电极杆，按文献[22]制备固态微型Ag/AgCl参比电极，与Pt丝微电极组成三电极体系，按实验方法测定pH值在2.00~10.00 PBS的循环伏安曲线并读取氧化峰峰电势，结果如图 2所示。在各溶液的循环伏安曲线上，均出现一对氧化还原峰，两峰电势差在60~64 mV范围内，表现出可逆氧化还原特性。用空白碳纤维基体电极代替修饰电极进行实验，无任何氧化还原峰，说明峰电流来源于修饰电极上木犀草素的电化学行为。实验还发现：氧化峰和还原峰的峰电势均随溶液pH值的增大而负移，因此期待根据峰电势与pH的关系作为酸度测定的依据。

  图 2

  

  图 2.  微电极组在PBS中的循环伏安曲线

  Figure 2.  Cyclic voltammetry curve of the microelectrode set in PBS (pH 2.00~10.00)

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  观察发现，循环伏安曲线上氧化峰与还原峰的峰电流为nA级别，说明电极面积远远小于常规面积的圆盘电极。采用计时电量法测定了电极的有效面积，测定方法如下：不加木犀草素制作碳糊并将该碳糊接着在空白碳纤维电极上，以此作为工作电极，参比电极与对极不变，插入含有1.00×10^-3 mol/L K₃Fe(CN)₆的1.0 mol/L KNO₃溶液中，设定阶跃电势为0.60 V到-0.40 V，记录0~100 s范围的t~Q关系曲线，结果如图 3所示。根据计时电量法基本理论，Q与t^1/2应符合如下关系式^[23]:

  图 3

  

  图 3.  计时电量法关系曲线以及对应的t^1/2~Q关系曲线(内插图)

  Figure 3.  Curve of chronocoulometry and t^1/2~Q(inset)

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  $ Q=\frac{2 n F A D^{1 / 2} c t^{1 / 2}}{\pi^{1 / 2}} $

  (1)

  式中，n为转移电子数，F为法拉第常数(C/mol)，A为电极面积(cm²)，D为发生电极反应物质的扩散系数(cm²/s)，c为该物质的浓度(mol/mL)，t为扫描时间(s)。式(1)表明，t^1/2与Q应呈线性关系，斜率为2nFAD^1/2c/π^1/2，当n、F、D、c已知时，可以根据斜率实验值求出电极面积A。已知在1 mol/L KNO₃支持电解质溶液中，1.0×10^-3 mol/L(即1.0×10^-6 mol/mL)的K₃Fe(CN)₆的扩散系数D为7.60×10^-6 cm²/s^[23]。依据t~Q实验数据，对t^1/2~Q进行线性回归，得到的线性方程为Q(C)=1.62×10^-8t^1/2+2.30×10^-9(r=0.9997)，由此求得A=5.4×10^-5 cm²，相当于半径为r=0.004 cm(即直径80 μm)的平板圆盘电极，因此本电极属于微电极的尺寸。

  2.2   酸度测定方法的建立

  考虑到方波伏安法的灵敏度更高，半峰宽更窄，探讨了依据方波伏安法建立酸度测定方法的可能性。图 4A为电极组在pH值2.00~10.00 PBS中的方波氧化波曲线，与循环伏安法相比，峰电流约增大34倍，半峰宽更窄，因此，方波伏安法能有效提高酸度测定的准确度。由图 4B可知：氧化峰电势仍然与pH呈线性关系，线性方程为E_pa(V)=-0.0567pH+0.603(r=0.999)。

  图 4

  

  图 4.  溶液pH对方波伏安曲线(A)以及峰电位(B)的影响

  Figure 4.  Effect of pH on square wave voltammetry curve(A) and peak potential of oxidation peak(B)

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  2.3   准确度、精密度、重现性、稳定性及中期重现性

  按实验方法分别测定了pH值为4.00、6.86和9.18的市售标准缓冲溶液的氧化峰电势(E_pa)，将得到的电势值代入线性方程中，计算被测液pH，每份溶液平行测定5次，实验结果(表 1)表明，3份溶液测定结果平均值的相对误差(E_r)处于-1.5%~-0.8%之间，表明本方法能基本满足体液检测对准确度的要求；相对标准偏差(RSD)为0.4%~0.5%，表明方法精密度良好。另外，在这3种标准缓冲溶液中，分别含有邻苯二甲酸氢钾、磷酸根和四苯酸钠等成分，因此上述实验结果还预示：上述共存阴离子以及Na⁺、K⁺对酸度测定均不产生干扰。

  表 1

  

  表 1  样液测定结果与误差分析

  Table 1.  Determination results of samples and error analysis

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  Sample	Determination results(n=5)	Average values(n=5)	Er/%	RSD/%(n=5)
  Potassium hydrogen phthalate(pH=4.00)	3.95, 3.95, 3.95, 3.92, 3.92	3.94	-1.5	0.4
  Mixed phosphate(pH=6.86)	6.77, 6.77, 6.81, 6.84, 6.84	6.81	-0.8	0.5
  Sodium tebraborate(pH=9.18)	9.06, 9.03, 8.99, 9.09, 9.09	9.05	-1.4	0.4
  Saliva	6.17, 6.17, 6.15, 6.24, 6.20	6.19	-	0.6
  Sweet	6.07, 6.03, 6.03, 6.00, 5.97	6.02	-	0.7

  同法制备5组组合电极，分别测定pH=2.00的PBS，E_pa的RSD为1.7%，表明该电极组的重现性良好。对pH=2.00的PBS连续扫描50圈(图 5)，发现峰电势和峰电流均无明显变化，表明此电极组稳定性良好。

  图 5

  

  图 5.  连续扫描50圈的循环伏安曲线

  Figure 5.  Cyclic voltammetry curve for 50 consecutive scans

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  选用同一组电极，以pH=2.00的PBS为样液，按照实验方法每天测定1次，连续测定30 d，测定结果(图 6)显示，30 d测定结果的E_r处于-2.5%~-8.4%之间，平均值的E_r为-4.5%，RSD为1.6%。表明该测试装置的中期重现性基本满足体液测定准确度与精密度的要求。

  图 6

  

  图 6.  30天重现性实验结果

  Figure 6.  The results of repeatability for 30 days

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  2.4   全固态酸度微电极组的选择性

  2.4.1   常见离子对pH=7.00的PBS酸度测定的影响

  考虑到本方法将应用于唾液与汗液的酸度测定，因此选择pH=7.00的PBS作为基准溶液(1#)。在pH=7.00的PBS中分别加入高浓度、小体积的Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Cl^-、NO₃^-、柠檬酸钠、抗坏血酸、醋酸钠、草酸钠和脲酸，使共存组分的浓度为1.00×10^-3mol/L，然后按实验方法测定E_pa并计算溶液酸度，结果(图 7)表明：在允许存在±5%相对误差前提下，上述成分均不产生干扰。

  图 7

  

  图 7.  干扰实验结果

  Figure 7.  The results of interference experiment

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  2.4.2   表面活性剂的影响

  考虑到人体体液中含有蛋白质、酶等大分子成分，因此选择中性表面活性剂聚乙烯醇代替这些高分子，将其加入到pH=7.00的PBS中，使之浓度达到1.5%，按实验方法测定，结果表明，相对于Lu在纯PBS溶液中的电化学行为，仅峰电流有所减小，但E_pa基本不变。说明蛋白质等大分子不影响本方法对于体液酸度的测定。

  2.5   全固态酸度微电极组在唾液与汗液酸度测定中的应用

  测定唾液时，用洁净干燥的玻片取唾液形成直径约为5 mm自然展开的液珠，将三电极按图 8方法插入液珠中，按实验方法立即测定；测定汗液时，用洗洁精清洗胳膊以除去皮肤表面污渍，擦干，用保鲜膜包裹清洗处约20 min直至出现明显汗渍，然后再用玻片取样并测定。每种试样均进行了5次平行测定，结果列于表 1。唾液的平均值为6.19，相对标准偏差为0.6%；汗液的平均值为6.02，相对标准偏差0.7%。上述测定结果与文献值^{[1, 5]}基本一致，说明测定结果可靠。

  图 8

  

  图 8.  全固态酸度微电极组装置图

  Figure 8.  Set-up of all solid state acidity microelectrode set

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  3.   结论

  本文以碳纤维为基体电极，木犀草素为酸度敏感试剂，制成全固态酸度微电极，与自制固态微型Ag/AgCl参比电极以及pt丝微对极组合成微电极组，采用方波伏安法实现了微量人体体液有效酸度的测定。期待在制造技术上完成三极组合后将这一研究结果应用于人体体液微量有效酸度的在线、实时监测，在相关疾病诊断中发挥作用。

• 1. [1]

     Jawed M, Khan R N, Shahid S M. Protective Effects of Salivary Factors in Dental Caries in Diabetic Patients of Pakistan[J]. J Diabetes Res, 2012, (1):  1-5.

  2. [2]

     Pradhan D, Jain D, Gulati A. Effect of the Presence of Dental Plaque on Oral Sugar Clearance and Salivary pH:An in vivo Study[J]. J Contemp Dent Pract, 2012, 13(6):  753-755.

  3. [3]

     汪双喜, 张辉. 分析探讨唾液pH值及个人生活行为习惯对患龋的影响[J]. 中外医疗, 2014,25,41-42. WANG Shuangxi, ZHANG Hui. Analysis and Investigation of the Influence of Salivary pH and Personal Living Habits on Caries[J]. China Foreign Med Treat, 2014, 25:  41-42.

  4. [4]

     Schmid-Wendtner M H, Korting H C. The pH of the Skin Surface and Its Impact on the Barrier Function[J]. Skin Pharmacol Physiol, 2006, 19(6):  296-302. doi: 10.1159/000094670

  5. [5]

     马慧军, 朱文元. 皮肤表面酸碱度及其测定方法[J]. 临床皮肤科杂志, 2004,33,(7): 448-450. doi: 10.3969/j.issn.1000-4963.2004.07.038MA Huijun, ZHU Wenyuan. Skin Surface pH and Its Measurement[J]. J Clin Dermatovenereol, 2004, 33(7):  448-450. doi: 10.3969/j.issn.1000-4963.2004.07.038

  6. [6]

     Mackiewiczwysocka M, Araszkiewicz A, Niedzwiedzki P. Skin pH is Lower in Type 1 Diabetes Subjects and is Related to Glycemic Control of the Disease[J]. Diabetes Technol Ther, 2015, 17(1):  16-20. doi: 10.1089/dia.2014.0008

  7. [7]

     蔄茂强, 辛淑君, PeterM Elias. 皮肤表面pH值及其临床意义[J]. 中国皮肤性病学杂志, 2007,21,(8): 503-505. doi: 10.3969/j.issn.1001-7089.2007.08.026MAN Maoqiang, XIN Shujun, Peter M E. Skin Surface pH and Its Clinical Implication[J]. Chinese J Dermatol, 2007, 21(8):  503-505. doi: 10.3969/j.issn.1001-7089.2007.08.026

  8. [8]

     Liu C C, Bocchicchio D B, Overmyer P A. A Palladium-Palladium Oxide Miniature pH Electrode[J]. Science, 1980, 207(4427):  188-189. doi: 10.1126/science.7350653

  9. [9]

     徐小娟, 刘鲁川, 袁若. 微型pH电极的制备及其在牙菌斑pH检测中的应用[J]. 口腔医学, 2006,26,(4): 290-292. doi: 10.3969/j.issn.1003-9872.2006.04.017XU Xiaojuan, LIU Luchuan, YUAN Ruo. Preparation of pH Microelectrode and Its Application in Plaque pH Measurement[J]. Stomatology, 2006, 26(4):  290-292. doi: 10.3969/j.issn.1003-9872.2006.04.017

  10. [10]

      Zhang X J, Ogorevc B, Wang J. Solid-State pH Nanoelectrode Based on Polyaniline Thin Film Electrodeposited onto Ion-Beam Etched Carbon Fiber[J]. Anal Chim Acta, 2002, 452(1):  1-10. doi: 10.1016/S0003-2670(01)01435-0

  11. [11]

      Kurzweil P. Metal Oxides and Ion-Exchanging Surfaces as pH Sensors in Liquids: State-of-the-Art and Outlook[J]. Sensors, 2009, 9(6):  4955-4985. doi: 10.3390/s90604955

  12. [12]

      Manjakkal L, Cvejin K, Kulawik J. Fabrication of Thick Film Sensitive RuO₂-TiO₂, and Ag/AgCl/KCl Reference Electrodes and Their Application for pH Measurements[J]. Sens Actuators B, 2014, 204:  57-67. doi: 10.1016/j.snb.2014.07.067

  13. [13]

      Manjakkal L, Djurdjic E, Cvejin K. Electrochemical Impedance Spectroscopic Analysis of RuO₂, Based Thick Film pH Sensors[J]. Electrochim Acta, 2015, 168:  246-255. doi: 10.1016/j.electacta.2015.04.048

  14. [14]

      Manjakkal L, Cvejin K, Bajac B. Microstructural, Impedance Spectroscopic and Potentiometric Analysis of Ta₂O₅ Electrochemical Thick Film pH Sensors[J]. Electroanalysis, 2015, 27(3):  770-781. doi: 10.1002/elan.201400571

  15. [15]

      Manjakkal L, Cvejin K, Kulawik J. Sensing Mechanism of RuO₂-SnO₂, Thick Film pH Sensors Studied by Potentiometric Method and Electrochemical Impedance Spectroscopy[J]. J Electroanal Chem, 2015, 759:  82-90. doi: 10.1016/j.jelechem.2015.10.036

  16. [16]

      Dai C, Chan C W I, Barrow W. A Route to Unbuffered pH Monitoring:A Novel Electrochemical Approach[J]. Electrochim Acta, 2016, 190:  879-886. doi: 10.1016/j.electacta.2016.01.004

  17. [17]

      Braiek M, Barhoumi H, Maaref A. Elaboration and Characterization of pH Sensor Based on Polypyrrole Nanowires[J]. Sens Lett, 2011, 9(6):  2154-2157. doi: 10.1166/sl.2011.1769

  18. [18]

      周爽, 郭煜石, 颜宇. 一种测定高酸度水溶液有效酸度的固态电化学传感器[J]. 分析化学, 2018,46,(1): 81-87. ZHOU Shuang, GUO Yushi, YAN Yu. Study on a High Acidity and Wide Range and All-Solid-State Acidity Electrochemical Sensor[J]. Chinese J Anal Chem, 2018, 46(1):  81-87.

  19. [19]

      Lin Y, Shi R, Wang X. Luteolin, A Flavonoid with Potential for Cancer Prevention and Therapy[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2008, 8(7):  634-646. doi: 10.2174/156800908786241050

  20. [20]

      Jang S, Kelley K W, Johnson R W. Luteolin Reduces IL-6 Production in Microglia by Inhibiting JNK Phosphorylation and Activation of AP-1[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(21):  7534-7539. doi: 10.1073/pnas.0802865105

  21. [21]

      Liu A, Zhang S, Huang L. Electrochemical Oxidation of Luteolin at a Glassy Carbon Electrode and Its Application in Pharmaceutical Analysis[J]. Chem Pharm Bull, 2008, 56(6):  745-748. doi: 10.1248/cpb.56.745

  22. [22]

      尹娜娜, 李明谦, 代鑫. 导电凝胶型Ag/AgCl参比电极的制备及性能[J]. 中国无机与分析化学, 2018,8,(3): 60-65. YIN Nana, LI Mingqian, DAI Xin. Preparation and Property of Electrographic Gel Style All-State-Ag/AgCl Reference Electrode[J]. Chinese J Inorg Anal Chem, 2018, 8(3):  60-65.

  23. [23]

      巴德A J, 福克纳L R.电化学方法原理和应用[M].谷林瑛, 吕鸣祥, 宋诗哲, 等译.第1版.北京: 化学工业出版社, 1986: 232-233.Bard A J, Faulkner L R. Electrochemical Methods Fundamentals and Applications[M]. GU Linying, LV Mingxiang, SONG Shizhe, et al. Trans. 1nd Ed. Trans. Beijing: Chemical Industry Press, 1986: 232-233(in Chinese).

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  图 1  木犀草素结构式

  Figure 1  Structural of luteolin

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  图 2  微电极组在PBS中的循环伏安曲线

  Figure 2  Cyclic voltammetry curve of the microelectrode set in PBS (pH 2.00~10.00)

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  图 3  计时电量法关系曲线以及对应的t^1/2~Q关系曲线(内插图)

  Figure 3  Curve of chronocoulometry and t^1/2~Q(inset)

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  图 4  溶液pH对方波伏安曲线(A)以及峰电位(B)的影响

  Figure 4  Effect of pH on square wave voltammetry curve(A) and peak potential of oxidation peak(B)

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  图 5  连续扫描50圈的循环伏安曲线

  Figure 5  Cyclic voltammetry curve for 50 consecutive scans

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  图 6  30天重现性实验结果

  Figure 6  The results of repeatability for 30 days

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  图 7  干扰实验结果

  Figure 7  The results of interference experiment

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  图 8  全固态酸度微电极组装置图

  Figure 8  Set-up of all solid state acidity microelectrode set

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  表 1  样液测定结果与误差分析

  Table 1.  Determination results of samples and error analysis

  Sample	Determination results(n=5)	Average values(n=5)	Er/%	RSD/%(n=5)
  Potassium hydrogen phthalate(pH=4.00)	3.95, 3.95, 3.95, 3.92, 3.92	3.94	-1.5	0.4
  Mixed phosphate(pH=6.86)	6.77, 6.77, 6.81, 6.84, 6.84	6.81	-0.8	0.5
  Sodium tebraborate(pH=9.18)	9.06, 9.03, 8.99, 9.09, 9.09	9.05	-1.4	0.4
  Saliva	6.17, 6.17, 6.15, 6.24, 6.20	6.19	-	0.6
  Sweet	6.07, 6.03, 6.03, 6.00, 5.97	6.02	-	0.7

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